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Biology

가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면 역학의 실시간 영상

Published: December 12, 2015 doi: 10.3791/53437
Automatic Translation
1
1Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo

Summary

이 프로토콜의 목적은 기공 복합체의 세포 피질에, GFP - 태그 PATROL1, 막 인신 매매 단백질의 점을 점멸 표시 가변 각도 표면 형광 현미경으로 식물 세포 표면에 형광 표지 된 단백질의 역학을 모니터링하는 방법을 설명하는 것입니다 애기 장대.

Protocol

모종의 1. 준비

  1. 씨앗을 소독.
    1. 1 μL 10 % 트리톤 X-100-500 μL 멸균 : 500 μL 차아 염소산 나트륨 (5.0 % 사용할 수 염소)를 추가하여 살균 솔루션을 준비합니다.
    2. 장소의 약 10 형질 전환 A. 1.5 ML 튜브에 GFP - PATROL1 8을 들고 장대 씨.
    3. 1 ml의 70 % 에탄올 용액을 추가, 5 번 반전 잘 섞는다. 1 분 동안 둡니다.
    4. 씨앗은 튜브의 바닥에 가라 관찰한다. 깨끗한 층류 캐비닛 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 70 % 에탄올을 제거하고 1 mL의 멸균 용액을 추가. 다섯 번 반전 잘 혼합하고 5 분 동안 둡니다.
    5. 씨앗을 씻으십시오. 또 클린 벤치에 무균 상태에서 작업, 부드럽게 마이크로 피펫을 사용하여 용액을 제거하고, 1 ml의를 멸균 물을 추가합니다. 이 다섯 번 반복합니다. 살균 된 종자를 2 일 동안 4 ℃에서 멸균에 저장 될 수있다.
  2. 그래서0.5 % 젤란 검 화 1/2 무라 시게과 스쿡 중간 판 (PH 5.8) 9 살균 씨앗 승. 외과 테이프의 두 레이어를 사용하여 접시에 뚜껑을 테이프입니다.
  3. 냉장 챔버, O / N과 4 ° C에서 어둠 속에서 접시를 품어.
  4. 100 μmol m -2 초 -1 흰색 조명을 사용하여 12 시간 / 12 시간의 명암주기와 23.5 ° C로 설정 성장 챔버로 접시를 전송하고, 7 일간 배양한다. 길이 약 1mm의 자엽과 모종은 수확 할 수있다.

2. 스카이 드롭 떡잎 표본의 설치

주 : VAEM 관찰 용 시료 제조에 중요한 요소는 표본과 커버 유리 사이에 기포의 혼입을 피할 수있다. 거품이 크게 굴절률 차이시킴으로써 VAEM의 화질을 감소시킨다. 우리가 장착 '하늘 드롭'라고 한 간단한 방법은, 거품을 방지하기 위해 사용될 수있다A. 사이 장대 자엽과 커버 유리. 이 관찰 직전에 수행해야합니다.

  1. 76 : 기초 버퍼 [5 mM의 2- (N의 -morpholino) -ethanesulfonic의 pH 6.5에서 산 트리스 (MES 트리스), 50 mM의 KCl을, 100 μm의 염화칼슘 2] 유리 슬라이드의 중심에 (크기의 30 μl를 배치 × 26mm, 두께 : 1.0 ~ 1.2 mm).
  2. 해부 가위를 사용하여 7 일짜리 묘목에서 자엽을 제거합니다. 관찰 측이 기초 버퍼 드롭 (그림 1, 1 단계)에 위를 향하게 자엽 플로트.
  3. 커버 유리의 중심에 기초 버퍼의 30 μl를 놓습니다 (크기 : 18 × 18mm, 두께 : 0.12-0.17 mm) (그림 1, 2 단계). 거꾸로 부드럽게 커버 유리를 돌립니다. 표면 장력은 탈락에서 버퍼 저하를 방지 할 수 있습니다. 하나의 가장자리에 핀셋과 커버 유리를 잡고. 버퍼 강하가 약 떡잎 위에 있도록 유리 슬라이드에 반대 가장자리를 놓습니다.
  4. 이 자엽 샘플 (도 1, 단계 3) 바로 위에 있도록 슬라이드 여전히 커버 유리의 가장자리, 여전히 핀셋 반대쪽 가장자리 들고, 커버 유리 아래 버퍼 강하 위치를 조정한다. 커버 유리 가자. 기포없이 준비의 결과로 샘플에 드롭을 탑재합니다.
  5. 보풀이없는 조직을 사용하여 과도한 버퍼를 닦아냅니다. 바로 준비를 관찰 (3 단계 참조).
    참고 : 샘플을 밀봉 할 필요가 없습니다.

3. VAEM 관측 및 영화 취득

도립 현미경 TIRF 유닛과 1.49의 개구 수를 가지는 대물 렌즈 TIRF 장착되어 참고 : 다음과 같이, 본 연구에 사용 TIRF 현미경 시스템 (9)에 대하여 설명한다. 레이저 진입 각도의 컴퓨터 제어를 들어, 컨트롤 박스가 사용된다. 녹색 형광 단백질 (GFP)는 488 nm의 광 펌핑 반도체 레이저 및 T와 흥분그 형광은 엽록체에서자가 형광을 방지 5백10부터 5백50까지 nm의 대역 통과 필터로 검출된다. 광 출력 전력의 측정 된 최대 값은 13.0에서 13.5까지 mW였다. 검출을 위해, 전자가 사용된다 (EM-CCD) 카메라 헤드 시스템 및 C 마운트 카메라 배율 변경 단위 전하 결합 소자를 승산.

  1. 레이저는 제조자의 지시에 따라 중심 및 포커스 캘리브레이션.
    참고 :이 단계는 정확한 VAEM 관측을 위해 중요하다. 그것은 강력 레이저 경로 조정 절차의 정기적 인 검사, 현미경에 적합한, 수행하는 것이 좋습니다.
    1. 현미경 실의 천장에 대물 렌즈가없는 광경으로 조명 중심 위치를 결정합니다. 중앙 위치를 표시하기 위해 천장에 색칠 된 원 씰을 넣어 (그림 2, 1 단계, 2).
    2. 대물 렌즈 (그림 2, 3 단계, 4)와 천장 조명. 나는 이동중심 위치 (그림 2, 5 단계)로 영역을 lluminated. 레이저 (그림 2, 6 단계)에 초점을 맞 춥니 다. 미세 조정 센터 (그림 2, 7 단계)에 초점을 맞춘 레이저의 위치.
  2. 현미경의 무대에서 표본을 설정하고 시야 조명을 사용하여 관찰 셀을 선택합니다.
  3. 형광 단백질이 세포에서 관찰 될 수 있다는 것을 확인하고, 표면 형광 조명을 (도 3a)을 사용하여 세포 표면의 Z 위치를 설정시킴으로써 행한다.
  4. VAEM 관측을 수행합니다.
    1. 제어기 상자 서서히 레이저 빔의 진입 각도 경사지게. 동시에, 신중하게 라이브 영상을 모니터링 할 수 있습니다. 초기에, 이미지는 (도 3b)을 흐리게한다.
    2. 레이저 각도가 증가함에 따라, 화상 VAEM 결국 선명한 화상 (도 3c 및 D)의 제조, 이하 희미해질 것이다. 이 시점에서, increa을 중지레이저 각도를 노래. 형광 신호가 손실되는 경우, 더 얕은 각도로 감소한다.
    3. 미세 조정 레이저 진입 각도는 더 나은 이미지를 얻을 수있다. 미세 조정 Z시킴으로써 행한다 위치는 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 필요한 경우, 광학 파라미터 (레이저 파워, 파장 필터 집합)과 이미지 센서 파라미터 [화상 사이즈, 노출 시간, 게인, 디지타이저와 승산 전자 (EM)의 이득]을 조정한다.
      주 : TIRF 현미경 장비의 경우 전술 한 바와 같이 다음에, 대표적인 파라미터이다. 그냥 카메라 앞에 렌즈의 배율 : 2 배; 레이저 출력 : 1.0 mW의; 이미지 크기 : 512 × 512 픽셀; 노출 시간 : 100 밀리 초; 게인 : 5 ×를; 디지타이저 : 11 MHz의; 및 EM 이득 : 100.
  5. 현미경 상용 소프트웨어를 사용하여 멀티 페이지 TIFF 이미지 파일로서 영화를 취득. 여기서, 영화 기공 세포의 표면 상에 점멸 GFP 표지 된 점이다.
    주 : 대표 화상 취득 조건 FOL 같다최저. 획득 모드 : 스트림 RAM에; 프레임 수 : 600; 멀티 페이지 TIFF 파일 크기 : ~ 302메가바이트

4. Kymograph 분석 정량 GFP 표지 점 레지던스 시간의 피지 소프트웨어를 사용하여

  1. 피지를 설치 저자의 지침을 사용하여 소프트웨어 (10) ( '피지 그냥 ImageJ에입니다') (http://fiji.sc/Fiji).
  2. 피지를 실행하고 피지 메뉴 "파일 - 열기"를 사용하여 획득 한 멀티 페이지 TIFF 파일을 엽니 다.
  3. 피지 도구 모음 메뉴 "직선 선택 도구"를 사용하여, 관심있는 사이트에 줄을 놓습니다. 선택적으로, "분단 선 선택 도구"또는 "자유 곡선 선택 도구"를 사용합니다. 여기에 제시된 결과에서 (8.0 μm의 상당) 100 픽셀의 직선 자회사 세포 (도 4a)에 위치시켰다.
  4. 피지 메뉴 "이미지 - 스택 - 동적 다시 분할을 사용하여 kymograph 이미지를 확인 (그림 4B). 선택적으로, 체크 박스 창 및 「90도 회전」 「세로 플립 "도 (100 픽셀에 대응하는 (여기에 제시된 결과에서 사용되지 않음) kymograph 이미지. X 축 및 Y 축 라인의 위치를 나타내는 사용할 8.0 μm의) 및 관찰 시간은 (600 픽셀 각각) 60 초에 대응. kymograph 이미지가 만족스럽지 않으면, 위치 및 유형 (직선, 분할 및 다중 페이지 이미지 라인의 자유형)있다. 변화 될 수있다 라인 변경, kymograph 이미지가 동적으로 변경됩니다. 피지 메뉴 "파일 - 다른 이름으로 저장 - 티파니"를 사용하여 TIFF 파일로 kymograph 이미지를 저장합니다.
  5. 시간축 방향에서 블롭의 길이를 측정한다.
    1. 노이즈 감소를 수행하려면, 피지 메뉴 "프로세스 - 필터 - 가우시안 블러"를 사용하여 kymograph 이미지에 가우시안 필터를 적용합니다. "시그마 (라드IUS)은 "조정 가능한 파라미터는 (1 화소 반경 제시된 결과에 이용된다)이다.
    2. 세그먼트 피지 메뉴를 사용하여 임계 값에 의한 신호 영역, "이미지 - 조정 - 임계 값".
      주 : 선택할 수있는 여러 임계 알고리즘이 있습니다. 발표 결과에서 "엔"알고리즘은 (그림 4C) 선택되었다.
    3. 메뉴를 이용하여 이동시킴으로써 행한다 블롭의 시간 길이 (y)를 측정하도록 준비 "분석 설정된 측정". "세트 측정"창에서 "경계의 구형"을 확인하십시오. 이상적 영역 세트는 노이즈를 배제하는, 가능한 한 작아야한다. 여기서, 극소 영역의 화소는 50으로 설정 하였다. 시간 (Y)를 사용하여 메뉴시킴으로써 행한다 블롭의 길이를 측정 "분석 - 입자 분석". 관리자에 추가 "결과 값을 구하여 측정 영역의 신뢰성을 입증,"결과 표시 "를 확인하려면 </ EM> "상자.
    4. "높이"열의 값 (Y)를 측정 BLOB (그림 4D)에 대한 길이를 이동시킴으로써 행한다 시간입니다. 결과 테이블 메뉴 "파일 - 다른 이름으로 저장"을 사용하여 값을 저장하고 계산 및 통계 패키지 및 / 또는 스프레드 시트 소프트웨어 (그림 4E)를 사용하여 BLOB 이미지 기간의 데이터 세트를 처리합니다.

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Representative Results

이 비디오 기사, A에 GFP - PATROL1의 VAEM 관찰을위한 프로토콜에서 장대 떡잎 기공 복잡한 세포가 제공됩니다. 하늘 강하 실장은 A. VAEM 제제의 기포의 발생을 감소시킬 수있는 간단한 제조 방법 장대 자엽 (그림 1). 엔트리 레이저 및 / 또는 VAEM에 대한 표본의 Z-위치의 과도하게 기울 것은 분명 이미지를 제공합니다. 그렇게되면, 그것은 표면 형광 조명에 의해 판단으로 즉시 샘플 위의 위치부터 다시 시작하는 것이 좋습니다. VAEM 관찰 며칠 경험 한 결과, 이러한 점멸 도트 GFP-PATROL1의 여기에 도시 한 바와 같이, 성공적으로 일상적 VAEM 동영상을 취득 할 수 있어야한다. 도 4, A. 12 독립 법인 세포에서 GFP-185 PATROL1 도트의 체류 시간에서 제시 kymograph 분석을 이용하여 장대 자엽을 측정 하였다. 장착 밀도기능은 대부분의 GFP - PATROL1 점은 빠른 세포 외 유출 / 양성자의 엔도 사이토 시스는 자회사 세포 표면에 펌프 제안, 약 3.5 초 (그림 4E)의 피크와, 2 내지 10 초 동안 자회사 셀에 거주하는 것으로 확인된다.

그림 1
. 하늘의 그림 1. 도식은 방법을 장착 드롭 1 단계 : 표본 애기 장대를 장대 자엽이 유리 슬라이드에 기초 버퍼의 드롭에 떠있다. 단계 2 : 기저 완충액 강하 강하는 커버 유리에 배치된다. 3 단계 : 드롭 커버 유리는 거꾸로되어 드롭 유리 슬라이드에 표본 위에 배치된다. 단계 4 : 커버 유리 풀어 놓기 시험편에 빠진다. (TOP) 새 눈보기. (아래) 측면과 확대도. PLEASE이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
도 2 레이저 센터링의 보정 및 초점 1 단계 :. 현미경 리볼버의 빈 위치는 현미경 상기 천장에 레이저 광을 전송하도록 선택된다. 2 단계 : 중앙 위치가 천장에 색칠 된 원 씰을 사용하여 표시됩니다. 단계 3 : 대물이 선택된다. 4 단계 : 대물 렌즈를 통해 레이저 광에 의해 조명의 위치를​​ 확인합니다. 5 단계 : 조명이 표시된 중앙 위치로 조정됩니다. 단계 6 : 레이저 광이 집중된다. 7 단계 :. 초점을 맞춘 레이저 빛이 표시된 중앙 위치로 이동 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


표면 형광 현미경 및 가변 각도 표면 형광 현미경 (VAEM)도 3의 비교. (A) 표면 형광 현미경 레이저 광로의 개략도. (B) 애기 장대의 7 일 된 모종의 떡잎 표면에 GFP - PATROL1의 대표적인 표면 형광 이미지. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. VAEM되는 레이저의 광 경로 (C) 회로도. 레이저의 항목이 기울어 져 있습니다, 그것은 변수 깊이와 시료의 표면을 조명한다. (B)에 도시 된 바와 같이 동일한 영역 (D) VAEM 이미지. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 4. Kymograph 분석은 GFP - PATROL1 점의 체류 시간을 정량화한다. (A) VAEM 이미지를 kymograph를 만들기 위해 배치 직선으로. 스케일 바는 5 μm의를 나타냅니다. (B) (A)에 도시 된 라인을 따라 kymograph 이미지. (B)의 (C) 치 화상 피지 생성 엔 소프트웨어의 알고리즘에 기초. 노란색 선은 GFP - PATROL1 신호의 자동 감지 영역을 보여줍니다. (D) 스크린 샷은 피지의 결과 테이블의 기능을 "입자를 분석". (E) 자회사 세포에서 GFP - PATROL1 점의 체류 시간의 히스토그램. 빨간색 선은 밀도 함수를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 비디오 기사에서는 프로토콜 모니터링 및 애기 장대의 기공 단지에 GFP - PATROL1 점의 동적 거동을 측정하기 위해 제공됩니다. 여기에 도시 된 바와 같이, VAEM 관찰 식물 세포 표면의 라이브 영상을위한 강력한 도구입니다. 고감도 EM-CCD는 VAEM 광학계에 비교적 약한 여기 레이저의 사용을 허용하기 때문에 GFP-PATROL1 모니터링 여기 사용 된 실험 조건 하에서, 비디오 캡쳐의 1 분에 사용 시료 거의 형광 광표백가 있었다. 레이저 센터링 및 각 실험의 시작하기 전에, 포커스, 성공적인 VAEM 관찰을 위해 중요하다. 사용자는 VAEM를 사용하기 전에 선택한 현미경 회사에서 전문 직원에 의해 훈련해야한다.

VAEM는 GFP - PATROL1는 세포막에 깜박이는 움직이지 점 같은 구획 동적 현지화를 가지고 있음을 알 수있다. 형광 표지 된 세포막 프로톤 펌프 AHA1 오 -1-, 공변 세포와 보조 세포 patrol1 돌연변이에 ocalizes 이전에 8,9를보고. 따라서, 시각 VAEM-GFP-PATROL1 도트 역학 원형질막으로 프로톤 펌프의 전달을 나타낼 수있다. GFP-PATROL1 이러한 동적 동작은 식물 세포 표면 상에 실시간 단백질 역학 잠복 VAEM에서의 유용성을 나타내는 종래의 검류계 미러 형의 공 초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 시각화하는 것은 곤란하다. GFP - PATROL1 관찰 식물 세포 생물학 VAEM 응용 프로그램의 한 예입니다. VAEM는 (식물 세포에서의 세포질의 얇은 외피 층의 다수의 이벤트를 감시에 적용 할 것 등, 효소 세포벽 합성 분비 또는 수정 11,12, 세포막 단백질 역학 7,13,14, 피질 미소 관 역학 4 액틴 미세 섬유 4,15의 재 배열 및 세포 소기관 운동 6). 식물 세포 과학자의 다양한 베네한다VAEM 기술에서 맞습니다.

생물학적 화상 데이터의 정량적 평가 최근 현미경 장비 및 컴퓨팅에서의 발전에 힘 입어 중요 해지고있다. 600 (t) × 512 화소 (Y) × 512 (X)를 함유 VAEM 동영상 데이터를 쉽게 몇 분 밖에 얻을 수있다. 이미지 분석은 형광 표지 된 단백질의 수명이나 움직임을 측정하는 데 도움이뿐만 아니라 대형 다차원 이미지 데이터 세트로부터 생체 정보를 채굴한다. kymograph는 세포막 단백질의 2 상으로 순차적 채용에 의해 도시 된 바와 같이, VAEM 무비 데이터로부터 목적 단백질의 이동을 결정하는 단계에 기초하지만, 가치있는 방법이다. 도 4에 도시 된 바와 같이 kymograph는 GFP-PATROL1 도트 '체류 시간의 시각화 및 세포막에 낮은 운동을 허용. 반대로 kymograph는 세포질 스트리밍과 같은 더 복잡한 움직임을 평가하는 효과를 제한하고있다. 더 compli 들어광학 플로우 (16)가 도움이 될 것으로 cated 운동, 다른 이미지 분석은 접근한다.

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Disclosures

저자는 공개 아무것도 없습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inverted microscope Olympus IX-73
TIRF unit Olympus IX3-RFAEVAW
TIRF objective lens  Olympus UAPON 100 × OTIRF  NA = 1.49
Laser angle control box Chuo Seiki QT-AK
Optically pumped semiconductor laser Coherent SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser
510–550 nm band-pass filter Olympus U-FBNA
EM CCD camera Hamamatsu Photonics ImagEM C9100-13
C-mount camera magnification change unit  Olympus U-TVCAC
MetaMorph software Molecular Devices MetaMorph version 7.7.11.0
TIRF microscopy manual Olympus AX7385 Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012)
Immersion oil Olympus Immersion Oil Typr-F ne = 1.518 (23 degrees)

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References

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  16. Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).

Tags

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