Summary
Målet med denne protokol er at demonstrere, hvordan at overvåge fluorescens-mærkede protein dynamik på plante celle overflader med variabel vinkel epifluorescens mikroskopi, der viser blinkende prikker af GFP-mærkede PATROL1, et protein-membran menneskehandel i cellen cortex i stomatal kompleks i Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Fremstilling af stiklinger
- Sterilisere frøene.
- Forbered sterilisationsopløsning ved tilsætning af 500 pi NaCIO (tilgængelig chlor: 5,0%) og 1 pi 10% Triton X-100 til 500 pi sterilt vand.
- Sted ca. 10 transgene A. thaliana frø bærer GFP-PATROL1 8 ind i en 1,5-ml rør.
- Tilsæt 1 ml 70% ethanol-opløsning, og bland godt ved at vende fem gange. Lad i 1 min.
- Observere frøene synker til bunden af røret. I en ren laminar flow kabinet, forsigtigt fjerne 70% ethanol ved hjælp af en mikropipette, og der tilsættes 1 ml sterilisering løsning. Bland godt ved at vende fem gange, og lad i 5 min.
- Vask frøene. Stadig arbejder under aseptiske forhold på en ren bænk, forsigtigt fjerne løsningen ved hjælp af en mikropipette, og der tilsættes 1 ml sterilt vand. Gentag dette fem gange. De steriliserede frø kan opbevares i sterilt vand ved 4 ° C i 2 dage.
- Såw de steriliserede frø på en 0,5% gellangummi-størknede 1/2 Murashige og Skoog-medium plade (pH 5,8) 9. Tape låget på pladen ved hjælp af to lag af kirurgisk tape.
- Inkubér pladen i mørke ved 4 ° C med en kold opbevaring kammer, O / N.
- Overfør pladen i et vækstkammer indstillet på 23,5 ° C med en 12-timers / 12-timers lys-mørke-cyklus under anvendelse af 100 pmol m -2 sek -1 hvidt lys, og der inkuberes i 7 dage. Frøplanter med kimblade på omkring 1 mm lange kan derefter høstes.
2. Sky Drop Montering af cotyledon Enheder
BEMÆRK: En vigtig faktor i forberedelse prøve for VAEM observation er at undgå inddragelse af luftbobler mellem prøven og dækglasset. Bobler i høj grad reducere billedkvaliteten af VAEM ved at forårsage forskelle i brydningsindekset. En simpel metode, som vi har kaldt "himmel drop 'montering, kan bruges til at undgå boblermellem A. thaliana kimbladene og låget glas. Dette bør ske umiddelbart før observation.
- Placer 30 pi basal buffer [5 mM 2- (N -morpholino) -ethansulfonsyre-Tris (MES-Tris) ved pH 6,5, 50 mM KCI, 100 uM CaCl2] på midten af et objektglas (størrelse: 76 × 26 mm, tykkelse: 1,0-1,2 mm).
- Fjern en cotyledon fra en 7 dage gammel sætteplante hjælp dissekere saks. Float kimbladet med observation opad på den basale buffer dråbe (figur 1, trin 1).
- Placer 30 ul basal buffer på midten af et dækglas (størrelse: 18 × 18 mm, tykkelse: 0,12-0,17 mm) (Figur 1, trin 2). Drej dækslet glasset på hovedet forsigtigt. Overfladespænding vil forhindre buffer drop falde ned. Hold låget glas med en pincet på den ene kant. Placer den modsatte kant på objektglasset, således at bufferen dråbe er ca. ovenfor kimbladet.
- Med kanten af dækglasset stadig på dias, og stadig holder den modsatte kant med en pincet, justere placeringen af bufferen dråbe under dækslet glasset, så det er direkte over cotyledon prøven (figur 1, trin 3). Slip dækglasset. Montere en dråbe på prøven resulterer i et præparat uden luftbobler.
- Tør overskydende buffer hjælp fnugfri væv. Overhold præparatet straks (se trin 3).
BEMÆRK: Der er ingen grund til at forsegle prøverne.
3. VAEM Observation og Movie Acquisition
BEMÆRK: TIRF mikroskopsystem 9 anvendes i den foreliggende undersøgelse er beskrevet som følger: et omvendt mikroskop er udstyret med en TIRF enhed og en TIRF objektiv med en numerisk apertur på 1,49. For edb styring af laser indrejse vinkel, er en kontrolboks anvendes. Grønt fluorescerende protein (GFP) exciteres med en 488 nm optisk pumpet halvlederlaser, og than fluorescens detekteres gennem et 510-550 nm båndpasfilter at forhindre autofluorescens fra chloroplaster. Den målte maksimale værdi af fiber udgangseffekt er 13,0 til 13,5 mW. Til påvisning, en elektron multiplicere ladningskoblet indretning (EM-CCD) kamera hoved og en C-mount kamera forstørrelse ændringsenhed anvendes.
- Kalibrere laseren centrering og fokusering i overensstemmelse med producentens anvisninger.
BEMÆRK: Dette trin er afgørende for præcise VAEM observationer. Det anbefales kraftigt, at periodisk kontrol af justering procedurer laser sti, hensigtsmæssigt at din mikroskop, udføres.- Bestem den centrale position belyses med en objektiv linse-fri lys sti på loftet af mikroskopi rummet. For at markere den centrale position, sætte en farvet cirkel segl på loftet (Figur 2, trin 1, 2).
- Oplys loftet med en objektiv linse (Figur 2, trin 3, 4). Flyt illuminated region til midterpositionen (Figur 2, trin 5). Fokus laseren (Figur 2, trin 6). Finjustere positionen af det fokuserede laser til centrum (figur 2, trin 7).
- Sæt en prøve på scenen af mikroskopet og vælg cellerne til observation ved hjælp af lyse felt belysning.
- Kontroller, at det fluorescerende protein kan observeres i cellerne, og indstil z aksen position på celleoverfladen under anvendelse af epifluorescensbelysning (figur 3A).
- Udfør VAEM observationer.
- Hælde indgangsvinklen af laserstrålen gradvist med controllerskabet. Samtidig, overvåge live-billedet omhyggeligt. I første omgang, vil billedet blive sløret (figur 3B).
- Som laser vinkel øges, vil VAEM billedet bliver mindre sløret, vinder producerer et klart billede (figur 3C og D). På dette tidspunkt stopper increasynge laser vinkel. Hvis fluorescenssignalet mistes, falde til et fladere vinkel.
- Finjuster laser indgangsvinkel til at opnå et bedre image. Finjustering af z aksen position kan også forbedre billedet. Hvis det er nødvendigt, justeres de optiske parametre (laser magt, bølgelængde og filter sæt) og billede sensor parametre [Billedformat, eksponeringstid, gain, digitizer og elektron-multiplicere (EM) gevinst].
BEMÆRK: I tilfælde af TIRF mikroskop ovenfor beskrevne udstyr, repræsentative parametre er som følger. Forstørrelse af linsen lige foran kameraet: 2X; Laser output: 1,0 mW; Billedstørrelse: 512 × 512 pixels; Ekspositionsvarighed: 100 ms; Gain: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; og EM gevinst: 100.
- Anskaf en film som en flersidet TIFF-billede fil ved hjælp af kommercielle mikroskop software. Her er filmen er af GFP-mærkede prikker blinker på overfladen af stomatale celler.
BEMÆRK: Repræsentative betingelser billedoptagelse er som folnedture. Erhvervelse Mode: Stream til RAM; Antal billeder: 600; og flersidet TIFF filstørrelse: ~ 302 MB.
4. Kymograph Analyse for Kvantificering af GFP-mærkede Dot Residence Time Brug Fiji Software
- Installer Fiji ('Fiji er Just ImageJ «) software 10 hjælp forfatternes instruktioner (http://fiji.sc/Fiji).
- Kør Fiji og åbn den erhvervede flersidet TIFF-fil ved hjælp af Fiji-menuen "Filer-Åbn".
- Placer en linje på stedet af interesse ved hjælp af Fiji værktøjslinjen menu "Lige Linje Selection Tool". Eventuelt bruge "Segmenteret Linje Selection Tool" eller "Freehand Linje Selection Tool". I de her fremlagte resultater blev en lige linje på 100 pixels (svarende til 8,0 um) placeret på en subsidiær celle (Figur 4A).
- Lav en kymograph billedet ved hjælp af menuen Fiji "Image-Stacks-Dynamic Reslice (figur 4B). Eventuelt "Flip lodret" og "Roter 90 grader" i et afkrydsningsfelt vindue er også tilgængelige (ikke brugt i de resultater, der præsenteres her). Den x- og y-aksen i kymograph billedet angives linjenummeret position (100 pixel, der svarer til 8,0 um) og observation tid (600 pixel, svarende til 60 sek), hhv. Hvis kymograph billede ikke er tilfredsstillende, position og type (lige, segmenteret og frihånd) i linje på flersidet billede kan ændres. Som linjen ændringer, det kymograph billedet dynamisk ændrer. Gem et kymograph billede som en TIFF-fil ved hjælp af menuen Fiji "File-Gem som-Tiff".
- Mål længden af blob i orienteringen af tidsaksen.
- For at udføre støjreduktion, anvende en Gaussisk filter til kymograph billeder ved hjælp af Fiji-menuen "procesorienteret Filtre-Gaussian Blur". Den "Sigma (Radius) "parameter er justerbar (1 pixel radius anvendes til de præsenterede resultater).
- Segment signalet regioner ved tærskling, ved hjælp af menuen Fiji "Image-Adjust-tærskel".
BEMÆRK: Der er flere tærsklingsparametre algoritmer til at vælge fra. I præsenterede resultater blev "Yen" algoritme valgt (figur 4C). - Forbered dig på at måle tiden (y) aksen længde klat ved hjælp af menuen "Analyze-Set Målinger". Check "omgivende rektangel" i "Set Målinger" vinduet. Ideelt set område skal være så lille som muligt, for at udelukke støj. Her blev minimumsareal sat til 50 pixels. Måle tiden (y) aksen længde klat ved hjælp af menuen "Analyze-Analyser Partikler". For at opnå de resultatværdier og bevise troværdighed måling regioner, skal du kontrollere "Vis resultaterne" og "Føj til manager </ em> "bokse.
- Værdier i kolonnen "Højde" er den tid (y) -aksen længder til den målte blob (figur 4D). Gem værdierne med Results tabellen menuen "Filer-Gem som" og beregne og bearbejde datasættet af blob billede varigheder ved hjælp af en statistisk pakke og / eller regneark software (Figur 4E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne video artiklen, protokollerne for VAEM observation af GFP-PATROL1 i A. thaliana cotyledon stomatale komplekse celler leveres. Sky dråbe montering er en simpel fremstillingsmetode, der kan medvirke til at reducere forekomsten af luftbobler i VAEM præparater af A. thaliana kimblade (figur 1). Overtilting for posten laser og / eller z-positionering af prøver til VAEM vil give et uklart billede. Hvis det sker, anbefales det at starte igen fra en position umiddelbart over prøven, som bedømt af epifluorescens belysning. Efter et par dages oplevelse af VAEM observation, bør det være muligt at erhverve VAEM film med succes og rutinemæssigt, som den her viste af GFP-PATROL1 dot blinke. Brug af kymograph analysen i figur 4, de opholdstider på 185 GFP-PATROL1 prikker fra 12 uafhængige datterselskaber celler i A. thaliana kimblade blev målt. Den monteret tæthedfunktion viste, at de fleste GFP-PATROL1 prikker var bosat i et datterselskab celle til mellem 2 og 10 sekunder, med en top på omkring 3,5 sek (Figur 4E), hvilket tyder på hurtig exocytose / endocytose af proton pumper på datterselskabet celleoverfladen.
Figur 1. Skematisk af himlen drop montering metode Trin 1:. Specimen Arabidopsis thaliana kimbladene er flød på en dråbe af basal buffer på et objektglas. Trin 2: En dråbe basal buffer dråbe anbringes på et dækglas. Trin 3: dækglas med faldet vendes på hovedet og faldet er placeret over prøven på objektglasset. Trin 4: Dækslet glas frigøres og faldet falder på til modellen. (Top) fugleperspektiv. (Bund) Lateral og forstørret visning. Please klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kalibrering af laser centrering og fokusering Trin 1:. Den tomme position mikroskopet revolver er valgt til at sende laserlys på loftet over mikroskop. Trin 2: Den centrale position er markeret ved hjælp af en farvet cirkel segl på loftet. Trin 3: En objektiv er valgt. Trin 4: Kontroller stilling belyst af laserlyset gennem objektivlinsen. Trin 5: Belysningen justeres til den markerede centrale position. Trin 6: Laseren lys fokuseres. Trin 7:. Den fokuserede laserlys flyttes til den markerede centrale position Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Sammenligning af epifluorescens mikroskopi og variabel vinkel epifluorescens mikroskopi (VAEM). (A) Skematisk af lysvejen af laseren i epifluorescens mikroskopi. (B) Repræsentant epifluorescens billede af GFP-PATROL1 på cotyledon overflader i 7 dage gamle planter af Arabidopsis thaliana. Målestokken viser 5 um. (C) Skematisk af lysvejen af laseren i VAEM. Bemærk at laser indtræden vippes, og den belyser prøvens overflade med variabel dybde. (D) VAEM billeder af det samme region som vist i (B). Scale bar indikerer 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kymograph analyse for at kvantificere et GFP-PATROL1 dot s opholdstid. (A) VAEM billede med en lige linje placeret til at gøre en kymograph. Målestokken viser 5 um. (B) En kymograph billede langs linien vist i (A). (C) et binært billede af (B) baseret på Yen algoritme, der genereres i Fiji software. Gule linjer viser automatisk-detekterede område af GFP-PATROL1 signal. (D) Screenshot af resultater tabel over Fiji "Analyze partikler" funktion. (E) Et histogram af GFP-PATROL1 dot s opholdstid i datterselskaber celler. Den røde linje viser tæthedsfunktionen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne video artiklen, er protokoller gives til overvågning og måling af dynamiske opførsel af GFP-PATROL1 prikker på stomatal kompleks af Arabidopsis thaliana. Som vist her, VAEM observation er et kraftfuldt værktøj til levende billeder af planter celleoverflader. Under de eksperimentelle betingelser, der anvendes her for GFP-PATROL1 overvågning, der var meget lidt fluorescens fotoblegning i prøven anvendes til 1 min på videooptagelse, fordi meget følsomme EM-CCD tillader anvendelsen af en relativt svag excitation laser i VAEM optik. Laser centrering og fokusering, inden begyndelsen af hvert forsøg, er vigtige for en vellykket VAEM observation. Brugerne bør blive trænet af professionelle personale fra den valgte mikroskop selskab, før du bruger VAEM.
VAEM afslører, at GFP-PATROL1 har en dynamisk lokalisering med en ubevægelig prik-lignende rum blinker på plasmamembranen. De fluorescens-mærkede plasmamembranen protonpumpe AHA1 mis-localizes i patrol1 mutant vagt celler og underordnede celler, som tidligere rapporteret 8,9. Således kan VAEM-visualiseret GFP-PATROL1 dot dynamik repræsenterer leveringen af protonpumpen i plasmamembranen. Denne dynamiske opførsel af GFP-PATROL1 er svært at visualisere bruge konventionel galvanometer spejl-typen konfokal laser scanning mikroskopi, hvilket indikerer nytten af VAEM afdække realtid protein dynamik på plante celleoverflader. GFP-PATROL1 observation er blot ét eksempel på VAEM ansøgning plante cellebiologi. VAEM ville være gældende for overvågning af en lang række arrangementer i den tynde kortikale lag af cytoplasma i planteceller (fx enzym sekretion i cellevægssyntese eller ændring 11,12, plasmamembranprotein dynamik 7,13,14, kortikale mikrotubulusdynamik 4, omlejring af aktin mikrofilamenter 4,15 og organel bevægelighed 6). En bred vifte af plante celle forskere bør Benepasser fra VAEM teknikker.
Kvantitativ vurdering af biologiske billeddata er for nylig blevet vigtigt, drevet af fremskridt i mikroskop udstyr og databehandling. VAEM film data, der indeholder 512 (x) × 512 (y) × 600 (t) pixels kan let opnås i kun et par minutter. Billede analyse hjælper ikke kun i at måle levetid eller bevægelse af en fluorescens-mærket protein, men også i minedrift biologisk information fra store, flerdimensionelle billede datasæt. En kymograph er en grundlæggende, men værdifuld, tilgang til fastlæggelse målprotein bevægelse fra VAEM filmdata, som det fremgår af den sekventielle rekruttering af proteiner på plasma membraner 2. Den kymograph tillod visualisering af GFP-PATROL1 dots 'opholdstider, og deres lave motilitet på plasmamembraner, som vist i figur 4. Omvendt har en begrænset virkning, kymograph for at vurdere mere komplicerede bevægelser, såsom cytoplasmatisk streaming. For mere gratis forkerede bevægelse, andre billedanalyse tilgange såsom optisk flow 16 ville være nyttigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
