Summary
Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie fluoreszenzmarkierte Proteindynamik zu Pflanzenzelloberflächen mit variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie, die blinkende Punkte von GFP-markiertem PATROL1 ein Membrantransportprotein zu überwachen, in der Zelle Kortex der Stomata Komplex in Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Herstellung von Jungpflanzen
- Sterilisieren Sie die Samen.
- Vorbereitung der Sterilisationslösung durch Zugabe von 500 & mgr; l NaClO (verfügbares Chlor: 5,0%) und 1 ul 10% Triton X-100 und 500 & mgr; l sterilem Wasser.
- Platz ca. 10 transgenen A. thaliana Samen tragenden GFP-PATROL1 8 in ein 1,5-ml-Tube.
- 1 ml 70% Ethanol-Lösung, und gut mischen durch Invertieren fünfmal. Lassen Sie für 1 min.
- Beobachten die Samen zu Boden sinken, der Röhre. In einem sauberen Sterilbank, entfernen Sie vorsichtig die 70% Ethanol mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml Sterilisationslösung. Gut mischen durch Invertieren fünf Mal und lassen Sie für 5 min.
- Die Samen zu waschen. Arbeiten noch unter aseptischen Bedingungen auf einer sauberen Werkbank, entfernen Sie vorsichtig die Lösung mit einer Mikropipette, und fügen Sie 1 ml sterilem Wasser. Wiederholen Sie dies fünf Mal. Die sterilisierten Samen können in sterilem Wasser bei 4 ° C für 2 Tage aufbewahrt werden.
- Alsow den sterilisierten Samen auf einem 0,5% Gellangummi verfestigt 1/2 Murashige und Skoog Medium Platte (pH 5,8) 9. Band der Deckel auf die Platte unter Verwendung von zwei Schichten von chirurgischem Band.
- Inkubieren der Platte in der Dunkelheit bei 4 ° C mit einem kalten Speicherraum, O / N.
- Übertragen Sie die Platte in eine Wachstumskammer bei 23,5 ° C mit einer 12-Stunden / 12-Stunden-Hell-Dunkel-Zyklus unter Verwendung von 100 & mgr; mol m -2 s -1 weiße Lichter gesetzt, und Inkubation für 7 Tage. Sämlinge mit Keimblättern von etwa 1 mm lang kann dann geerntet werden.
2. Sky Tropfen Montage der Cotyledon Proben
HINWEIS: Ein wichtiger Faktor bei der Probenvorbereitung für vaem Beobachtung wird die Vermeidung der Einschluss von Luftblasen zwischen der Probe und dem Deckglas. Bubbles die Bildqualität von vaem erheblich reduzieren, indem Unterschiede im Brechungsindex. Eine einfache Methode, die wir "Himmel Drop" genannt Montage kann verwendet werden, um Blasen zu vermeidenzwischen der A. thaliana Keimblätter und das Deckglas. Dieses ist unmittelbar vor der Beobachtung durchgeführt werden.
- Werden 30 ul Basalpuffer [5 mM 2- (N-Morpholino) ethansulfonsäure-Tris (MES-Tris) bei pH 6,5, 50 mM KCl, 100 uM CaCl & sub2;] auf dem Zentrum eines Glasobjektträgers (Größe: 76 × 26 mm, Dicke: 1,0 bis 1,2 mm).
- Entfernen Sie ein Keimblatt aus einem 7-Tage-alten Keimling mit Präparierscheren. Schwimmer den Kotyledonen mit der Beobachtungsseite nach oben auf dem Basalpuffer Abfall (Abbildung 1, Schritt 1).
- Werden 30 ul Basalpuffer auf der Mitte eines Deckglases (Größe: 18 × 18 mm, Dicke: 0,12-0,17 mm) (Abbildung 1, Schritt 2). Drehen Sie das Deckglas auf den Kopf sanft. Die Oberflächenspannung wird die Puffertropfen herunterfällt. Halten Sie das Deckglas mit einer Pinzette an einer Kante. Platzieren der gegenüberliegenden Kante auf dem Glasträger, so dass der Puffer Abfall ist etwa über dem Keimblatt.
- Mit der Kante des Deckglases noch auf der Folie, und immer noch das gegenüberliegende Kante mit einer Pinzette, passen die Position des Pufferabfall unter dem Deckglas, so daß es unmittelbar oberhalb des Keimblattprobe (1, Schritt 3). Lassen Sie das Deckglas. Montieren Sie einen Tropfen auf die Probe, was zu einem Präparat ohne Luftblasen.
- Wischen Sie überschüssiges Puffer mit fusselfreien Gewebe. Beobachten Sie sofort die Vorbereitung (siehe Schritt 3).
HINWEIS: Es ist nicht notwendig, um die Proben zu versiegeln.
3. vaem Beobachtung und Film-Übernahme
HINWEIS: Ein invertiertes Mikroskop ist mit einem TIRF Einheit und einer TIRF Objektivlinse mit einer numerischen Apertur von 1,49 ausgestattet: Die TIRF Mikroskopsystem 9 in der vorliegenden Studie verwendet wird wie folgt beschrieben. Für computergestützte Steuerung der Lasereintrittswinkel wird ein Steuerfeld verwendet. Grün fluoreszierendes Protein (GFP) erregt wird mit einer 488 nm optisch gepumpte Halbleiterlaser und ter Fluoreszenz wird durch einen 510-550 nm Bandpassfilters erfasst wird, um die Autofluoreszenz von Chloroplasten verhindern. Die gemessene Maximalwert des Faserausgangsleistung von 13,0 bis 13,5 mW. Für den Nachweis, eine Elektronenvervielfachungs charge-coupled device (EM-CCD) Kamera-Kopf-System und ein C-Mount-Kamera Vergrößerungsänderungseinheit verwendet.
- Kalibrieren der Laser Zentrierung und Fokussierung entsprechend den Anweisungen des Herstellers.
HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend für eine präzise vaem Beobachtungen. Es wird dringend empfohlen, dass regelmäßige Kontrollen der Laserpfad Bereinigungsverfahren, die zu Ihrem Mikroskop durchgeführt werden.- Bestimmen Sie die zentrale Lage mit einer Objektivlinse freie Lichtpfad an der Decke der Mikroskopie Raum beleuchtet. Um die zentrale Position zu markieren, setzen Sie einen farbigen Kreis Dichtung an der Decke (Abbildung 2, Stufe 1, 2).
- Beleuchten die Decke mit einer Objektivlinse (Abbildung 2, Schritt 3, 4). Bewegen Sie den illuminated Region in die Mittelstellung (Abbildung 2, Schritt 5). Fokus des Lasers (Abbildung 2, Schritt 6). Feinabstimmung der Position des fokussierten Laserstrahls auf die Mitte (Abbildung 2, Schritt 7).
- Legen Sie ein Objekt auf den Tisch des Mikroskops und wählen Sie Zellen für die Beobachtung mit Hellfeldbeleuchtung.
- Überprüfen Sie, dass das fluoreszierende Protein in den Zellen beobachtet werden, und stellen Sie die z-Achse Position an der Zelloberfläche unter Verwendung von Epifluoreszenz-Beleuchtung (3A).
- Führen vaem Beobachtungen.
- Neigen Sie den Eintrittswinkel des Laserstrahls allmählich mit der Controller-Box. Zur gleichen Zeit, zu überwachen das Live-Bild sorgfältig. Zunächst wird das Bild unscharf werden (3B).
- Da die Laserwinkel zunimmt, wird die vaem Bild weniger unscharf werden, was schließlich eine klare Bild (3C und D). An dieser Stelle aufhören Increasingen die Laserwinkel. Wenn das Fluoreszenz-Signal verloren gegangen ist, zu verringern, um einen flacheren Winkel.
- Feinabstimmung der Lasereintrittswinkel, um ein besseres Bild zu erhalten. Feinabstimmung der Z-Achsen-Position kann auch das Bild zu verbessern. Passen Sie bei Bedarf die optischen Parameter (Laserleistung, Wellenlänge und Filtersatz) und die Bildsensorparameter [Bildgröße, Belichtungszeit, Verstärkung, Digitizer und Elektronen-Multiplikation (EM) Verstärkung].
HINWEIS: In dem oben beschriebenen Fall der TIRF Mikroskopausrüstung, sind wie folgt repräsentativen Parametern. Vergrößerung der Linse direkt vor der Kamera: 2X; Laserleistung: 1,0 mW; Bildgröße: 512 x 512 Pixel; Belichtungszeit: 100 ms; Gewinnen: 5 x; Digitizer: 11 MHz; und EM-Gewinn: 100.
- Erwerben Sie einen Film als eine mehrseitige TIFF-Image-Datei mit der kommerziellen Mikroskop-Software. Hierbei ist von GFP-markierten Punkte blinkt auf der Oberfläche der Spaltöffnungszellen der Film.
HINWEIS: Vertreter Bildaufnahme Bedingungen sind wie folTiefen. Erfassungsmodus: Strom in den RAM; Anzahl der Frames: 600; und mehrseitige TIFF-Dateigröße: ~ 302 MB.
4. Kymograph Analyse zur Quantifizierung von GFP-markierten Dot Verweilzeit Mit Fiji Software
- Installieren Fidschi ("Fidschi ist nur ImageJ) Software 10 Verwendung der Autoren Anweisungen (http://fiji.sc/Fiji).
- Führen Fiji und öffnen Sie die erworbenen mehrseitige TIFF-Datei mit Hilfe des Fidschi-Menü "Datei-Öffnen".
- Platzieren Sie eine Linie auf der Stelle von Interesse, mit der Fidschi-Werkzeugleiste Menü "Straight Line Selection Tool". Optional können Sie die "Segmented Linie Selection Tool" oder "Freihandlinie Selection Tool". In den hier vorgestellten Ergebnisse, wurde eine gerade Linie von 100 Pixeln (entsprechend 8,0 & mgr; m) auf einer Tochterzelle (4A) platziert.
- Einen kymograph Bildes im Menü Fiji "Bild-Stacks-Dynamische Reslice (4B). Optional "Vertikal spiegeln" und "Um 90 Degrees" in einem Kontrollkästchen Fenster sind ebenfalls verfügbar (nicht in den hier vorgestellten Ergebnisse verwendet). Die x- und y-Achse in der kymograph Bild zeigen die Linienposition (100 Pixeln entsprechend 8,0 & mgr; m) und Beobachtungszeit (600 Pixel entsprechend 60 sec) bezeichnet. Wenn die kymograph Bild nicht zufriedenstellend ist, die Position und die Art (gerade, segmentiert und Freihand) der Linie auf mehrseitige Bild der geändert werden kann. Als die Linie ändert, ändert dynamisch die kymograph Bild. Speichern Sie eine kymograph Bild als TIFF-Datei über das Menü Fiji "Datei-Speichern unter-Tiff".
- Messen der Länge des Tropfens in der Ausrichtung der Zeitachse.
- Zur Geräuschreduzierung durchführen, tragen Sie eine Gauß-Filter auf die kymograph Bilder mit der Fidschi-Menü "Process-Filter-Gaußschen Weichzeichner". Die "Sigma (Radius) "Parameter abstimmbar (1 Pixel Radius wird für die vorgestellten Ergebnisse verwendet).
- Segment die Signalbereiche durch Schwellen, über das Menü Fiji "Bild-Adjust-Threshold".
HINWEIS: Es gibt mehrere Schwellen Algorithmen zur Auswahl. Dargestellt Ergebnissen wurde die "Yen" Algorithmus ausgewählt (4C). - Bereiten Sie, um die Zeit (y) messen -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren-Set Messungen". Überprüfen Sie die "Begrenzungsrechteck" im Fenster "Set Messungen". Im Idealfall sollte die Fläche so klein wie möglich sein, um Rauschen auszuschließen. Hier wurde die Mindestfläche auf 50 Pixel festgelegt. Messen Sie die Zeit (y) -Achse Länge des Blobs über das Menü "Analysieren Analysieren-Particles". Um die Ergebniswerte zu erhalten und zu beweisen, Glaubwürdigkeit der Messbereiche, überprüfen Sie die "Ergebnisse" und "In-Manager </ em> "Boxen.
- Werte in der Spalte "Größe" gibt die Zeit (y) -Achse Längen für die gemessene Blob (4D). Speichern Sie die Werte mit der Ergebnistabelle Menü "Datei-Speichern unter" und berechnen und zu verarbeiten, die Datenmenge der Bild blob Dauern unter Verwendung eines statistischen Verpackung und / oder Tabellenkalkulationsprogramm (4E).
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Representative Results
In diesem Video-Artikel, der Protokolle für vaem Beobachtung der GFP-PATROL1 in A. thaliana cotyledon Stomata komplexen Zellen werden zur Verfügung gestellt. Sky Drop Montage ist ein einfaches Herstellungsverfahren, die dazu beitragen, das Auftreten von Luftblasen in vaem Zubereitungen von A. kann thaliana Cotyledonen (Abbildung 1). Hoher Neigungswinkel der Eintritts Laser und / oder z-Positionierung von Proben für vaem liefert ein unklares Bild. Wenn das geschieht, ist es empfehlenswert, erneut von einer Position unmittelbar über der Probe zu starten, wie durch Epifluoreszenz Beleuchtungs beurteilt. Nach ein paar Tagen Erfahrung vaem Beobachtung, sollte es möglich sein, vaem Filme erfolgreich und routinemäßig zu erwerben, wie das hier von GFP-PATROL1 gezeigten Punkt blinken. Verwenden des kymograph Analyse in Abbildung 4 sind die Verweilzeiten von 185 GFP-PATROL1 Punkten aus 12 unabhängigen Nebenzellen in A. vorgestellt thaliana Kotyledonen wurden gemessen. Die EinbaudichteFunktion ergeben, dass die meisten GFP-PATROL1 Punkte waren mit Wohnsitz in einem Tochterzelle für zwischen 2 und 10 sec, mit einem Spitzenwert von rund 3,5 sec (4E), was darauf hindeutet, schnelle Exozytose / Endozytose von Protonen-Pumpen auf der Tochterzelloberfläche.
Abbildung 1. Schematische des Himmels fallen Montageverfahren. Schritt 1: Proben Arabidopsis thaliana Keimblätter werden auf einem Tropfen Basalpuffer auf einem Glasträger schwebte. Schritt 2: Ein Tropfen Basalpuffer Tropfen auf einem Deckglas gelegt. Schritt 3: Das Deckglas mit dem Tropfen auf den Kopf gestellt und die Tropfen oberhalb der Probe auf den Objektträger gelegt. Schritt 4: Das Deckglas wird gelöst und der Tropfen fällt auf die Probe. (Top) Vogelperspektive. (Seitenende) Seitliche und vergrößerte Ansicht. Please Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 2. Kalibrierung der Laser Zentrierung und konzentriert. Schritt 1: Die leere Position des Mikroskops Revolver ausgewählt wird, um Laserlicht auf die Decke über dem Mikroskop zu senden. Schritt 2: Die Mittellage wird unter Verwendung eines farbigen Kreis Dichtung an der Decke markiert. Schritt 3: Ein Ziel ausgewählt ist. Schritt 4: Überprüfen Sie die Position durch das Laserlicht durch die Objektivlinse beleuchtet. Schritt 5: Die Beleuchtung wird auf die markierte Mittellage eingestellt. Schritt 6: Das Laserlicht fokussiert wird. Schritt 7:. Der fokussierte Laserlicht auf die markierten Mittelposition bewegt wird Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. Vergleich der Epifluoreszenzmikroskopie und variablem Winkel Epifluoreszenzmikroskopie (vaem). (A) Schematische Darstellung der Strahlengang des Lasers in der Epifluoreszenzmikroskopie. (B) Repräsentative Epifluoreszenz Bild der GFP-PATROL1 bei Keimblattflächen in 7 Tage alte Keimlinge von Arabidopsis thaliana. Maßstabsbalken zeigt an, 5 um. (C) Schematische Darstellung der Strahlengang des Lasers in vaem. Beachten Sie, dass der Eintrag des Lasers geneigt ist, und beleuchtet die Oberfläche des Prüflings mit variabler Tiefe. (D) vaem Bilder des gleichen Bereichs wie in (B) gezeigt. Maßstabsbalken zeigt an, 5 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Kymograph Analyse, um eine GFP-PATROL1 dot die Verweilzeit mit einer geraden Linie angeordnet, um eine kymograph machen zu quantifizieren. (A) vaem Bild. Maßstabsbalken zeigt an, 5 um. (B) A kymograph Bild entlang der in (A) gezeigten Linie. (C) ein binäres Bild (B) auf Basis von Yen-Algorithmus, in Fiji-Software generiert. Gelbe Linien zeigen die automatisch erkannten Bereich der GFP-PATROL1 Signal. (D) Screenshot der Ergebnistabelle der Fiji "Analyze Particles" Funktion. (E) Ein Histogramm der GFP-PATROL1 dot die Verweilzeit in Tochterzellen. Die rote Linie zeigt die Dichtefunktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Video-Artikel werden Protokolle zur Überwachung und Messung des dynamischen Verhaltens des GFP-PATROL1 Punkte auf der Stomata Komplex aus Arabidopsis thaliana angegeben. Wie hier gezeigt, ist vaem Beobachtung ein leistungsfähiges Werkzeug für Live-Imaging von Pflanzenzelloberflächen. Unter den für die GFP-PATROL1 Überwachungs hier verwendeten experimentellen Bedingungen gab es sehr wenig Fluoreszenzphotobleichen in der Probe für 1 Minute zur Videoaufzeichnung verwendet wird, weil die hochsensiblen EM-CCD ermöglicht die Verwendung einer relativ schwachen Anregungslaser in vaem Optik. Laser Zentrierung und Fokussierung, vor Beginn jedes Experiments sind wichtig für die erfolgreiche vaem Beobachtung. Anwender sollten von professionellen Mitarbeitern von der gewählten Mikroskop Unternehmen, bevor Sie vaem geschult werden.
Vaem zeigt, dass GFP-PATROL1 hat einen dynamischen Lokalisierung mit einem unbeweglichen punktförmige Abteil blinkt an der Plasmamembran. Die fluoreszierend markierten Plasmamembranprotonenpumpen AHA1 mis-localizes in PATROL1 Mutante Schließzellen und Nebenzellen, wie bereits berichtet 8,9. Somit kann die vaem visualisierten GFP-PATROL1 Punktdynamik die Abgabe der Protonenpumpe in die Plasmamembran darstellen. Das dynamische Verhalten des GFP-PATROL1 ist schwierig zu visualisieren mit herkömmlichen Galvanometerspiegel Typ konfokaler Laser Scanning Mikroskopie, was den Nutzen der vaem bei der Aufdeckung von Echtzeit-Proteindynamik von Pflanzenzelloberflächen. GFP-PATROL1 Beobachtung ist nur ein Beispiel für vaem Anwendung im Pflanzen Zellbiologie. Vaem anwendbar wäre, um die Überwachung der zahlreichen Veranstaltungen in der dünnen Rindenschicht des Zytoplasma in Pflanzenzellen (zB Enzym-Sekretion in die Zellwandsynthese oder Änderung 11,12, Plasmamembran Proteindynamik 7,13,14, kortikalen Dynamik der Mikrotubuli 4, Umlagerung von Aktin Mikrofilamente 4,15 und Organellenbewegung 6). Eine breite Palette von Pflanzenzelle Wissenschaftler sollten tierenpassen von vaem Techniken.
Quantitative Bewertung der biologischen Bilddaten hat vor kurzem an Bedeutung gewinnen, durch Fortschritte in der Mikroskopausrüstung und Rechen angetrieben. Vaem Filmdaten enthalten, 512 (x) × 512 (y) × 600 (t) Pixel leicht in wenigen Minuten erreicht werden. Bildanalyse hilft nicht nur bei der Messung der Lebensdauer bzw. Bewegung eines fluoreszenzmarkierten Proteins, aber auch bei der Gewinnung von biologischen Informationen von großen, mehrdimensionaler Bilddaten. Ein kymograph ist ein einfaches, aber wertvoller, Ansatz zur Bestimmung Zielprotein Bewegung von vaem Filmdaten, wie von der sequentiellen Rekrutierung von Proteinen auf Plasmamembranen 2 gezeigt. Die kymograph erlaubt die Visualisierung der GFP-PATROL1 dots 'Verweilzeiten und ihrer geringen Beweglichkeit auf Plasmamembranen, wie in Abbildung 4 dargestellt. Umgekehrt hat ein kymograph Wirksamkeit für die Bewertung komplizierter Bewegungen, wie Plasmaströmung begrenzt. Weitere compliCated Bewegung, andere Bildanalyseansätze wie optischen Flusses 16 wäre hilfreich.
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Disclosures
Der Autor hat nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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