Summary
Målet med denne protokollen er å vise hvordan du kan overvåke fluorescently-merkede protein dynamikk på plantecelleoverflater med variabel vinkel epifluorescence mikroskopi, viser blinkende prikker av GFP-merket PATROL1, en membran trafficking protein, i cellen cortex av stomatal kompleks i Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Utarbeidelse av Seedlings
- Sterilisere frøene.
- Klargjør steriliseringsløsningen ved å tilsette 500 ul NaCIO (tilgjengelig klor: 5,0%) og 1 pl 10% Triton X-100 til 500 ul sterilt vann.
- Sted ca. 10 transgen A. thaliana frø bærer GFP-PATROL1 8 inn en 1,5 ml tube.
- Tilsett 1 ml 70% etanol-løsning og bland godt ved å snu fem ganger. Permisjon for 1 min.
- Observer frøene synke til bunnen av røret. I en ren laminær kabinett, forsiktig fjerne 70% etanol ved hjelp av en mikropipette, og tilsett 1 ml sterilisering løsning. Bland godt ved å vende fem ganger og la stå i 5 min.
- Vask frøene. Fortsatt arbeider under aseptiske forhold på en ren benk, fjern forsiktig løsning ved hjelp av en mikropipette, og tilsett 1 ml sterilt vann. Gjenta dette fem ganger. De steriliserte frøene kan bli lagret i sterilt vann ved 4 ° C i 2 dager.
- Såw de steriliserte frø på en 0,5% gellangummi-størknet 1/2 Murashige og Skoog medium plate (pH 5,8) 9. Tape lokket på platen ved hjelp av to lag av kirurgisk tape.
- Platen inkuberes i mørke ved 4 ° C med en kald lagringskammeret, O / N.
- Overfør platen inn i et vekstkammer innstilt på 23,5 ° C med en 12-h / 12-timers lys-mørke-syklus ved anvendelse av 100 mikromol m sek -2 -1 hvite lys, og inkuberes i 7 dager. Frøplanter med cotyledons på rundt 1 mm lange deretter kan høstes.
2. Sky Drop Montering av cotyledon Prøver
MERK: En viktig faktor i prøven forberedelse for VAEM observasjon er å unngå inkludering av luftbobler mellom prøven og dekkglass. Bubbles sterkt redusere bildekvaliteten VAEM ved å forårsake forskjeller i brytningsindeks. En enkel metode, som vi har kalt "sky drop" montasje, kan brukes for å unngå boblermellom A. thaliana cotyledons og dekkglasset. Dette bør gjøres umiddelbart før observasjon.
- Plassere 30 pl av basal-buffer [5 mM 2- (N -morpholino) -etansulfonsyre-Tris (MES-Tris) ved pH 6,5, 50 mM KCl, 100 mM CaCl 2] på midten av en glassplate (størrelse: 76 x 26 mm, tykkelse: 1,0 til 1,2 mm).
- Fjern en cotyledon fra en 7-dagers gammel frøplante hjelp dissekere saks. Flyt cotyledon med observasjonen siden som vender opp på basal buffer fallet (Figur 1, trinn 1).
- Plassere 30 pl av basal buffer på midten av et dekkglass (størrelse: 18 x 18 mm, tykkelse: 0,12 til 0,17 mm) (figur 1, trinn 2). Snu dekkglass opp ned forsiktig. Overflatespenningen vil hindre buffer slipp fra å falle av. Hold dekkglass med pinsett på en kant. Plasser den motsatte kanten på glass-slide, slik at bufferfallet er omtrent ovenfor cotyledon.
- Med kanten av dekkglasset fortsatt på sleiden, og fortsatt holder den motsatte kant med pinsett, justere plasseringen av bufferfallet under dekkglasset, slik at den er direkte over cotyledon prøven (figur 1, trinn 3). La gå av dekselet glass. Montere en dråpe på prøven som resulterer i et preparat uten luftbobler.
- Tørk av overflødig buffer ved hjelp lofri vev. Observere utarbeidelsen umiddelbart (se punkt 3).
MERK: Det er ikke nødvendig å forsegle prøvene.
3. VAEM Observasjon og Movie Acquisition
MERK: TIRF mikroskop system 9 som brukes i foreliggende undersøkelse er beskrevet som følger: En invertert mikroskop utstyrt med en TIRF enhet og en TIRF objektiv linse med en numerisk apertur på 1,49. For datastyrt kontroll av laserinnløpsvinkel, blir en kontrollboks som brukes. Grønt fluorescerende protein (GFP) er spent med en 488 nm optisk pumpet halvleder laser, og than fluorescens oppdages gjennom en 510-550 nm band-pass filter for å hindre autofluorescence fra kloroplaster. Den målte maksimale verdi av fiberutgangseffekt er 13,0 til 13,5 mW. For deteksjon, et elektron multiplisere CCD (EM-CCD) kamerahodet system og en C-mount kamera forstørrelse endring enhet brukes.
- Kalibrere laseren sentrering og fokus i henhold til produsentens instruksjoner.
MERK: Dette trinnet er avgjørende for presise VAEM observasjoner. Det anbefales sterkt at periodiske kontroller av laser banen justeringsprosedyrer, som passer til din mikroskop, blir utført.- Bestem sentral posisjon belyst med et objektiv fritt lysbanen på taket av mikros rommet. For å markere den sentrale posisjonen, sette en farget sirkel segl på taket (figur 2 trinn 1, 2).
- Belyse med et objektiv (Figur 2, trinn 3, 4) taket. Flytt jeglluminated region i midtstilling (Figur 2, trinn 5). Fokuser laser (Figur 2, trinn 6). Finjustere posisjonen til fokusert laser til sentrum (Figur 2, trinn 7).
- Still et eksemplar på scenen av mikroskopet og velg celler for observasjon ved hjelp av lyse felt belysning.
- Kontroller at den fluorescerende protein kan bli observert i cellene, og sette z -aksen posisjon på celleoverflaten ved hjelp av epifluorescens belysning (figur 3A).
- Utfør VAEM observasjoner.
- Helle innløpsvinkel av laserstrålen gradvis med styreenheten. På samme tid, overvåke det levende bildet nøye. I første omgang vil bildet bli uskarpt (figur 3B).
- Som laser vinkelen øker, vil VAEM bildet blir mindre uskarpt, slutt å produsere et klart bilde (Figur 3C og D). På dette punktet, stoppe increasynge laseren vinkel. Dersom det fluorescens-signalet går tapt, avta til en grunnere vinkel.
- Finjustere laser inngangsvinkel for å få et bedre bilde. Finjustering av z -akse stilling kan også forbedre bildet. Om nødvendig, juster de optiske parametre (laser makt, bølgelengde og filter sett) og image sensor parametre [bildestørrelse, eksponeringstid, gain, digitizer og elektron-multiplisere (EM) GAIN].
NB: I tilfelle av TIRF mikroskop utstyr som er beskrevet ovenfor, representative parameterne er som følger. Forstørrelse på objektivet bare foran kameraet: 2X; Laser-utgang: 1,0 mW; Bildestørrelse: 512 × 512 piksler; Eksponeringstid: 100 msek; Gevinst: 5 ×; Digitaliserer: 11 MHz; og EM gevinst: 100.
- Tilegne seg en film som en flersidig TIFF bildefil ved hjelp av den kommersielle mikroskop programvare. Her er filmen av GFP-merket prikker blinker på overflaten av stomatal celler.
MERK: Representative image oppkjøpet forholdene er som follows. Oppkjøpet Modus: Stream til RAM; Antall rammer: 600; og flersidig TIFF filstørrelse: ~ 302 MB.
4. Kymograph Analyse for Kvantifisering av GFP-merket Dot Residence Time Bruke Fiji programvare
- Installer Fiji ('Fiji er bare ImageJ') programvare 10 bruker forfatternes instruksjoner (http://fiji.sc/Fiji).
- Kjør Fiji og åpne kjøpt flersidig TIFF-fil ved hjelp av Fiji menyen "File-Open".
- Plasser en linje på stedet av interesse, ved hjelp av Fiji verktøylinjen menyen "Rett Linje Selection Tool". Eventuelt bruke "segmentert Linje Selection Tool" eller "frihåndslinje Selection Tool". I resultatene som er presentert her, er en rett linje på 100 bildepunkter (svarende til 8,0 mikrometer) plasseres på et datterceller (figur 4A).
- Lag en kymograph bilde ved hjelp av Fiji menyen "Image-Stacks-Dynamic Reslice (Figur 4B). Eventuelt "Vend vertikalt" og "Roter 90 grader" i en avkrysningsboks vindu er også tilgjengelig (ikke brukt i de resultatene som presenteres her). X- og y-aksen i kymograph bildet viser linjen stilling (100 piksler som tilsvarer 8,0 mikrometer) og observasjonstid (600 piksler som tilsvarer 60 sek), henholdsvis. Hvis kymograph bildet ikke er tilfredsstillende, posisjon og type (rett, segmentert og frihånd) av linjen på flersidig bilde kan bli endret. Som linjen endringer, dynamisk endrer kymograph bildet. Lagre en kymograph bildet som en TIFF-fil ved hjelp av Fiji menyen "File-Save As-Tiff".
- Måle lengden av klumpen i retningen av tidsaksen.
- For å utføre støyreduksjon, bruke en Gaussian filter til kymograph bilder ved hjelp av Fiji menyen "Process-Filter-Gaussian Blur". Den "Sigma (Radius) "parameter er tunbare (1 pixel radius brukes for de presenterte resultater).
- Segment signal regioner av terskel, ved hjelp av Fiji menyen "Image-Adjust-terskel".
MERK: Det er flere Terskelverdier algoritmer for å velge mellom. I presenterte resultater, ble det "Yen" algoritmen valgt (Figur 4C). - Forbered deg på å måle tiden (y) -akse lengden på blob å bruke menyen "Analyze-Set Målinger". Sjekk "Byks rektangel" i "Set Målinger" -vinduet. Ideelt området settet bør være så liten som mulig, for å utelukke støy. Her er minimumsområdet ble satt til 50 piksler. Mål tiden (y) -akse lengden på blob å bruke menyen "Analyze-Analyser Particles". For å oppnå resultatverdiene og bevise troverdighet av måle regioner, sjekk "Vis resultater" og "Legg til sjef </ em> "boksene.
- Verdier i "Høyde" -kolonnen er tiden (y) -aksen lengder for den målte blob (Figur 4D). Lagre verdiene ved å bruke menyen Resultater bordet "Fil-Lagre som" og beregne og behandle datasettet fra blob bildevarigheter ved hjelp av en statistikkpakke og / eller regneark programvare (figur 4E).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne videoen artikkelen, protokollene for VAEM observasjon av GFP-PATROL1 i A. thaliana cotyledon stomatal komplekse celler er gitt. Sky dråpe montering er en enkel fremstillingsmetode som kan bidra til å redusere forekomsten av luftbobler i VAEM preparater av A. thaliana cotyledons (figur 1). Overtilting av oppføringen laser og / eller z-posisjonering av prøver for VAEM vil gi et uklart bilde. Hvis det skjer, er det anbefalt å starte på nytt fra en posisjon rett over prøven, som bedømmes av epifluorescens belysning. Etter noen dagers erfaring med VAEM observasjon, bør det være mulig å skaffe VAEM filmer vellykket og rutinemessig, slik som den som vises her av GFP-PATROL1 dot blinke. Bruke kymograph analyse presentert i figur 4, oppholdstiden av 185 GFP-PATROL1 prikker fra 12 selvstendige datterselskaper celler i A. thaliana cotyledons ble målt. Montert tetthetFunksjonen viste at de fleste GFP-PATROL1 punkter var bosatt i et dattercelle for mellom 2 og 10 sekunder, med en topp på rundt 3,5 sek (figur 4E), noe som antyder raske exocytose / endocytose av protonpumper på dattercelleoverflaten.
Figur 1. Skjematisk av himmelen falle monteringsmetode. Trinn 1: Prøve Arabidopsis thaliana cotyledons er fløt på en dråpe basal buffer på et objektglass. Trinn 2: En dråpe av basal buffer dråpe er plassert på et dekkglass. Trinn 3: Dekkglasset med rulle er snudd opp ned og fallet er plassert over prøven på glass lysbilde. Trinn 4: Dekkglasset frigjøres og fallet faller på prøven. (Til toppen) fugleperspektiv. (Bottom) Lateral og forstørret bilde. Please klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kalibrering av laser sentrering og fokusering. Trinn 1: Den tomme posisjon mikroskopet revolveren er valgt for å sende laserlyset på taket over mikroskopet. Trinn 2: Den sentrale posisjon markeres ved hjelp av en farget sirkel segl på taket. Trinn 3: En objektiv er valgt. Trinn 4: Kontroller posisjon opplyst av laserlys gjennom objektivet. Trinn 5: Belysnings justeres til den markerte midtposisjonen. Trinn 6: Den laserlyset er fokusert. Trinn 7:. Det fokuserte laserlys flyttes til merket sentral posisjon Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Sammenligning av epifluorescens mikroskopi og variabel vinkel epifluorescens mikroskopi (VAEM). (A) Skjematisk fremstilling av lysbanen til laseren i epifluorescens mikroskopi. (B) Representant epifluorescens bilde av GFP-PATROL1 på cotyledon overflater i syv dager gamle frøplanter av Arabidopsis thaliana. Scale bar indikerer fem mikrometer. (C) Skjematisk fremstilling av lysbanen av laseren i VAEM. Merk at laseren inntreden er vippet, og det lyser prøven overflate med variabel dybde. (D) VAEM bilder av samme region som vist i (B). Scale bar indikerer fem mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kymograph analyse for å kvantifisere en GFP-PATROL1 dot residens tid. (A) VAEM bilde med en rett linje plassert for å gjøre en kymograph. Scale bar indikerer fem mikrometer. (B) En kymograph bilde langs linjen vist i (A). (C) Et binært bilde av (B), basert på Yen algoritme, generert på Fiji programvare. Gule linjer viser automatisk oppdages regionen GFP-PATROL1 signal. (D) Skjermbilde av resultater bordet i Fiji "Analyze Particles" -funksjonen. (E) Et histogram av GFP-PATROL1 dot sin oppholdstid i dattercellene. Den røde linjen viser tetthetsfunksjonen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne videoen artikkelen, protokoller gitt for overvåking og måling av dynamisk oppførsel av GFP-PATROL1 prikker på stomatal kompleks av Arabidopsis thaliana. Som vist her, er VAEM observasjon et kraftig verktøy for levende avbildning av plantecelleoverflater. Under de eksperimentelle betingelsene som ble benyttet her for GFP-PATROL1 overvåking, var det svært lite fluorescens fotobleking i prøven som brukes i 1 min for videoopptak, fordi den meget følsomme EM-CCD muliggjør bruk av en forholdsvis svak magnetisering laser i VAEM optikk. Laser sentrering og fokusering, før begynnelsen av hvert forsøk er viktig for vellykket VAEM observasjon. Brukerne bør få opplæring av profesjonelle medarbeidere fra den valgte mikroskop selskapet før du bruker VAEM.
VAEM avslører at GFP-PATROL1 har en dynamisk lokalisering med en immobile dot-lignende rommet blinker på plasmamembranen. De fluoresceinmerkede plasmamembranen protonpumpe AHA1 mis-localizes i patrol1 mutant vakt celler og dattercellene, som tidligere rapportert 8,9. Således kan VAEM-visualisert GFP-PATROL1 dot dynamikk representerer levering av protonpumpen inn i plasmamembranen. Denne dynamiske oppførsel av GFP-PATROL1 er vanskelig å visualisere ved hjelp av konvensjonelle galvanometeret speil-type konfokal laser scanning mikroskopi, som indikerer nytten av VAEM i avdekke sanntids protein dynamikk på plantecelleoverflater. GFP-PATROL1 observasjon er bare ett eksempel på VAEM programmet i plantecellebiologi. VAEM vil være gjeldende for overvåking av en rekke arrangementer i tynne kortikale lag av cytoplasma i planteceller (f.eks enzym sekretet i celleveggsyntese eller modifisering 11,12, plasma membran protein dynamikk 7,13,14, kortikale mikrotubulidynamikk 4, omorganisering av aktin microfilaments 4,15 og organbevegelse 6). Et bredt spekter av plantecelle forskere bør benepasser fra VAEM teknikker.
Kvantitativ evaluering av biologiske bildedataene har nylig blitt viktig, drevet av fremskritt i mikroskop utstyr og databehandling. VAEM filmdata som inneholder 512 (x) x 512 (y) x 600 (t) piksler kan lett skaffes i bare noen få minutter. Bildeanalyse bidrar ikke bare til måling av levetiden eller bevegelse av et fluorescensmerket-merket protein, men også i gruvedrift biologisk informasjon fra store, multidimensjonale bildedatasett. En kymograph er en grunnleggende, men verdifull metode for å fastsette målprotein bevegelse fra VAEM filmdata, som vist ved sekvensiell rekruttering av proteiner på plasmamembraner 2. Den kymograph tillot visualisering av GFP-PATROL1 dots "oppholdstider, og deres lave motilitet på plasmamembraner, som vist i figur 4. Motsatt, har en kymograph begrenset effektivitet for å evaluere mer kompliserte bevegelser, for eksempel cytoplasmisk streaming. For mer gratis fcated bevegelse, annet bildeanalyse tilnærminger slik som optisk flyt 16 vil være nyttig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Comparison of the dynamics and functional redundancy of the Arabidopsis dynamin-related isoforms DRP1A and DRP1C during plant development. Plant Physiol. 147 (4), 1590-1602 (2008).
- Fujimoto, M., et al. Arabidopsis dynamin-related proteins DRP2B and DRP1A participate together in clathrin-coated vesicle formation during endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (13), 6094-6099 (2010).
- Higaki, T., Sano, T., Hasezawa, S. Actin microfilament dynamics and actin side-binding proteins in plants. Curr. Opin. Plant Biol. 10 (6), 549-556 (2007).
- Rosero, A., Žársky, V., Cvrčková, F. AtFH1 formin mutation affects actin filament and microtubule dynamics in Arabidopsis thaliana. J. Exp. Bot. 64 (2), 585-597 (2013).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2 (11), 764-774 (2001).
- Konopka, C. A., Bednarek, S. Y. Variable-angle epifluorescence microscopy: a new way to look at protein dynamics in the plant cell cortex. Plant J. 53 (1), 186-196 (2008).
- Wan, Y., Ash, W. M., Fan, L., Hao, H., Kim, M. K., Lin, J. Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy of intact cells of Arabidopsis thaliana. Plant Methods. 7 (27), (2011).
- Hashimoto-Sugimoto, M., et al. A Munc13-like protein in Arabidopsis mediates H+-ATPase translocation that is essential for stomatal responses. Nat. Commun. 4, 2215 (2013).
- Higaki, T., Hashimoto-Sugimoto, M., Akita, K., Iba, K., Hasezawa, S. Dynamics and environmental responses of PATROL1 in Arabidopsis subsidiary cells. Plant Cell Physiol. 55 (4), (2014).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Chebli, Y., Kaneda, M., Zerzour, R., Geitmann, A. The cell wall of the Arabidopsis pollen tube-spatial distribution, recycling, and network formation of polysaccharides. Plant Physiol. 160 (4), 1940-1955 (2012).
- Fujimoto, M., Suda, Y., Vernhettes, S., Nakano, A., Ueda, T. Phosphatidylinositol 3-kinase and 4-kinase have distinct roles in intracellular trafficking of cellulose synthase complexes in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. 56 (2), 287-298 (2015).
- Li, X., Wang, X., Yang, Y., Li, R., He, Q., Fang, X., Luu, D. T., Maurel, C., Lin, J. Single-molecule analysis of PIP2; 1 dynamics and partitioning reveals multiple modes of Arabidopsis plasma membrane aquaporin regulation. Plant Cell. 23 (10), 3780-3797 (2011).
- Li, R., Liu, P., Wan, Y., Chen, T., Wang, Q., Mettbach, U., Baluska, F., Samaj, J., Fang, X., Lucas, W. J., Lin, J. A membrane microdomain-associated protein, Arabidopsis Flot1, is involved in a clathrin-independent endocytic pathway and is required for seedling development. Plant Cell. 24 (5), 2105-2122 (2012).
- Staiger, C. J., Sheahan, M. B., Khurana, P., Wang, X., McCurdy, D. W., Blanchoin, L. Actin filament dynamics are dominated by rapid growth and severing activity in the Arabidopsis cortical array. J. Cell Biol. 184 (2), 269-280 (2009).
- Ueda, H., et al. Myosin-dependent endoplasmic reticulum motility and F-actin organization in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (15), 6894-6899 (2010).
