Summary

Aislamiento y<em> Ex Vivo</em> Cultura de Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic

Published: December 07, 2015
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Summary

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Abstract

El timo, el órgano principal para la generación de células T delta gamma y columna vertebral del sistema inmune adaptativo en los vertebrados, ha sido considerado como la única fuente de células αβT. Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a una reducción de la producción de manera drástica de las células αβT ingenuos en la periferia. Sin embargo, incluso los centenarios pueden crear inmunidad contra patógenos recién adquiridas. Investigaciones recientes sugieren el desarrollo de células αβT extrathymic, sin embargo, nuestra comprensión de las vías que pueden compensar la pérdida de la función del timo son todavía rudimentario. células γδ T son linfocitos innatas que constituyen la principal subconjunto de células T en los tejidos. Recientemente nos atribuimos una función destacada hasta ahora poco apreciado a un γδ T subconjunto de células al mostrar que la entidad escasa de células CD4 + Vδ1 + γδ células T pueden transdiferenciarse en células αβT en condiciones inflamatorias. En este sentido, provide el protocolo para el aislamiento de este progenitoras de la sangre periférica y su cultivo posterior. Vδ1 células se enriquecen positivamente a partir de PBMCs de donantes humanos sanos, utilizando perlas magnéticas, seguido de una segunda etapa en la que nos dirigimos a la escasa fracción de células CD4 + con una técnica de etiquetado magnético más. La fuerza magnética del segundo etiquetado excede el de la primera etiqueta magnética, y por lo tanto permite el aislamiento positivo eficiente, cuantitativa y específica de la población de interés. Se introduce entonces la condición técnica y la cultura requerida para la clonación y eficientemente la expansión de las células y para la identificación de los clones generados por análisis FACS. Por lo tanto, ofrecemos un protocolo detallado para la purificación, la cultura y la expansión ex vivo de delta gamma células T CD4 + Vδ1 +. Este conocimiento es requisito indispensable para los estudios que se relacionan con este αβT progenitor`s celulares biología y para aquellos que pretenden identify los desencadenantes moleculares que intervienen en su transdiferenciación.

Introduction

En los vertebrados, la inmunidad adaptativa que se estructura en el celular y una parte de la inmunidad humoral desempeña un papel importante en la defensa contra patógenos. El reconocimiento de una amplia gama de antígenos está mediada por T- hyperpolymorphic y receptores de células B (TCR / BCR), que con respecto a las células T se supone que se produce principalmente en el timo 1. A esto, las células madre hematopoyéticas (HSC), derivadas de la médula ósea, el timo semillas y diferenciar a lo largo de las etapas bien definidas, finalmente, que dan lugar a todos los linajes de células T. Thymus progenitores siembra son CD4 y CD8 y por lo tanto constituyen la fracción de timocitos inmaduros, doble negación (DN). Señales derivadas del timo entonces inducen su compromiso linaje y la diferenciación en cualquiera de las células T delta gamma o delta gamma. La expresión de genes funcionalmente reordenados cadena TCR-gamma y TCR-delta en DN2 / 3 timocitos conduce a gamma δTCR complejos, que impulsan una proliferación celulard promover la diferenciación en células DT γ 2,3. En contraste, el reordenamiento de una cadena TCR-β funcional, que puede emparejarse con preTα para construir un preTCR pT, induce el silenciamiento transcripcional de la cadena TCR-γ en timocitos DN3 y su transición a CD4 + CD8 + doble positivas timocitos 4 . En esta etapa, la recombinación de la cadena TCR-α se produce, eliminar el locus TCR-δ que está ubicado dentro del locus TCR-α, abrogando así la producción de un γδTCR en estas células irrevocablemente 5-9. ΑβTCRs reordenados se seleccionan posteriormente por su capacidad para unirse a la auto-MHC débilmente (selección positiva), que no podrá exceder de un cierto umbral para evitar la autoinmunidad (selección negativa). De acuerdo con su capacidad de unión a MHC de clase I o II, las células αβT seleccionados se convierten en células CD4 + de un solo positivo o T CD8 +, que salga el timo los linfocitos T como ingenuos.

Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a la producción de forma exponencial reducido de células T ingenuas que es casi extinguido después de la adolescencia 10. Sin embargo, el tamaño del grupo de células T permanece constante durante toda la vida, lo que se explica sólo en parte por la proliferación homeostática post-timo de las células T y la proliferación de larga vida memoria inmunológica 11. En consecuencia, debe ocurrir extrathymic desarrollo de las células T. Investigaciones recientes han ganado atractivo importante que caracterizó progenitores de células αβT, que -al extrathymic sitios dieron origen al delta gamma funcional células T 12-17. Sin embargo, un conocimiento detallado de extrathymic precursores de células αβT que independiente de un timo diferenciarse en células αβT es tan fragmentaria como el fondo que tenemos en la ruta que toman los mismos.

Recientemente hemos identificado la pequeña entidad de células T de Vδ1 + </sup> células CD4 + γδT como un extrathymic prognitor celular αβT 18, que cuando se aislaron de sangre periférica de donantes humanos sanos pueden transdiferenciarse en células αβT en un entorno inflamatoria leve. Curiosamente y contrario a la proliferación homeostática de las células T post-tímicos, transdiferenciación de las células Vδ1 CD4 + genera nuevos receptores de células T, ampliando así la diversidad repertorio, por lo que potencialmente nuevos antígenos pueden ser reconocidos y puede protección del huésped contra los patógenos recién adquiridas. Esto se suma a la plasticidad de las células T y añade una nueva vía hasta ahora no apreciado para extrathymic desarrollo de células T.

El aislamiento cuantitativa de fuentes linfocítica, la generación de clones de células individuales y su expansión eficiente son esenciales para el objetivo de identificar a los marcadores y moléculas que desencadenan esta célula αβT precursor`s desarrollo extrathymic.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de Ética Clínica en la Universidad de Tubinga (proyecta 38 / 2009B02 y 470 / 2013B02). 1. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) Tome 50-100 ml de un voluntario sano a través de la punción venosa utilizando una jeringa de 50 ml que contiene 1.000 UI de heparina sulfato y diluir la sangre 1: 2 con PBS (pH = 7,2…

Representative Results

La Figura 1 representa las diferentes etapas y el resultado del aislamiento de células T Vδ1 partir de sangre periférica. La Figura 1A muestra una distribución típica de las células Vδ1 + en los linfocitos CD3 +, así como la expresión co-receptor de la población Vδ1 +. En este donante, la frecuencia de Vδ1 + células (rojo) es 2,3% de total de linfocitos y la expresión de CD4 (verde) de Vδ1 + linfocitos es 2,6%. En tot…

Discussion

Para estudiar el fenotipo, la biología y la función de una entidad de células escasas (T-), es decir, las células T CD4 + + Vδ1, se utilizaron dos marcadores: Vδ1 y CD4 para su aislamiento celular magnética positiva. Vδ1 es un receptor huérfano, mientras que CD4 se expresa en células T helper, a un nivel inferior en monocitos y células dendríticas, y en un nivel muy bajo en las células progenitoras hematopoyéticas.

Las técnicas para el enriquecimiento y la selecció…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.

Materials

Biocoll Solution Biochrom L 6113 lymphocyte separating solution
Lysing Buffer BD BioSciences 555899 lysis of erythrocytes 
Phosphate-buffered Saline Sigma Aldrich D8537 
MACS buffer Miltenyi Biotec 130-091-222 supplement with BSA and pre-cool before use
BSA Miltenyi Biotec 130-091-376 not mandatorily from this supplier
anti-human Vd1 FITC (clone:  TS8.2) Thermo Scientific TCR2730 not mandatorily from this supplier
anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) BD BioSciences 345766 not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) BD BioSciences 555548 not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466)  Miltenyi Biotec 130-097-333 not mandatorily from this supplier or this flurochrome
anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) BD BioSciences 641400 not mandatorily from this supplier or this flurochrome
Anti-FITC MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-058-701 yields better results than anti-FITC MicroBeads
MS columns Miltenyi Biotec 130-042-201 pre-cool before use
MiniMACS Separator Miltenyi Biotec 130-042-102
CD4 Positive Isolation Kit life technologies 11331D

References

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Cite This Article
Welker, C., Handgretinger, R., Schilbach, K. Isolation and Ex Vivo Culture of Vδ1+CD4+γδ T Cells, an Extrathymic αβT-cell Progenitor. J. Vis. Exp. (106), e53482, doi:10.3791/53482 (2015).

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