Aislamiento y<em> Ex Vivo</em> Cultura de Vδ1<sup> +</sup> CD4<sup> +</sup> Las células γδ T, una célula αβT Progenitor Extrathymic
Summary
Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral Vδ1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic αβ T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.
Abstract
El timo, el órgano principal para la generación de células T delta gamma y columna vertebral del sistema inmune adaptativo en los vertebrados, ha sido considerado como la única fuente de células αβT. Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a una reducción de la producción de manera drástica de las células αβT ingenuos en la periferia. Sin embargo, incluso los centenarios pueden crear inmunidad contra patógenos recién adquiridas. Investigaciones recientes sugieren el desarrollo de células αβT extrathymic, sin embargo, nuestra comprensión de las vías que pueden compensar la pérdida de la función del timo son todavía rudimentario. células γδ T son linfocitos innatas que constituyen la principal subconjunto de células T en los tejidos. Recientemente nos atribuimos una función destacada hasta ahora poco apreciado a un γδ T subconjunto de células al mostrar que la entidad escasa de células CD4 + Vδ1 + γδ células T pueden transdiferenciarse en células αβT en condiciones inflamatorias. En este sentido, provide el protocolo para el aislamiento de este progenitoras de la sangre periférica y su cultivo posterior. Vδ1 células se enriquecen positivamente a partir de PBMCs de donantes humanos sanos, utilizando perlas magnéticas, seguido de una segunda etapa en la que nos dirigimos a la escasa fracción de células CD4 + con una técnica de etiquetado magnético más. La fuerza magnética del segundo etiquetado excede el de la primera etiqueta magnética, y por lo tanto permite el aislamiento positivo eficiente, cuantitativa y específica de la población de interés. Se introduce entonces la condición técnica y la cultura requerida para la clonación y eficientemente la expansión de las células y para la identificación de los clones generados por análisis FACS. Por lo tanto, ofrecemos un protocolo detallado para la purificación, la cultura y la expansión ex vivo de delta gamma células T CD4 + Vδ1 +. Este conocimiento es requisito indispensable para los estudios que se relacionan con este αβT progenitor`s celulares biología y para aquellos que pretenden identify los desencadenantes moleculares que intervienen en su transdiferenciación.
Introduction
En los vertebrados, la inmunidad adaptativa que se estructura en el celular y una parte de la inmunidad humoral desempeña un papel importante en la defensa contra patógenos. El reconocimiento de una amplia gama de antígenos está mediada por T- hyperpolymorphic y receptores de células B (TCR / BCR), que con respecto a las células T se supone que se produce principalmente en el timo 1. A esto, las células madre hematopoyéticas (HSC), derivadas de la médula ósea, el timo semillas y diferenciar a lo largo de las etapas bien definidas, finalmente, que dan lugar a todos los linajes de células T. Thymus progenitores siembra son CD4 – y CD8 – y por lo tanto constituyen la fracción de timocitos inmaduros, doble negación (DN). Señales derivadas del timo entonces inducen su compromiso linaje y la diferenciación en cualquiera de las células T delta gamma o delta gamma. La expresión de genes funcionalmente reordenados cadena TCR-gamma y TCR-delta en DN2 / 3 timocitos conduce a gamma δTCR complejos, que impulsan una proliferación celulard promover la diferenciación en células DT γ 2,3. En contraste, el reordenamiento de una cadena TCR-β funcional, que puede emparejarse con preTα para construir un preTCR pT, induce el silenciamiento transcripcional de la cadena TCR-γ en timocitos DN3 y su transición a CD4 + CD8 + doble positivas timocitos 4 . En esta etapa, la recombinación de la cadena TCR-α se produce, eliminar el locus TCR-δ que está ubicado dentro del locus TCR-α, abrogando así la producción de un γδTCR en estas células irrevocablemente 5-9. ΑβTCRs reordenados se seleccionan posteriormente por su capacidad para unirse a la auto-MHC débilmente (selección positiva), que no podrá exceder de un cierto umbral para evitar la autoinmunidad (selección negativa). De acuerdo con su capacidad de unión a MHC de clase I o II, las células αβT seleccionados se convierten en células CD4 + de un solo positivo o T CD8 +, que salga el timo los linfocitos T como ingenuos.
Sin embargo, la involución del timo comienza temprano en la vida que conduce a la producción de forma exponencial reducido de células T ingenuas que es casi extinguido después de la adolescencia 10. Sin embargo, el tamaño del grupo de células T permanece constante durante toda la vida, lo que se explica sólo en parte por la proliferación homeostática post-timo de las células T y la proliferación de larga vida memoria inmunológica 11. En consecuencia, debe ocurrir extrathymic desarrollo de las células T. Investigaciones recientes han ganado atractivo importante que caracterizó progenitores de células αβT, que -al extrathymic sitios dieron origen al delta gamma funcional células T 12-17. Sin embargo, un conocimiento detallado de extrathymic precursores de células αβT que independiente de un timo diferenciarse en células αβT es tan fragmentaria como el fondo que tenemos en la ruta que toman los mismos.
Recientemente hemos identificado la pequeña entidad de células T de Vδ1 + </sup> células CD4 + γδT como un extrathymic prognitor celular αβT 18, que cuando se aislaron de sangre periférica de donantes humanos sanos pueden transdiferenciarse en células αβT en un entorno inflamatoria leve. Curiosamente y contrario a la proliferación homeostática de las células T post-tímicos, transdiferenciación de las células Vδ1 CD4 + genera nuevos receptores de células T, ampliando así la diversidad repertorio, por lo que potencialmente nuevos antígenos pueden ser reconocidos y puede protección del huésped contra los patógenos recién adquiridas. Esto se suma a la plasticidad de las células T y añade una nueva vía hasta ahora no apreciado para extrathymic desarrollo de células T.
El aislamiento cuantitativa de fuentes linfocítica, la generación de clones de células individuales y su expansión eficiente son esenciales para el objetivo de identificar a los marcadores y moléculas que desencadenan esta célula αβT precursor`s desarrollo extrathymic.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para estudiar el fenotipo, la biología y la función de una entidad de células escasas (T-), es decir, las células T CD4 + + Vδ1, se utilizaron dos marcadores: Vδ1 y CD4 para su aislamiento celular magnética positiva. Vδ1 es un receptor huérfano, mientras que CD4 se expresa en células T helper, a un nivel inferior en monocitos y células dendríticas, y en un nivel muy bajo en las células progenitoras hematopoyéticas.
Las técnicas para el enriquecimiento y la selecció…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Christian Welker is funded by a grant provided by the Jürgen-Manchot-Stiftung.
Materials
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F. Lymphocyte life-span and memory. Science. 265 (5177), 1395-1400 (1994).
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
