Abstract
胸腺，主机关αβT细胞和适应性免疫系统在脊椎动物的骨干的产生，长期以来被认为是αβT细胞的唯一来源。然而，胸腺衰退开始在生活中导致幼稚αβT细胞显着减少输出到外围月初。不过，甚至百岁老人可以增强免疫力对新收购的病原体。最近的研究表明，胸腺外αβT细胞发育，但我们途径的理解是可以补偿功能胸腺损失仍残留。 γδT细胞是构成该组织的主要T细胞亚群先天淋巴细胞。最近，我们通过展示一个冲高迄今赏识优秀功能于γδT细胞亚群的CD4的稀缺实体+Vδ1+γδT细胞能分化为αβT细胞在炎症条件。在这里，我们provide的协议这个祖细胞从外周血中分离和随后的培养。 Vδ1细胞是正从使用磁珠健康人供体的PBMC中富集，随后其中我们的目标CD4 +细胞与另一磁性标记技术的稀缺馏分的第二步骤。第二标记的磁力超过第一磁标签中的一个，并且因此允许感兴趣的人口的高效，定量和特定正隔离。然后我们引入所需克隆并有效地扩大了的细胞和用于识别所产生的克隆通过FACS分析的技术和培养条件。因此，我们提供了净化，文化和体外扩增的CD4 +Vδ1+γδT细胞的详细的协议。这方面的知识是前提，是涉及到这个αβT细胞progenitor`s生物学研究，并为那些谁的目标是IDEntify参与其转分化的分子触发器。
Introduction
在脊椎动物中，该构造中的细胞和免疫的体液部分适应性免疫起着抵御病原体是重要的作用。大范围的抗原的识别通过hyperpolymorphic T细胞和B细胞受体（TCR / BCR），这对于T细胞被假定为主要产生在胸腺1介导的。于此，造血干细胞（HSC），来源于骨髓，种子胸腺和分化沿良好定义阶段最后到所有T细胞谱系引起。胸腺播种祖细胞CD4 -和CD8 -从而构成不成熟，双阴性（DN）胸腺细胞部分。胸腺产生信号，然后诱使他们的后裔承诺，并分化成任何αβ或γδT细胞。在DN2 / 3胸腺功能性重排的TCR-γ和TCR-δ链基因的表达导致对γδTCR络合物，其中驱动细胞增殖的ð促进分化成γδT细胞2,3。与此相反，一官能的TCR-β链的重排，可以配对preTα构建preTCR PT，诱导DN3胸腺细胞的TCR的γ链的转录沉默和其过渡到的CD4 + CD8 +双阳性胸腺细胞4 。在这个阶段中，TCR-α链的重组发生，删除的TCR-δ基因座的TCR-α基因座内伫立，因而废除了生产γδTCR在这些细胞中不可撤销地5-9。重新排列αβTCRs随后选择其结合自MHC弱（阳性选择）的能力，这可能不超过一定的阈值，以避免自身免疫（阴性选择）。根据它们的结合MHC I类或II的容量，所选择的αβT细胞发育成的单阳性的 CD4 +或CD8 + T细胞，其出口胸腺作为幼稚T细胞。
然而，胸腺退化的生活导致幼稚T细胞的指数降低输出，几乎灭绝后青春期早期10开始。然而，T细胞池的大小保持整个生命，这只能在部分地由T细胞后胸腺稳态扩散和长寿命的免疫存储器 11中的扩散进行说明恒定。因此，胸腺外T细胞发育必须发生。最近的研究已经获得了大量的景点，其特征αβT细胞前体，其中，在胸腺外的网站，就产生了功能αβT细胞12-17。然而，关于胸腺外αβT细胞前体独立于胸腺分化成αβT细胞详细知识是作为局部的，我们有他们采取从而在路径上的背景。
我们最近发现Vδ1+小T细胞的实体+γδT细胞作为胸腺外αβT细胞prognitor 18，它从健康的人供体的外周血中分离时，可以分化为αβT细胞有轻度炎症的环境。有趣的是，违反后胸腺T细胞的稳态增殖，Vδ1CD4 +细胞转分化产生新的T细胞受体，从而扩大了剧目的多样性，从 而使潜在的新的抗原可以被识别，并且可以防止新收购的病原体的宿主。这增加了T细胞的可塑性，并增加了对胸腺外T细胞发育一个至今没有受到重视的新途径。
从淋巴细胞来源定量隔离，单细胞克隆的产生及其有效扩张是必不可少的，目标是鉴定那些触发此αβT细胞precursor`s胸腺外发育标记物和分子。
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Protocol
伦理声明：所有的程序进行，根据赫尔辛基宣言，并批准了临床伦理委员会，在图宾根大学（项目38 / 2009B02和470 / 2013B02）。
1.分离外周血单个核细胞（PBMC的）
- 取50-100毫升来自健康志愿者通过静脉穿刺使用50毫升注射器含有1000 IU的肝素硫酸盐和稀释血液1:2用PBS（pH值= 7.2）。
- 仔细层35毫升的血：15毫升血液中分离溶液的PBS溶液如Biocoll（D = 1.077克/毫升）的50毫升锥形管中。离心15分钟，在800×g离心在RT。
注：制动不能使用。 - 收集淋巴细胞层用吸管的细胞，并在至少50毫升的PBS洗细胞两次（离心12分钟;在400×g离心）。离心用吸管后，取出上清液。
- 裂解通过暂停和incub剩下的红细胞和使用本淋巴细胞馏分1-5毫升为2-4分钟低渗缓冲溶液。
注：曝光和裂解缓冲液的体积的持续时间取决于所使用的裂解缓冲液和对残留在淋巴细胞部分的红细胞数量。 - 稀释细胞用PBS（1:10）和离心机在250×g离心12分钟，随后重悬，并在300×g离心10毫升PBS洗涤细胞沉淀一次12分钟。
- 重悬在PBS的淋巴细胞和使用台盼蓝溶液细胞计数的Neubauer计数室。
注意：一般，> 1×10 8淋巴细胞从100 ml的接收新鲜抽取的外周血。
2.隔离Vδ1性T细胞
- 取<1×10 6个分离的淋巴细胞用于初始FACS确定Vδ1CD4 T细胞的频率。
注：此T-细胞实体的人口尺寸可以有很大的不同个体，并根据其免疫状态之间。 Typic同盟，约1％的T细胞是Vδ1+和大约1-5％Vδ1+细胞是CD4 +。- 稀释细胞用1ml FACS缓冲液，它由含2％FCS和5mM EDTA的PBS中。离心在660×g离心2分钟，倒出上清液。约100微升FACS缓冲液的回流体积足以用于随后的染色。简要地涡旋，并培育的细胞与5微升的Fc封闭试剂5分钟在RT的FACS染色的增加特异性。
- 直接向细胞中添加人单克隆抗体不除去的Fc封闭试剂。确保以染色细胞抗Vδ1（1:50），CD3（1:50），CD4（1：200），CD8（1：200）和TCRαβ（一点25）。制备同种型对照与对应的免疫球蛋白同种型。在黑暗中孵育细胞与抗体一起进行20分钟，在4℃。
- 在1毫升流式细胞仪缓冲洗涤细胞（离心2分钟，在660 XG），弃去supernatant并着手FACS收购剩余的缓冲区容量。
- 造粒的细胞（未在FACS分析中使用）离心12分钟;在300克; 8°C。除去上清液和重悬细胞pelletin每1×10 7个细胞加入60μlMACS缓冲液。添加每1×10 7个细胞20微升的Fc封闭试剂孵育5分钟，在4℃。
- 添加10微升FITC缀合的抗人Vδ1每1×10 7个细胞抗体直接细胞中。在黑暗中孵育12分钟，在4℃。
- 洗用7-14 ml的MACS缓冲液中的细胞（离心12分钟;在300克; 8℃）。完全弃上清，悬浮细胞每7×10单元80微升MACS缓冲。
- 取1-2×10 5细胞并稀释它们在100μlFACS缓冲液用于验证通过FACS分析的标记。都需要这个步骤没有进一步的添加剂。确保有一个suffi在亮度Vδ1cient差异-和Vδ1+细胞 。如果不是这种情况下，重复步骤2.3）和2.4）。
- 每1×10 7个细胞加入20微升抗FITC微珠到剩余的细胞搅匀，孵育在黑暗中15分钟，在4℃。此后，洗涤用至少10 ml的MACS缓冲液中的细胞（离心12分钟，在300×g离心8℃）。
- 在离心分离，达到平衡的预冷却的磁列放置在用500μlMACS缓冲液中的磁铁。
- 将细胞重悬于500μl的MACS缓冲液（用于细胞数高于1×10 8，扩大这个体积相应地），并小心地应用该细胞到柱上。收集流过的含Vδ1 -细胞。
- 用500μlMACS缓冲液洗柱三次，在同一管再次收集流过。需要注意的是水库必须将缓冲到列前空。
- 从磁性装置取出柱，并将其放置入15ml锥形管中。很快就被牢牢地推动活塞入列冲洗用1毫升MACS缓冲柱。收集管中的洗脱液。
注意：为了获得> 98％的纯度，通常需要重复步骤2.7-2.9）与第二列。 - 验证细胞的纯度通过FACS分析18具有相同的抗体面板之前（见2.1.2），并计数细胞。
3.隔离Vδ1CD4+ T细胞
- 重悬25微升的CD4珠用涡旋为> 30秒。通过将围成一个磁铁1分钟在1.5ml反应管洗在1ml MACS缓冲液珠（如所描绘由生产的最低量）。小心弃去上清液用小规模的吸移管（200微升），重悬珠子在MACS缓冲原始卷。
- 造粒Vδ1+细胞（离心12分钟;在300×g离心），并吸出上清，重悬所有Vδ1+细胞在500μlMACS缓冲液并将其添加到含有珠的管中。混合大力孵育20分钟，在4℃的恒定倾斜（例如，在旋转体）。
- 放置含有细胞中的磁铁，2分钟的管。确保有在盖子没有残余。
注：CD4 +细胞将已绑定磁珠并连接到面对磁体的管的一侧。 - 用一个小规模的吸管Vδ1+细胞-仔细打开盖子，同时保持该管的磁装置内，并收集包含CD4上清液。将CD4 - Vδ1+细胞到一个单独的管中，并把该管插入磁体再次以避免可能来自人口剩余的CD4细胞或珠。
- 一，在5毫升MACS缓冲细胞（300 XG离心12分钟） -洗CD4第二重悬它们在每100微升媒体1×10 5个细胞的浓度。的CD4 -细胞可以在下面（4·2）给出的条件下可以容易地培养。
- 放置管与磁场以外的CD4 +细胞的目标，重悬细胞在500μlMACS缓冲液，并把它们放回磁性装置。重复步骤3.3-3.5两次，以获得更高的纯度。通过移液除去上清液
- 重悬的CD4 +细胞在100μl培养基（RPMI 1640,10％FCS，1％L-谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素），加入珠分离溶液的10微升。在室温下孵育45分钟，恒定的倾斜（例如，在一个旋转器）。
- 放置细胞的磁铁1分钟。小心收集使用小型吸管含珠-自由Vδ1+ CD4 +细胞的上清液。
- 磁铁之外，悬浮用100微升培养基和重复珠步骤3.6和3.7倍，以获得CD4 +细胞的更高的细胞数。
- 造粒的细胞（离心，在300×g离心，12分钟），并通过移液完全丢弃上清液。悬浮细胞在新鲜，预热媒体和计数。检查Vδ1+ CD4 +细胞通过FACS分析在步骤2.1.1-2.1.3中描绘的纯度。
4.单细胞克隆有限稀释
- 隔离来自同种异体供体的外周血单核细胞（PBMC），为在1.1-1.6所示。
- 用γ射线照射2.5×10 7个同种异体PBMC中与80戈瑞在25毫升培养基中。
- 添加IL-2（200U / ml）的IL-7（20毫微克/毫升）和PHA（2微克/毫升），以照射饲养细胞和分发它们在96孔U字形板，5×10 4个饲养细胞以每孔50微升。
- 稀释Vδ1+ CD4 +细胞以每50μl0.3个细胞的浓度。吸取德50微升的细胞溶液以每孔窝藏照射细胞和细胞因子。
注：因此，细胞因子稀释至100U / ml的IL-2，10纳克/毫升的IL-7和1微克/毫升PHA的最终浓度。孵育96孔板在培养箱在37℃，5％CO 2的潮湿气氛中。- 可选，培育剩余的净化Vδ1+ CD4 +细胞批量培养相同的培养条件的克隆下。
- 供给细胞每3-4天用细胞因子和新鲜的培养基。对于这一点，在孔中加入50μl新鲜培养基通过移液培养基的交换一半。添加的细胞因子的2倍浓度，以每补充。加入每孔每隔一轮饲养的5×10 4照射的饲养层细胞。
- 利用显微镜，观察第一克隆成为3-4周后可见的，因为它们代谢，从而改变培养基和形态菌落的颜色。
注：对于皮草疗法培养，悬浮克隆井并将它们传送到单独的96孔板中。如2.1.1-2.1.3指示通过FACS分析细胞。克隆在这些条件下保持可能最终从Vδ1改变它们的TCR对αβTCR。此转分化的时间点，从克隆的克隆而异。
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Representative Results
图1描述了不同的阶段和Vδ1T细胞的分离自外周血的结果。 图1A示出 Vδ1+细胞的典型分布的 CD3 +淋巴细胞，以及Vδ1+群体的共受体的表达。在该供体，Vδ1+细胞 （红色）的频率为总淋巴细胞计数的2.3％和Vδ1+淋巴细胞的CD4表达（绿色）为2.6％。总而言之，目标人群隔离代表总淋巴细胞在这个供体的0.06％。 图1B示出了一个最佳的染色强度为Vδ1+细胞在进行到磁标记之前。与第一抗体染色应导致明显不同Vδ1 阴性和阳性 Vδ1种群使得Vδ1+细胞可以有效地标记，并与MAGN分离客位珠。 图1C描绘 Vδ1+细胞通过FACS分析分离过程之后。 Vδ1+的纯度，通常> 99％ 的 CD3 +细胞。以增加纯度，分离的细胞施加到第二隔离柱。这导致相当大的信元丢失然而此步骤导致定量消除潜在的污染TCRαβ+ CD4 +细胞。
的CD4 +隔离的结果示于图2中 。由于低数量的CD4 +Vδ1+细胞 ，并且由于细胞在一个有限稀释单细胞膨胀克隆的 CD4 +细胞的方法纯度低于100％可被容忍。在这里所示的实验中，Vδ1+ CD4 +细胞的纯度为约90％（图2A，右印迹）和随后的单细胞克隆，导致超过60Vδ1+ CD4 + T细胞克隆。反之，在Vδ1+ CD4 -分数没有CD4 +细胞保持（图2B），其中突出此隔离策略的效率。值得注意的是，CD4 +细胞（蓝色）表示Vδ1在一个可区别的水平低于的CD4 -细胞（红色）（图2A，既印迹）。因此，Vδ1+细胞染色必须过量所描述的协议为Vδ1+ T细胞的池内的CD4 +馏分的足够的标签和成功分离。
在图3A中，一个新兴的克隆的表型典型呈现。该TCR由Vδ1和Vγ9链和克隆细胞的表达的CD3和CD4。 图3B示出了一个克隆分离所呈现的技术的转分化的过程。转分化包括downregulati上V'1链到低表达水平，这是由从头表达的αβTCR的平行的。这导致一个瞬变的TCR-双阳性表型，最终产生了单正αβTCR表达T细胞。共受体表达也可转的过程中发生变化。类似胸腺细胞，一个CD4 + CD8 +表型的DP，可能会发生，最终发展成两种SP 的 CD4 + 或 CD8 +αβT细胞。在这里介绍的培养条件下，转分化是一种罕见的事件，只有三分之一的50个克隆改变了他们的Vδ1+ TCR为αβTCR。
图1.流式细胞仪分析监测了Vδ1T细胞分离过程的所有阶段，从外周血（A </ STRONG>）分布Vδ1+细胞 （红色），外周血淋巴细胞及其共受体的表达CD3 +细胞 。 CD4 +Vδ1+细胞显示为蓝色（圆圈）。 （B）在进行磁标记之前Vδ1馏分染色。 （ 三）流式细胞仪的Vδ1分离后+阳性部分的细胞分析。数字表示门控细胞的百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. FACS第Vδ分析1 的 CD4 +株（A）中的CD4 +馏分 和 （B）的CD4 -分数后CD4 +细胞分离。数字表示门控细胞的百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。
检测之后有一克隆的图3的表型分析。（A）一种新鲜分离的克隆的TCR的组合物和共同受体的表达。 Vδ1和Vγ9TCR是共表达用CD3和CD4。转了CD4 +Vδ1+克隆（B）的过程。更改TCR表达（上图），以及共受体的表达（下）18的变化。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
研究一种稀缺（T-）细胞实体的表型，生物学和功能，即Vδ1+ CD4 + T细胞中，我们使用两个标记：Vδ1和CD4其正磁性细胞分离。 Vδ1是孤儿受体，而CD4表达于T辅助细胞，在单核细胞和树突状细胞一个较低的水平，并在对造血祖细胞非常低的水平。
对于细胞高纯度的浓缩和选择的技术包括荧光激活细胞分选（FACS），分隔细胞转化为基于荧光标记亚群的人口的技术。细胞用荧光团标记的抗体染色的可以从彼此分离取决于哪个荧光团（），他们已绑定上。分拣机可以实现纯度接近98％19中，如果只必要性分拣本身，这是有用的。这种技术的缺点包括排序的细胞显示细胞VI下降能力，并在我们的目标人群也为transdifferention降低的潜力。排序后减小的细胞活力被假设是由于剪切力和流体力学应力，该FACS强加于细胞。此外，为了保持细胞活力，没有污染的后续培养，实验应以无菌无菌条件下是很难管理。此外，FACS分选建议选高数字的单元格。
分离试剂盒已经开发了从若干公司的直接磁标记和细胞根据多个表面标记排序。他们的策略通过使用释放试剂，它或者酶促或竞争性地移除从结构的磁性标签到它已绑定依赖于除去来自第一排序后的细胞中的磁性标记的。这允许第二磁性标签和细胞分离为感兴趣塔的另一表面标记t通过使用直接或间接标记磁珠来实现。去除标签的建议在低温下工作（在冰上，在2-8℃）长时间，暴露于化学和重复洗涤步骤。如果第二参数分离的靶细胞存在于选择（<10％的靶细胞在第一次分离后的正级分）后的低浓度，即使进行第二轮除去ofany残留磁标记的细胞是必要的。此过程是-除了具有靶细胞的大量损失由于反复洗涤步骤，在高风险的诱导因机械和生理应激细胞损伤和功能丧失。用FACS分拣相比然而细胞制剂保持无菌和更小的细胞数进行排序。
我们追求的战略结合了两个连续执行积极的选择，但除去第一个标签不需要为m个由几个日志相的磁性力的大小agnetic标签不同。而第一抗荧光磁标记珠型小，具有的直径为50纳米，该第二抗 - 荧光染料磁标记珠型措施1至4.5微米，从而超过所述第一磁性标签20的该卷/强度90倍。此外，第二正排序省略细胞应激，即与磁性柱保留/释放相关联作为单元保持在一个1.5 ml的小瓶中被放置在一个磁性装置，以便将标记的细胞附着到所述小瓶的所述壁。洗涤程序可保持在小范围内。这阐述了协议减少了细胞的损失，增加细胞活力，因为细胞经历更少的操作，并通过分离过程的速度比使用multisort分离试剂盒系统的协议。
因此，该协议允许以分离甚至少数细胞与另一个优点：分选的细胞保持STE激怒整个过程。使用有限稀释随后克隆实验允许分离的细胞，个别成员的有效扩张这里十分稀少Vδ1+ CD4 +γδT细胞实体18。排序细胞表现出优异的活力和克隆形成并保持充分发挥作用。
对于未来的应用中，使用这种策略来定量地选择并成功地从不同的人为来源包括新鲜抽取外周血净化小T细胞实体，（动员）白细胞分离产品，脐带血和骨髓通过使用不同的磁性标记结合两个连续进行积极的选择以它们的磁力大小，从而保持能力。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
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