Abstract
Timus, αβ T hücreleri ve omurgalılarda adaptif bağışıklık sisteminin omurgasının oluşturulması için primer organ uzun αβT hücrelerinin tek kaynak olarak kabul edilmiştir. Ancak, timik involüsyon çevresine naif αβT hücrelerinin büyük ölçüde azalır çıkış lider hayatında erken başlıyor. Yine de, hatta asırlık yeni alınan patojenlere karşı bağışıklık inşa edebilirsiniz. Son araştırmalar fonksiyonunun timus kaybını telafi edebilir yolların ancak bizim anlayış hala rudimental olan extrathymic αβT hücre gelişimini göstermektedir. γδ T hücreleri dokularda temel T-hücresi alt kümesi oluşturur doğuştan lenfositlerdir. Biz son zamanlarda göstererek bir γδ T hücre alt kümesine bir şimdiye kadar farkedilmemiş seçkin işlevi atfedilen o CD4 kıt varlık + Vδ1 + γδ T hücreleri inflamatuar koşullarda αβT hücrelerin içine transdifferentiate olabilir. Burada, biz pperiferik kandan bu dede izolasyonu ve sonraki ekimi için protokol rovide. Vδ1 hücreleri pozitif bir başka manyetik işaretleme tekniği ile CD4 + hücrelerinin az kısmını hedef olup, burada, bir ikinci aşamada, ardından manyetik boncuklar kullanılarak Sağlıklı insan donörlerden bir PBMC'lerden zenginleştirilmiştir. İkinci etiketleme manyetik kuvvet ilk manyetik etiket biri aşıyor ve bu nedenle faiz nüfusunun, verimli nicel ve belirli olumlu izolasyonu sağlar. Daha sonra hücreler, klonlama ve verimli bir şekilde genişletilmesi için ve FACS analizi ile üretilmiştir klonlarının tespiti için gerekli olan teknik ve kültür durum getirmektedir. Böylece, saflaştırma, kültür ve CD4 + Vδ1 + γδ T hücrelerinin ex vivo artışı için detaylı bir protokol sağlar. Bu bilgi, bu αβT hücre progenitor`s biyoloji ile ilgili çalışmalara ve ide amaçlayan olanlar için ön koşuldurBunu transdiferansiyonun yer alan moleküler tetikler ntify.
Introduction
Omurgalılarda, hücresel ve bağışıklığın bir hümoral bölümünde yapılandırılmıştır adaptif bağışıklık patojenlere karşı savunmasında önemli bir rol oynar. Antijenleri geniş bir tanıma, T hücreleri ile ilgili olarak timus 1 esas olarak üretilecek varsayılır hyperpolymorphic T ve B hücresi reseptörlerinin (TCR / BCR), aracılık eder. Bunun üzerine, kemik iliğinden elde edilen hematopoetik kök hücrelerin (HSC), timus tohum ve nihayet tüm T hücre soyları sebebiyet veren iyi tanımlanmış aşamaları boyunca ayırt. Ve CD8 - - Thymus ekim atalarıdır CD4 ve böylece olgunlaşmamış, çift negatif (DN) timosit kısmını oluşturmaktadır. Thymus türetilmiş sinyaller daha sonra soy bağlılığı ve αβ veya γδ T hücrelerinin içine ya farklılaşmasını teşvik. DN2 / 3 timositlerde fonksiyonel olarak yeniden düzenlenmiş TCR-γ ve TCR-δ zincir genlerinin sentezlenmesi selüler proliferasyon, bir sürücü δTCR kompleksleri, y olan yol açarγ ¨t hücrelerine 2,3 içine farklılaşmasını teşvik d. Buna karşılık, bir preTCR pT oluşturmak için preTα eşleştirmeden işlevsel TCR-β zincirinin yeniden düzenlenmesi, transkripsiyon DN3 timositlerde TCR-γ zincirinin susturulması ve CD4 + CD8 + çift pozitif timositleri 4 içine geçiş indükler . Bu aşamada, TCR-α zincirinin rekombinasyon ve böylece, bu hücrelerin geri dönülmez 5-9 üretim, bir γδTCR ortadan kaldıran, TCR-α lokusundaki sırtını TCR-δ lokusunu silme oluşur. Rearranged αβTCRs sonradan otoimmünitesini (negatif seçim) önlemek için belirli bir eşiği geçemez zayıf (pozitif seçimi) öz-MHC bağlanma yetenekleri için seçilir. MHC sınıf I veya II bağlama kapasitelerine göre, seçilen αβT hücreler tek-pozitif CD4 + veya CD8 + T hücreleri, timus çıkış naif T hücreleri dönüşür.
Ancak, timus involusyonu erken neredeyse söndürülmüş sonrası ergenlik 10 naif T hücrelerinin katlanarak azaltılmış çıkış yol açan yaşam başlar. Bununla birlikte, T hücresi havuzunun büyüklüğü sonrası timik homeostatik T hücrelerinin çoğalması ve uzun ömürlü immünolojik bellek 11 proliferasyonu ile sadece kısmen açıklanabilir ömrü boyunca sabit kalır. Sonuç olarak, T-hücresi gelişimi extrathymic gerçekleşmelidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar-de extrathymic fonksiyonel αβ T hücrelerinin 12-17 yol siteleri-verdi αβT hücre atalarıdır, karakterize önemli cazibe kazanmıştır. Oysa, bir timus bağımsız αβT hücrelerine ayırt extrathymic αβT hücre öncüleri hakkında detaylı bilgi biz onlar böylece almak güzergahı üzerinde olan arka plan olarak bölük pörçük olduğunu.
Biz son zamanlarda Vδ1 + küçük T-hücre varlık tespit 18 olarak CD4 + γδT hücreleri. İlginç bir şekilde ve potansiyel olarak yeni antijenler kabul edilebilir, böylece bu şekilde, repertuarı genişleyen çeşitlilik sonrası timik T hücrelerinin proliferasyonu homeostatik, Vδ1 CD4 + hücrelerinin transdiferansiyonun yeni T hücre reseptörleri üreten, aksine ve koruma olabilir yeni alınan patojenlere karşı konakçı. Bu T hücrelerinin plastisite ekler ve extrathymic T hücre gelişimi için şimdiye kadar farkedilmemiş yeni yolu ekler.
Amaç bu αβT hücresi extrathymic gelişimini precursor`s tetikleyen işaretleri ve molekülleri tanımlamak için lenfositik kaynaklardan niceliksel izolasyonu, tek hücre klonlarının oluşturulması ve etkin genişletme gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyanı: Tüm işlemler Helsinki Bildirgesi uyarınca yürütüldü ve Tübingen Üniversitesi'nde Klinik Etik Komitesi tarafından kabul edildi (38 / 2009B02 ve 470 / 2013B02 projeler).
Periferal Kan Tek Çekirdekli Hücreleri 1. izolasyonu (PBMC)
- 1000 IU heparin sülfat içeren 50 ml'lik şırınga kullanarak venipunktür yoluyla sağlıklı bir gönüllüden 50-100 ml alın ve kan sulandırmak 1: PBS (pH = 7.2) 2.
- 15 ml kan ayırma çözeltisi üzerine PBS çözeltisi gibi Biocoll olarak (d = 1.077 g / ml), 50 ml konik bir tüp içinde: dikkatlice kan 35 ml katman. Oda sıcaklığında 800 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj.
NOT: Fren kullanılmamalıdır. - Bir pipet ile lenfositik tabakanın hücreleri toplamak ve en az 50 ml PBS içerisinde iki kez yıkama hücreleri (400 x g'de 12 dakika boyunca santrifüj). Bir pipet ile santrifüj sonra süpernatantı.
- Lyse askıya alınması ve inkubasyon suretiyle eritrositler kalan2-4 dakika boyunca, bir hipotonik tampon çözeltisi 1-5 ml lenfositik kısmını bir başlatma.
Not: maruz kalma ve liz tampon maddesi hacmi süresi kullanılan parçalama tamponu ve lenfosit fraksiyonunda kalan kırmızı kan hücrelerinin miktarına bağlıdır. - 12 dakika boyunca 250 xg'de PBS (01:10) ile hücreler ve santrifüj seyreltilir ve daha sonra tekrar süspansiyon ve 12 dakika boyunca 300 x g'de 10 ml PBS içinde bir kez hücre pelletini yıkayın.
- PBS içinde yeniden süspanse lenfositleri ve tripan mavi bir solüsyon kullanımıyla bir Neubauer sayım odası içinde hücreleri sayın.
NOT: Genellikle,> 1 x 10 8 lenfositler 100 ml alınan taze periferik kan çekilmiş.
Vδ1 T hücreleri 2. İzolasyon
- Vδ1 CD4 T hücrelerinin frekansı belirleyen bir ilk FACS <1 x 10 6 izole edilen lenfositlerin al.
NOT: Bu T-hücresi varlığın Nüfus büyüklüğü bireylere ve onların immünolojik durumuna göre arasında büyük farklılık gösterebilir. Typically, T hücrelerin yaklaşık% 1 Vδ1 + ve Vδ1 + hücreleri, yaklaşık% 1-5 olan CD4 + 'dır.- PBS,% 2 FCS ve 5 mM EDTA içeren oluşur 1 ml FACS tamponu ile hücreleri seyreltilir. 2 dakika süreyle 660 xg'de Santrifüj ve süpernatant süzün. 100 ul FACS tampon akış hacmi daha sonraki boyama için yeterlidir. Kısaca bir girdap ve 5 ul FACS boyaması etkisi arttığından, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca reaktifi Fc bloke ile hücrelerin inkübe edin.
- Fc bloke edici tepkin madde çıkartılmadan direkt olarak hücrelere insan monoklonal antikor ekleyin. , CD8 (1: 200) ve TCRαβ (01:25): Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (200 1) karşı antikorlar ile hücrelerin leke emin olun. Karşılık gelen immünoglobulin izotipleri ile izotip kontrolü hazırlayın. Karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika boyunca antikorlar ile inkübe hücreleri.
- (2 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 660 xg) 1 ml FACS tampon maddesi içinde hücrelerin yıkayın, Süpernatant, süzünatant ve kalan tampon hacminde FACS edinimi geçin.
- 12 dakika boyunca santrifüj ile (FACS analizi kullanılmaz) hücreler topaklaşmasına; 300 g; 8 ° C. Süpernatantı ve 1 x 10 7 hücre başına 60 ul MACS-tamponu pelletin hücreyi tekrar süspansiyon. 1 x 10 7 hücre başına 20 ul Fc bloke edici tepkin madde ekleyin ve 4 ° C'de 5 dakika inkübe edilir.
- Şirketinden hücrelere 1 x 10 7 hücre başına 10 ul FITC-konjüge anti-insan Vδ1 antikor ekleyin. Karanlıkta 4 ° C'da 12 dakika kuluçkalayın.
- 14 ml MACS-tamponu kullanılarak hücre yıkayın (12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 300 g, 8 ° C). Tamamen Süpernatant atın ve 1x10 7 hücre başına 80 ul MACS tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon.
- 1-2 x 10 5 hücre almak ve FACS analizi ile etiketleme doğrulanması için 100 ul FACS tampon maddesi içinde seyreltilmesi. Daha başka katkı maddeleri, bu aşama için ihtiyaç vardır. Bir taşıdıkları risklerle olduğundan emin olunVδ1 için parlaklık cient farkı - ve Vδ1 + hücreler. Bu durumda değilse, tekrar) 2.3) ve 2.4 adımları tekrarlayın.
- Geri kalan hücreler 1 x 10 7 hücre başına 20 ul anti-FITC mikroboncukları ekleyin, iyice karıştırın ve 4 ° C de karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, (300 x g'de, 12 dakika boyunca santrifüje tabi tutulur; 8 ° C), en az 10 ml MACS tamponu ile yıkama hücreleri.
- Santrifüj sırasında, 500 ul MACS tamponu ile bir mıknatıs yerleştirilen önceden soğutulmuş bir manyetik sütun dengeye.
- (Hücre sayıları daha yüksek 1 x 10 8 bu hacim buna göre büyütmek) 500 ul MACS-tampon hücreleri yeniden süspanse ve kolona dikkatle hücreleri geçerlidir. Vδ1 içeren flow-through toplayın - hücrelerini.
- 500 ul MACS tamponu ile sütun üç kez yıkayın ve aynı tüp içinde tekrar flow-through toplamak. Rezervuar kolona tampon uygulamadan önce boş olması gerektiğini unutmayın.
- Manyetik cihazdan sütun çıkarın ve 15 ml konik tüp içine yerleştirin. Hızlı bir şekilde sıkı bir şekilde sütuna pistonu iterek 1 ml MACS tamponu ile kolonu temizlemek. Bir tüp içinde eluat toplayın.
NOT:>% 98 bir saflığa elde etmek için, genellikle tekrar için gerekli olan ikinci bir sütun ile) 2.7-2.9 adımları tekrarlayın. - (2.1.2 bakınız) eskisi gibi antikor paneli ile FACS analizi 18 ile hücrelerin saflığını doğrulayın ve hücreleri saymak.
Vδ1CD4 + T hücrelerinin 3. İzolasyon
- > 30 saniye boyunca bir vorteks CD4 boncuk 25 ul yeniden süspanse edin. 1 dakika boyunca mıknatıs tüp yerleştirilmesi ile, 1.5 ml reaksiyon tüpünde 1 ml MACS tamponu boncuk (üretici tarafından gösterildiği gibi az miktarda) yıkayın. Küçük ölçekli bir pipet (200 ul) ile dikkatlice süpernatant atın ve MACS-tampon orijinal hacminin boncuk tekrar süspansiyon.
- 1 için Vδ1 + hücreleri (santrifüj topaklaşmasına2 dk; ve) 300 xg'de süpernatant aspirat ve 500 ul MACS-tamponu tüm Vδ1 + hücreleri tekrar süspansiyon ve boncuk içeren tüp ekleyebilirsiniz. Kuvvetli bir şekilde karıştırın ve (bir rotatör içine örneğin) sabit bir eğimlenme 4 ° C'de 20 dakika inkübe edilir.
- 2 dakika için bir mıknatıs hücreleri ihtiva eden tüp yerleştirin. Kapaktaki hiçbir kalıntıları olmadığından emin olun.
Not: CD4 + hücreleri manyetik taneler bağlanmış ve mıknatısın bakan tüp yan eklemek olacaktır. - Bir küçük ölçekli pipet kullanarak Vδ1 + hücreler - dikkatle manyetik cihazın içindeki tüpü tutarak kapağı açın ve CD4 içeren süpernatant toplamak. Ayrı bir tüp içine Vδ1 + hücreleri ve nüfus CD4 hücreleri veya boncuk kalan muhtemelen önlemek için tekrar cazibe merkezi haline bu tüp yerleştirmek - CD4 yerleştirin.
- CD4 yıkayın - hücreleri, 5 ml MACS tamponu içinde (santrifüj 12 dakika boyunca, 300 xg da) and 100 ul ortam başına 1 x 10 5 hücre konsantrasyonunda bunları tekrar süspansiyon. CD4 - hücreler hali hazırda (4.2) aşağıda belirtilen koşullar altında kültive edilebilir.
- , Manyetik alanın dışında CD4 + hücre hedefleri ile tüp koyun 500 ul MACS-tamponu hücrelerin tekrar süspansiyon ve manyetik cihazın içine geri koydu. Tekrarlayın daha yüksek bir saflık elde etmek için iki kez 3.3-3.5 adımları tekrarlayın. Pipetleme süpernatantı
- 100 ul kültür ortamı CD4 + hücreleri (RPMI 1640,% 10 FCS,% 1 L-glutamin,% 1 Penisilin / Streptomisin) yeniden süspanse edin ve bir boncuk-ayırma çözeltisi 10 ul ekle. Sabit devirme (örneğin, bir rotatör içinde) ile birlikte 45 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- 1 dakika süre ile bir mıknatıs hücreleri yerleştirin. Dikkatle küçük ölçekli bir pipet kullanarak boncuk ücretsiz Vδ1 + CD4 + hücreleri içeren süpernatant toplamak.
- Mıknatıs dışında, 100 ul kültür ortamı ve tekrar ile boncuklar tekrar süspansiyonCD4 + hücrelerinin yüksek hücre sayıları elde etmek için iki kez 3.6 ve 3.7 adımları tekrarlayın.
- Hücreleri pellet'leştirilmesi (12 dakika boyunca, 300 xg'de santrifüj) ve pipetleme tamamen süpernatant atın. Taze, önceden ısıtılmış medya hücrelerin tekrar süspansiyon ve onları saymak. 2.1.1-2.1.3 adımda tasvir, FACS analizi ile Vδ1 + CD4 + hücrelerinin saflığı inceleyin.
Sınırlı seyreltme ile 4. Tek hücreli Klonlama
- 1.1-1.6 tasvir edildiği gibi, bir allojenik donor periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) izole edilir.
- Γ-ışını kullanılan 25 ml kültür ortamı içinde 80 Gy ile 2.5 x 10 7 allojeneik PBMC'ler ışın tedavisi.
- , 96 oyuklu U-şekli plakalarında 5 x 10 4 besleyici bunları ışınlanmış besleyici hücreler IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) ve PHA (2 ug / ml) ilave edin ve dağıtma oyuk başına 50 ul hücre.
- 50 ul başına 0,3 hücre konsantrasyonuna Vδ1 + CD4 + hücreleri ile seyreltilir. Pipette her bir oyuğa ışınlanmış hücreleri ve sitokinler barındıran hücre çözeltisi 50 ul.
NOT: Bu nedenle, sitokinler 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 ve 1 ug / ml PHA nihai konsantrasyona kadar seyreltilir. 37 ° C'de,% 5 CO2 nemlendirilmiş atmosfer içinde, bir kuluçka makinesi içinde, 96 gözlü levhalar inkübe edin.- İsteğe bağlı olarak, klonlar aynı kültür koşulları altında dökme kültürü olarak Vδ1 + CD4 + hücreleri üzerinde saflaştırılmıştır kalan geliştirin.
- Sitokinler ve taze medya ile her 3-4 günde hücre kaynağı. Bunun için, pipetleme ile 50 ul taze ortam ile kuyu ortamın değişimi yarısı. Her takviyesine sitokinlerin 2 kat konsantrasyon ekleyin. Beslenme de her tur başına 5x10 4 ışınlanmış besleyici hücreler ekleyin.
- Kültür ortamı ve form kolonilerinin rengini değiştirmek böylece metabolize olarak, ilk klon 3-4 hafta sonra görünür hale gözlemlemek ve bir mikroskop kullanarak.
NOT: kürk içinther ekimi, iyi klon tekrar süspansiyon ve bunları, 96 gözlü levhalar ayrı aktarın. 2.1.1-2.1.3 belirtildiği gibi FACS yoluyla hücreleri analiz edin. Bu şartlar altında tutulmuştur klonlar nihayetinde αβTCR için Vδ1 kendi TCR değişebilir. Bu transdiferansiyonun için zaman noktası klonlamak için klon değişir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1, farklı aşamaları ve periferal kandan Vδ1 T hücrelerinin izolasyonu sonucunu göstermektedir. Şekil 1A, CD3 + lenfositler, Vδ1 + hücrelerinin tipik dağılımı, hem de Vδ1 + popülasyonunun ko-reseptör ifadesini gösterir. Bu donör olarak Vδ1 + hücreleri (kırmızı) sıklığı toplam lenfosit sayımları% 2.3 ve Vδ1 + lenfositlerin CD4 ifadesi (yeşil)% 2.6 olduğunu. Tamamen, izolasyon için hedef nüfusu bu donörden toplam lenfositlerin% 0.06 temsil etmektedir. Şekil 1B manyetik etiketleme geçmeden önce Vδ1 + hücreleri için optimum boyama yoğunluğunu gösterir. Vδ1 + hücreleri verimli bir şekilde etiketlenmiş ve Magn ile ayrılabilir, böylece birincil antikor ile boyanarak belirgin bir şekilde farklıdır Vδ1 negatif ve pozitif Vδ1 popülasyonunda sonuçlanmalıdıretik boncuklar. Şekil 1C FACS analizi ile izolasyon işleminden sonra Vδ1 + hücreleri gösteriyor. Vδ1 + saflığı CD3 + hücreleri, genellikle>% 99'dur. Saflığını arttırmak için, izole edilmiş hücrelerin, ikinci bir yalıtım kolonuna uygulanır. Önemli hücre kaybına Bu sonuç, ancak bu potansiyel TCRαβ + CD4 + hücreleri kirlenmesine neden kantitatif ortadan kaldırılması açar adımları.
CD4 + izolasyon sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Nedeniyle hücreleri CD4 + hücrelerinin yaklaşımı saflık klonlama sınırlı seyreltme tek hücre içinde genişletilmiş çünkü CD4 + Vδ1 + hücreleri ve% 100 den az olabilir düşük numaralara tolere edilebilir. Burada gösterilen deney, Vδ1 + CD4 + hücrelerinin saflığı olan yaklaşık% 90 (Şekil 2A, sağ blot) ve daha sonra tek hücreli bir klonlama fazla 60 Vδ1 sonuçlandı+ CD4 + T hücre klonları işaret etmektedir. Aksine, Vδ1 + CD4 - kısmıyla hiçbir CD4 + hücreler bu izolasyon stratejisinin etkinliğini vurgulamaktadır (Şekil 2B) kalmıştır. Dikkat çekici bir şekilde, CD4 + hücreleri (mavi), CD4 daha ayırt daha düşük bir düzeyde eksprese Vδ1 - hücreler (kırmızı) (Şekil 2A, iki blotlar). Bu nedenle, Vδ1 + hücrelerinin boyanması, aşırı-olarak tarif edilen protokole hazır Vδ1 + T hücresi havuzu içinde CD4 + fraksiyonunun yeterli bir etiketleme ve başarılı izolasyon olmalıdır.
Şekil 3A'da, gelişmekte olan bir klon tipik fenotipi gösterilmiştir. TCR bir Vδ1 ve Vγ9 zinciri ve klonal hücrelerin CD3 ve CD4. Şekil 3B sunulan tekniği ile izole edilen tek klon transdiferansiyonun sürecini gösteriyor ifade oluşur. Transdiferansiasyon downregulati içerirBir αβTCR de novo ifadesi ile paralellik düşük anlatım düzeyine V'1 zincir üzerinde. Bu sonuçta, tek-pozitif αβTCR eksprese eden T hücreleriyle yol açan geçici bir TCR-Çift pozitif fenotipe yol açar. Ko-reseptör ekspresyonu da transdiferansiyonun süresince değişebilir. Timositlerde benzer şekilde, bir CD4 +, CD8 + DP fenotipi sonunda SP CD4 + veya CD8 + T hücreleri, ya αβ içine geliştirir meydana gelebilir. Burada sunulan kültür koşulları altında, transdiferansiasyon αβTCR içine Vδ1 + TCR değişti nadir bir olay-tek 50 klonların çıktı.
Şekil 1. FACS periferik kandan V δ1 T hücrelerinin izolasyonu sürecinin tüm aşamalarını takip analizleri. (A </ periferal kan lemfositleri ve bunların ko-reseptör ifade CD3 + hücrelerinde Vδ1 + hücrelerinin (kırmızı güçlü>) Dağılım). CD4 + hücreleri, mavi Vδ1 + (daire) olarak gösterilir. Manyetik etiketleme geçmeden önce Vδ1 fraksiyonunun (B) Boyama. Vδ1 izolasyondan sonra pozitif fraksiyonun hücrelerin + (C) FACS analizi. Sayılar Geçitli hücrelerin yüzdesini gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
. Fraksiyonu - Şekil 2. FACS V ö analizleri 1 CD4 + (A) CD4 + fraksiyonu, ve (B) CD4 izoleCD4 + hücre izolasyonu sonra. Sayılar Geçitli hücrelerin yüzdesini gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hemen tespit edildikten sonra bir klonun Şekil 3. fenotipik analizi. (A) taze izole klonun TCR kompozisyonu ve ko-reseptör ekspresyon. Vδ1 ve Vγ9 TCR CD3 ve CD4 ile birlikte ifade edilir. Bir CD4 + Vδ1 + klonu transdiferansiyonun (B) işlem. TCR ifade (üstte) ve eş-reseptör ekspresyonu (alt) 18 değişim değiştirme. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pozitif manyetik hücre izolasyonu için Vδ1 ve CD4: kıt (T-) hücre varlığın fenotip, biyoloji ve işlevini incelemek için, yani Vδ1 + CD4 + T hücreleri, iki işaret kullanılır. CD4 monositler ve dendritik hücreler üzerinde daha düşük bir seviyede, T yardımcı hücreleri üzerinde ifade edilen ve hematopoietik progenitör hücreler üzerindeki çok düşük bir seviyede, oysa Vδ1, yetim reseptörüdür.
Yüksek saflıkta hücrelerin zenginleştirilmesi ve seçim teknikleri floresan hücre sıralama (FACS), flüoresan etiketleme göre alt gruplara hücrelerden oluşan bir popülasyonu ayıran bir teknik aktif içerir. Fluorofor-konjuge antikor kullanılarak boyanmış hücreler bir başka hangi fluorofor (ler) bağlı olması bağlı olarak bir ila ayrılabilir. Seçmeler tek gereklilik kendini sıralama ise yararlıdır% 19 98 yakın saflık elde edebilirsiniz. Bu tekniğin dezavantajları sıralanan hücreler, hücre vi bir azalma olduğunu göstermektedir içeriryetenek ve hedefimiz de nüfus transdifferention için azaltılmış potansiyeli. Sıralama sonra bir azalma hücre canlılığı kesme kuvvetleri ve FACS hücreleri üzerine yüklediği hidrodinamik strese bağlı olduğu varsayılmaktadır. Ayrıca, canlı ve sonraki kültür için kirlenme olmadan hücreleri korumak için, deney yönetmek zor aseptik steril şartlarda yapılmalıdır. Buna ek olarak, FACS ayıklama hücrelerin yüksek miktarda önermektedir.
İzolasyon Kitleri doğrudan manyetik etiketleme ve çoklu yüzey belirteçleri göre hücrelerin sıralama için çeşitli firmalardan geliştirilmiştir. Onların stratejisi ya enzimatik ya da rekabetçi hangi bağlıydı yapı manyetik etiket kaldıran bir sürüm ayıracı kullanarak ilk sıralama sonra hücrelerden manyetik etiket kaldırılması üzerine dayanır. Bu ilgi tha başka yüzey işaretleyici için ikinci bir manyetik etiketleme ve hücrelerin ayrılmasına izin verirt, manyetik boncuklar ile doğrudan veya dolaylı olarak etiketleme kullanılarak elde edilir. Etiketin uzaklaştırılması, zaman içerisinde, bir kimyasala maruz kalma ve tekrarlanan yıkama adımları için (2-8 ° C de, buz üzerinde) düşük sıcaklıklarda çalışmak önerir. İkinci parametre ayırma hedef hücreler artık manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin ofany çıkarılması için daha ikinci tur seçimi (birinci ayırma sonrası pozitif fraksiyonunda <% 10, hedef hücreler) sonra düşük konsantrasyonda mevcut olması durumunda gereklidir. Bu prosedür-yanında hedef hücrelerin önemli bir kayıp olan nedeniyle tekrarlanan yıkama adımları-sebebiyle mekanik ve fizyolojik stres hücresel hasar ve fonksiyon kaybı uyarmak için yüksek risk. Sıralama FACS ile karşılaştırıldığında ancak hücre preparatları steril kalır ve küçük hücre sayıları sıralanabilir.
Biz takip stratejisi iki ardışık idam olumlu seçimleri birleştiren, ancak ilk etiketin çıkarılması m olarak gerekli değildiragnetic etiketler birkaç günlük evreleri ile manyetik güçlerin büyüklüğü farklıdır. Boncuk tipi manyetik etiketli birinci anti-florokrom 50 nm'lik bir çapa sahip küçük olsa da, ikinci anti florokrom, böylece birinci manyetik etiketin 20 hacmi / gücünü çıkıldığında, boncuk tipi ölçer 1 ila 4.5 um arasında manyetik olarak etiketlenmiş 90-kat. Buna ek olarak, ikinci pozitif sıralama hücre stres atlar hücrelerin etiketli hücreler şişenin duvarına bitişik olacak şekilde, bir manyetik cihaz konur, bir 1.5 ml'lik bir viyal içinde kaldığı sürece, manyetik kolon tutma / serbest bırakılması ile ilişkilidir. Yıkama işlemleri küçük ölçekte tutulabilir. Bu protokol, hücre kaybını azaltır ve hücreler daha az manipülasyon deneyim ve Multisort izolasyon kiti sistemlerini kullanarak protokolleri daha hızlı izolasyon işlemini geçmesi beri hücre canlılığı artırır geliştirdiler.
Sonuç olarak, bu protokol, daha küçük bir hücre sayısı ve başka bir avantaj ayrı sağlar: kriteri hücreler ste kalırişlem boyunca çözündürülür. Sınırlayıcı seyreltme kullanılarak sonradan klonlama deneyleri burada izole hücrelerin, bireysel üyelerin verimli genişlemesi çok kıt Vδ1 + CD4 + T hücre γδ varlık 18 verir. Sıralama hücreler mükemmel canlılığı ve clonogenicity göstermek ve tamamen işlevsel kalır.
Gelecekteki uygulamalar için nicel seçin ve başarıyla taze çekilmiş periferik kanda dahil çeşitli insan kaynaklarından küçük T hücre varlıkları arındırmak için bu stratejiyi kullanın, (mobilize) lökaferez ürünleri, farklı manyetik etiketler kullanarak iki ardışık gerçekleştirilen olumlu seçimleri birleştirerek kordon kanı ve kemik iliği manyetik kuvvetler büyüklük ve böylece tutma kapasitesine göre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
