Abstract
התימוס, האיבר העיקרי לייצור תאי T αβ ועמוד השדרה של המערכת החיסונית אדפטיבית בבעלי חוליות, כבר מזמן נחשב כמקור היחיד של תאי αβT. ובכל זאת, לפוף הרתי מתחיל מוקדם בחיים מובילים לתפוקה מופחתת באופן דרסטי של תאי αβT נאיביים לפריפריה. עם זאת, גם בני מאה יכולה לבנות חסינות מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. המחקרים אחרונים מצביעים פיתוח תא αβT extrathymic, אולם ההבנה שלנו של מסלולים שעשויות לפצות על אובדן הרתי של פונקציה עדיין rudimental. תאי T γδ הם לימפוציטים מולדים המהווים תת-הקבוצה T-cell העיקרי ברקמות. לאחרונה ייחסו פונקציה מצטיינת עד כה שלא מעריכים לקבוצת משנה תא T γδ ידי מראה כי הישות נדירה של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T יכולים transdifferentiate לתאי αβT במצבים דלקתיים. כאן, אנו עמ 'rovide הפרוטוקול לבידוד של אב זה מהדם היקפי והטיפוח הבא שלה. תאי Vδ1 מועשרים באופן חיובי מPBMCs של תורמים אנושיים בריאים באמצעות חרוזים מגנטיים, ואחריו שלב שני שבו אנו ממקדים את החלק יחסי הנדירים של תאי CD4 + עם טכניקת תיוג מגנטית נוספת. הכוח המגנטי של התיוג השני עולה על אחד מהתווית המגנטית הראשונה, ובכך מאפשר את הבידוד החיובי יעיל, כמותי וספציפי של האוכלוסייה של עניין. לאחר מכן, אנו מציגים את מצב הטכניקה והתרבות הנדרש לשיבוט וביעילות הרחבת התאים ולזיהוי של השיבוטים שנוצרו על ידי ניתוח FACS. לפיכך, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לטיהור, התרבות והרחבת vivo לשעבר של CD4 + Vδ1 + γδ תאי T. ידע זה הוא תנאי הכרחי ללימודים הקשורים לביולוגיה progenitor`s תא αβT זה ועבור מי ששואף לאיידntify גורמים המולקולריים המעורבים בtransdifferentiation.
Introduction
בבעלי חוליות, חסינות אדפטיבית שבנויה בסלולרי וחלק הלחות של חסינות משחקת תפקיד מרכזי בהגנה מפני פתוגנים. ההכרה במגוון רחב של אנטיגנים מתווך על ידי T-hyperpolymorphic וקולטני תא B (TCR / BCR), אשר ביחס לתאי T הם הניחו להיות מיוצרים בעיקר בבלוטת התימוס 1. לכך, תאי גזע hematopoietic (HSCs), הנגזרים ממח עצם, זרע התימוס ולהבדיל לאורך שלבים מוגדרים היטב לבסוף והוליד את כל שושלות תאי T. אבות זריעת התימוס הם CD4 - וCD8 - ובכך מהווים את חלק thymocyte לא בוגר, שלילי כפול (DN). אותות נגזר התימוס אז לגרום למחויבות שושלת היוחסין שלהם ובידול לאו תאי T αβ או γδ. הביטוי של גני שרשרת תפקודית משוחלפים TCR-γ וTCR-δ בDN2 / 3 thymocytes מוביל לγ מתחמי δTCR, אשר כונן תרבות תאיםd לקדם בידול לתאי δT γ 2,3. לעומת זאת, הארגון מחדש של שרשרת TCR-β פונקציונלי, שיכול להתאים עם preTα לבנות PT preTCR, גורם להשתקת תעתיק של שרשרת TCR-γ בthymocytes DN3 ומעברם לthymocytes CD4 + CD8 + כפול החיובי 4 . בשלב זה, רקומבינציה של שרשרת TCR-α מתרחשת, מחיקת מוקד TCR-δ שמקנן בתוך מוקד TCR-α, וכך בביטול הייצור γδTCR בתאים אלה באופן בלתי הפיך 5-9. αβTCRs מחדש נבחר לאחר מכן ליכולתם להיקשר עצמי MHC חלש (בחירה חיובית), אשר לא תעלה על סף מסוים, כדי למנוע אוטואימוניות (סלקציה שלילית). על פי יכולתם של מחייב כיתת MHC I או II, תאי αβT נבחרו להתפתח לאחד חיובי מסוג CD4 + או CD8 + T תאים, שיציאת התימוס תאי T נאיביים כ.
עם זאת, לפוף של התימוס מתחיל מוקדם בחיים המובילים לתפוקה מופחתת באופן אקספוננציאלי של תאי T הנאיביים שהיא פוסט-התבגרות כמעט כבויה 10. עם זאת, בגודל של בריכת תא T נשאר קבוע לאורך כל חיים, שיכול להיות מוסבר רק בחלקו על ידי התפשטות פוסט-הרתי homeostatic של תאי T וההתפשטות של זיכרון חיסוני הארוך חי 11. כתוצאה מכך, חייבת להתרחש התפתחות תאי T extrathymic. מחקר שנערך לאחרונה צבר משיכה משמעותית שאפיינה את אבות תא αβT, אשר-בextrathymic אתרים-הולידו αβ התפקודי תאי T 12-17. עם זאת, ידע מפורט על מבשרי תא αβT extrathymic שעצמאיים מהתימוס להתמיין לתאי αβT הוא מקוטע כמו הרקע שיש לנו במסלול שהם לוקחים ובכך.
לאחרונה זיהו את ישות תא T הקטנה של Vδ1 + + γδT כprognitor extrathymic αβT תא 18, שכאשר מבודדים מהדם היקפי של תורמים אנושיים בריאים יכול transdifferentiate לתאי αβT בסביבה דלקתית קלה. מעניין ובניגוד לתרבות הומיאוסטטית של תאי T פוסט-הרתי, transdifferentiation של Vδ1 CD4 + תאים מייצר קולטנים תא T חדשים, ובכך להרחיב את מגוון הרפרטואר, כך שיכולים להיות מוכרים אנטיגנים חדשים פוטנציאלי והוא רשאי הגנת המארח מפני פתוגנים חדשים שנרכשו. זה מוסיף לגמישות של תאי T ומוסיף עד כה שלא מעריך את מסלול חדש לפיתוח תא T extrathymic.
בידוד כמותית ממקורות ימפוציטית, הדור של שיבוטים תא בודד וההרחבה היעילה שלהם הם חיוניים למטרה לזהות את אותם סמנים ומולקולות המפעילים תא αβT זה precursor`s פיתוח extrathymic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת מוסר: כל הנהלים בוצעו בהתאם להצהרת הלסינקי ואושרו על ידי ועדת האתיקה הקלינית באוניברסיטת טובינגן (פרויקטי 38 / 2009B02 ו470 / 2013B02).
1. בידוד של תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMCs)
- קח 50-100 מ"ל ממתנדב בריא באמצעות venipuncture באמצעות מזרק 50 מיליליטר מכיל 1,000 סולפט הפרין IU ולדלל את הדם 1: 2 עם PBS (pH = 7.2).
- שכבה בזהירות 35 מיליליטר של הדם: פתרון PBS על פתרון הפרדת 15 מיליליטר דם כגון Biocoll (ד = 1.077 גרם / מיליליטר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 800 XG ב RT.
הערה: אין להשתמש בבלם. - לאסוף את התאים של שכבת ימפוציטית עם טפטפת ולשטוף את התאים פעמיים בלפחות 50 מיליליטר PBS (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 400 XG). הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה עם טפטפת.
- Lyse נותר אריתרוציטים ידי השעיית וincubating חלק ימפוציטית עם 1-5 מיליליטר של תמיסת חיץ hypotonic במשך 2-4 דקות.
הערה: משך החשיפה והנפח של lysing חיץ תלוי בחיץ lysing משמש ועל כמות תאי דם אדומים שנשארו בחלק הלימפוציטים. - לדלל את התאים עם PBS (01:10) וצנטריפוגות ב 250 XG דקות 12 ולאחר מכן resuspend ולשטוף את התא גלולה פעם אחת ב 10 מיליליטר PBS ב XG 300 דקות 12.
- Resuspend לימפוציטים בPBS ולספור את התאים בתא ספירת נויבאואר באמצעות Trypan פתרון כחול.
הערה: בדרך כלל,> 1 x 10 8 ימפוציטים מתקבלים מ-100 מיליליטר טרי נמשכת דם היקפי.
2. בידוד של תאי T Vδ1
- קח <1 x 10 6 ימפוציטים מבודדים לFACS ראשוני קביעת התדירות של תאי CD4 T Vδ1.
הערה: גודל אוכלוסייה של ישות T-cell זה עשוי להיות שונה מאוד בין אנשים ובהתאם למצב החיסוני שלהם. Typicברית, כ -1% מתאי T הם Vδ1 + ועל 1-5% מVδ1 + התאים CD4 +.- לדלל את התאים עם 1 מיליליטר FACS חיץ, אשר מורכב מPBS FCS המכיל 2% ו 5 מ"מ EDTA. צנטריפוגה ב 660 XG למשך 2 דקות ולמזוג supernatant. ריפלוקס הנפח של חיץ FACS על 100 μl מספיק לצביעה לאחר מכן. בקצרה מערבולת דגירה התאים עם 5 μl FC-חסימה מגיב במשך 5 דקות על RT עבור סגוליות מוגבר של הכתמת FACS.
- להוסיף נוגדנים חד שבטיים אנושיים ישירות לתאים מבלי להסיר את חסימה מגיב-FC. הקפד להכתים את התאים עם נוגדנים נגד Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) וTCRαβ (01:25). הכן את שליטת אלוטיפ עם isotypes אימונוגלובולינים המקביל. דגירה תאים עם נוגדנים במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף את התאים במאגר FACS מיליליטר 1 (צנטריפוגות במשך 2 דקות, ב660 XG), למזוג supernatant ולהמשיך לרכישת FACS בנותר חיץ הנפח.
- Pelletize התאים (שאינם משמשים בניתוח FACS) על ידי צנטריפוגה דקות 12; ב300 גרם; 8 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ו resuspend תא pelletin 60 μl MACS-חיץ לכל 1 x 10 7 תאים. הוסף 20 מגיב חסימה-FC μl לכל 1 x 10 7 תאי דגירה במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 10 μl נוגדן Vδ1 אנטי אנושי FITC- מצומדות לכל 1 x 10 7 תאים ישירות לתאים. דגירה של 12 דקות על 4 מעלות צלזיוס בחושך.
- לשטוף את התאים באמצעות 14 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב 300 גרם; 8 מעלות צלזיוס). בטל supernatant לחלוטין וresuspend תאי חיץ MACS 80 μl ל1x10 7 תאים.
- קח 1-2 x 10 5 תאים ולדלל אותם במאגר FACS 100 μl לאימות של התיוג על ידי ניתוח FACS. אין תוספים נוספים נדרשים לצעד זה. ודא שיש suffiהבדל מספיק בבהירות לVδ1 - ותאי Vδ1 +. אם זה לא המקרה, חזור על שלבים 2.3) ו -2.4).
- להוסיף microbeads אנטי FITC 20 μl לכל 1 x 10 7 תאים לתאים הנותרים, ומערבב היטב דגירה במשך 15 דקות בחושך על 4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים באמצעות לפחות 10 חיץ MACS מיליליטר (צנטריפוגות במשך 12 דקות, ב XG 300; 8 מעלות צלזיוס).
- במהלך צנטריפוגה, לאזן את העמודה המגנטית מקורר מראש להציב מגנט עם חיץ MACS 500 μl.
- Resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ (למספרים סלולריים גבוהה יותר מאשר 1 x 10 8, בהיקף של עד נפח זה בהתאם) ולהחיל את התאים בזהירות על הטור. לאסוף את הזרימה דרך מכיל Vδ1 - תאים.
- לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם 500 μl MACS-חיץ ולאסוף את הזרימה דרך שוב באותו הצינור. שים לב שהמאגר חייב להיות ריק לפני יישום חיץ על הטור.
- הסר את העמודה מהמכשיר המגנטי ולמקם אותו לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר. מהירות לשטוף את העמודה עם חיץ MACS 1 מיליליטר בתוקף דוחף את הבוכנה לתוך הטור. לאסוף את eluate בצינור.
הערה: על מנת לקבל טוהר> 98%, זה בדרך כלל צורך לחזור על שלבים 2.7-2.9) עם עמודה שנייה. - ודא את הטוהר של התאים על ידי ניתוח FACS 18 עם אותו פנל הנוגדנים כמו קודם (ראה 2.1.2) ולספור את התאים.
3. בידוד של תאי Vδ1CD4 + T
- Resuspend 25 μl של חרוזים CD4 עם מערבולת ל> 30 שניות. שטוף את החרוזים (הסכום המינימאלי כמתואר על ידי היצרן) בחיץ 1 מיליליטר MACS בצינור 1.5 מיליליטר תגובה על ידי הנחת הצינור לאבן שואבת ל1 דקות. בטל supernatant בזהירות עם פיפטה בקנה מידה קטנה (200 μl) וresuspend חרוזים בנפח המקורי של MACS-חיץ.
- Pelletize Vδ1 + תאים (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300) ולשאוב supernatant ו resuspend כל Vδ1 התאים + ב500 μl MACS-חיץ ולהוסיף אותם לצינור המכיל את החרוזים. מערבבים נמרצות ודגירה של 20 דקות ב 4 ° C עם הטיה קבועה (למשל, במסובב).
- מניחים את הצינור המכיל את התאים במגנט למשך 2 דקות. ודא שאין שאריות במכסה.
הערה: תאי CD4 + תהיה מחויבים חרוזים המגנטיים ולצרף לצד של הצינור מול המגנט. - לפתוח בזהירות את המכסה תוך שמירה על הצינור בתוך המכשיר המגנטי ולאסוף את supernatant המכיל CD4 - Vδ1 + תאים בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה. הנח CD4 - Vδ1 + תאים לתוך צינור נפרד ומניח הצינור הזה לתוך המגנט שוב כדי למנוע אולי נותרו תאי CD4 או חרוזים מהאוכלוסייה.
- שטוף את CD4 - תאים ב 5 מיליליטר MACS-חיץ (צנטריפוגות במשך 12 דקות; ב XG 300)ND resuspend אותם בריכוז של 1 x 10 5 תאים לכל 100 מדיה μl. CD4 - תאים יכולים להיות מתורבתים בקלות בתנאים כדלקמן (4.2).
- מניחים את הצינור עם מטרות תאי CD4 + מחוץ לשדה המגנטי, resuspend תאי 500 μl MACS-חיץ ולשים אותם בחזרה לתוך המכשיר המגנטי. חזור על שלבים 3.3-3.5 פעמיים כדי להשיג טוהר גבוה יותר. הסר supernatant ידי pipetting
- Resuspend CD4 + התאים בתקשורת ותרבות 100 μl (1640 RPMI, FCS 10%, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין / סטרפטומיצין) ולהוסיף 10 μl של פתרון ניתוק-חרוז. לדגור על RT עבור 45 דקות עם הטיה קבועה (למשל, במסובב).
- מניחים את התאים במגנט דקות 1. לאסוף בזהירות את supernatant המכיל תאים + CD4 + ללא חרוז Vδ1 בעזרת פיפטה בקנה מידה קטנה.
- מחוץ למגנט, resuspend חרוזים עם תקשורת ותרבות 100 μl וחזורצעדים 3.6 ו -3.7 פעמיים כדי לקבל מספרים סלולריים גבוהים יותר של תאים מסוג CD4 +.
- Pelletize התאים (צנטריפוגות ב 300 XG, דקות 12) וזורקים supernatant לחלוטין על ידי pipetting. Resuspend תאים בתקשורת טרי, מחוממת מראש ולספור אותם. לבחון את טוהר של Vδ1 + CD4 + התאים על ידי ניתוח FACS המתואר בצעדי 2.1.1-2.1.3.
4. תא בודד שיבוט על ידי דילול מוגבל
- בודד תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מתורם אלוגנאית כמתוארים ב1.1-1.6.
- להקרין 2.5 x 10 7 PBMCs אלוגנאית עם 80 Gy בתקשורת ותרבות 25 מיליליטר באמצעות γ-קרינה.
- להוסיף IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) וPHA (2 מיקרוגרם / מיליליטר) לתאים מזינים המוקרנים ולהפיץ אותם ב96-גם צלחות U-צורה, 5 x 10 4 מזין תאים ב -50 μl בכל טוב.
- לדלל את תאי Vδ1 + CD4 + לריכוז של 0.3 תאים לכל 50 μl. Pipette 50 μl של פתרון התא לכל מחסה גם תאים וציטוקינים המוקרנים.
הערה: כך, ציטוקינים הם בדילול לריכוז הסופי של 100 IL-2, 10 ng / ml PHA מיליליטר U / IL-7 ו 1 מיקרוגרם / מיליליטר. דגירה צלחות 96-היטב בחממה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 אווירת humidified.- לחלופין, לטפח נותר מטוהר Vδ1 + CD4 + תאים כתרבות בתפזורת באותם תנאי התרבות כמו השיבוטים.
- לספק את התאים כל 3-4 ימים עם ציטוקינים ותקשורת טריות. לשם כך, מחצית חילופי הבינוני בבארות עם 50 בינוני μl טרי על ידי pipetting. להוסיף ריכוז פי 2 של ציטוקינים לכל תוספת. להוסיף 5x10 4 תאים מזינים המוקרנים לכל גם כל סיבוב של האכלה אחרת.
- באמצעות מיקרוסקופ, להתבונן השיבוטים הראשונים הפכו גלויים לאחר 3-4 שבועות, כפי שהם חילוף חומרים ובכך לשנות את הצבע של המושבות בינוני תרבות וצורה.
הערה: לפרווהטיפוח יס, resuspend השיבוטים היטב ולהעביר אותם להפריד 96-גם צלחות. נתח את התאים באמצעות FACS כפי שצוין ב2.1.1-2.1.3. שיבוטים המשיכו בתנאים אלה עלולים סופו של דבר לשנות את TCR שלהם מVδ1 לαβTCR. הנקודה לtransdifferentiation זה הזמן משתנה משיבוט לשבט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 1 מתאר את השלבים השונים ואת התוצאה של הבידוד של תאי T Vδ1 מהדם היקפי. איור 1 א מציג התפלגות טיפוסית של Vδ1 + תאים לימפוציטים בCD3 +, כמו גם ביטוי שיתוף קולט של אוכלוסיית Vδ1 +. בתורם זה, תדירות Vδ1 + תאים (אדום) היא 2.3% מכלל ספירת הלימפוציטים וביטוי CD4 (הירוקה) של Vδ1 + לימפוציטים הוא 2.6%. בסך הכל, אוכלוסיית היעד לבידוד מייצגת 0.06% של לימפוציטים כולל בתורם זה. איור 1 מציג עוצמת מכתים אופטימלית לVδ1 + תאים לפני שתמשיך לתיוג המגנטי. צביעה עם הנוגדן הראשוני צריכה לגרום לאוכלוסיות חיוביות שליליות וVδ1 Vδ1 בבירור שונות, כך שיעילות יכולים להיות מתויגים + תאי Vδ1 ונפרדו עם magnחרוזים ETIC. איור 1 ג מתאר תאי Vδ1 + לאחר הליך הבידוד על ידי ניתוח FACS. טוהר Vδ1 + הוא בדרך כלל> 99% של CD3 + תאים. כדי להגדיל את טוהר, תאים מבודדים מוחלים על עמודת בידוד שנייה. תוצאות באובדן תא ניכר זה אולם זה צעדים מוביל לחיסול כמותית של פוטנציאל זיהום TCRαβ + CD4 + תאים.
התוצאות של CD4 + הבידוד מוצגות באיור 2. בשל המספרים הנמוכים של CD4 + Vδ1 + תאים, ומאז הרחיבו את התאים בתא בודד דילול מוגבל שיבוט טוהר גישה של תאי CD4 + פחות מ -100% יכול להיות נסבל. בניסוי שמוצג כאן, טוהר + תאי CD4 + Vδ1 היה כ -90% (איור 2 א, כתם מימין) ושיבוט תא בודד שלאחר מכן הביאו ליותר מ -60 Vδ1+ שיבוטים של תאי CD4 +. לעומת זאת, בVδ1 + CD4 - חלק לא מסוג CD4 + תאים נשארו (איור 2), שמדגיש את היעילות של אסטרטגית בידוד זה. ראוי לציין, תאים מסוג CD4 + (הכחולה) להביע Vδ1 ברמה נמוכה יותר מאשר להבחין CD4 - תאים (אדום) (איור 2 א, שני הכתמים). לפיכך, צביעת Vδ1 + תאים חייבת להיות מוגזמת כפי שתואר בפרוטוקול לתיוג מספיק ובידוד מוצלח של חלק CD4 + בתוך תא בריכת Vδ1 + T.
באיור 3 א, פנוטיפ האופייני לשיבוט מתעורר מוצג. TCR מורכב מVδ1 ושרשרת Vγ9 והתאים המשובטים להביע CD3 CD4 ו. איור 3 מתאר את התהליך של transdifferentiation של שיבוט אחד מבודד עם הטכניקה שהוצגה. Transdifferentiation כולל downregulatiעל של V'1-השרשרת לרמת ביטוי נמוכה, אשר מקבילה ביטוי דה נובו של αβTCR. זה מוביל לפנוטיפ TCR-כפול-חיובי חולף שסופו של דבר מביא לתאי T αβTCR להביע חד-חיוביים. ביטוי שיתוף קולט עשוי גם לשנות במהלך transdifferentiation. בדומה לthymocytes, פנוטיפ CD4 + CD8 + DP עלול להתרחש, העוסק בפיתוח סופו של דבר לאחד מסוג CD4 + SP או תאי CD8 + T αβ. בתנאי התרבות שהוצגו כאן, transdifferentiation הוא נדיר אירוע רק אחד מתוך 50 שיבוטים השתנה Vδ1 + TCR שלהם לαβTCR.
FACS 1. איור מנתח מעקב אחר כל השלבים של תהליך הבידוד של תאי T δ1 V מהדם היקפי. (</ הפצת strong>) של Vδ1 + תאים (אדום) בתאי CD3 + של לימפוציטים דם היקפי וביטוי שיתוף קולטן. תאי CD4 + Vδ1 + מסומנים בכחול (העיגול). הכתמה (ב) לחלק Vδ1 לפני שתמשיך לתיוג מגנטי. (ג) FACS ניתוח Vδ1 + תאים של חלק חיובי לאחר בידוד. מספרים מצביעים על אחוז התאים המגודר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. FACS הניתוחים של δ V CD4 + 1 מבודד CD4 () + חלק ו (ב) CD4 -. חלקלאחר בידוד תאי CD4 +. מספרים מצביעים על אחוז התאים המגודר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. ניתוח פנוטיפי של שיבוט מייד לאחר גילוי. () ביטוי הרכב TCR ושיתוף קולט של שיבוט מבודד טרי. Vδ1 וVγ9 TCR הוא שיתוף הביעו עם CD3 CD4 ו. תהליך (B) של transdifferentiation בשיבוט מסוג CD4 + Vδ1 +. שינוי של ביטוי TCR (למעלה), ושינוי של ביטוי שיתוף קולט (תחתון) 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ללמוד את הפנוטיפ, הביולוגיה ותפקוד של גוף תא נדיר (טי), כלומר תאי Vδ1 + CD4 + T, השתמשנו שני סמנים: Vδ1 וCD4 לבידוד המגנטי החיובי שלה תא. Vδ1 הוא קולטן יתום, ואילו CD4 מתבטא בתאי T מסייע, ברמה נמוכה יותר במונוציטים ותאים דנדריטיים, וברמה נמוכה מאוד ובתאי hematopoietic.
טכניקות להעשרה והבחירה של תאים בטוהר גבוה כוללות הקרינה הופעלה תא מיון (FACS), טכניקה שמפרידה בין אוכלוסייה של תאים לתוך תת-אוכלוסיות המבוססות על תיוג ניאון. תאים המוכתמים באמצעות נוגדני fluorophore מצומדות ניתן להפריד אחד מהשני תלוי באיזה fluorophore (ים) שהם חייבים. ממיינים יכולים להשיג טוהר קרוב ל -98% 19, וזה שימושי אם הצורך הוא רק המיון עצמו. חסרונות של שיטה זו כוללים שתאים ממוינים להראות ירידה בvi התאיכולת, ובאוכלוסיית היעד שלנו גם פוטנציאל מופחת עבור transdifferention. כדאיות תא מופחתות לאחר מיון השערה היא להיות בשל כוחות הגז ולחץ הידרודינמית שFACS מטיל על תאים. יתר על כן, כדי לשמור על תאי קיימא וללא זיהום לתרבות שלאחר מכן, הניסוי צריכה להתבצע בתנאים סטריליים ספטית שקשה לנהל. בנוסף, מיון FACS ממליץ מספרים גבוהים של תאים למיון.
ערכות בידוד פותחו מכמה חברות לתיוג מגנטי ישיר והמיון של תאים על פי סמני משטח מרובים. האסטרטגיה שלהם מסתמכת על הסרת התווית המגנטית מהתאים לאחר הסוג הראשון באמצעות מגיב שחרור, אשר גם אנזימים או תחרותי מסירה את התווית המגנטית מהמבנה שאליו היה קשור. זה מאפשר תיוג שני מגנטי והפרדה של התאים לסמן משטח אחר של tha הענייןלא מושגת באמצעות תיוג ישיר או עקיף עם חרוזים מגנטיים. הסרת התווית ממליצה לעבוד בטמפרטורות נמוכות (על קרח, ב 2-8 מעלות צלזיוס) לפרקי זמן ממושכים, חשיפה לחומר כימי ושלבים כביסה חוזרים ונשנים. אם תאי היעד של הפרדת הפרמטר השנייה נמצאים בריכוז נמוך לאחר בחירה (<תאי יעד של 10% בחלק החיובי לאחר ההפרדה הראשונה) אפילו סיבוב שני להסרת ofany תאי שכותרתו מגנטית השיורי צורך. הליך זה הוא-חוץ יש אובדן משמעותי של תאי מטרה בשל צעדים-בשטיפה חוזרות ונשנות בסיכון גבוה לגרימת נזק לתאים ואובדן התפקוד עקב לחץ מכאני ופיזיולוגי. לעומת FACS מיון עם זאת הכנות תא יישארו סטרילי וניתן למיין מספרים סלולריים קטנים יותר.
האסטרטגיה שאנו רודפים אחרי משלבת שתי בחירות חיוביות המתבצעות ברצף, עדיין הסרת התווית הראשונה אינה נדרשת כמטרתוויות agnetic שונות בגודל של הכוחות המגנטיים שלהם על ידי מספר שלבי יומן. בעוד אנטי-fluorochrome הראשון מגנטי שכותרתו סוג חרוז הוא קטן, בקוטר של 50 ננומטר, אנטי-מגנטי fluorochrome השני שכותרתו אמצעי סוג חרוז 1-4.5 מיקרומטר, ובכך יעלה את הנפח / הכוח של התווית המגנטית הראשונה 20 ל 90-פי. בנוסף, מהסוג החיובי השני משמיט מתח תא, המשויך לשימור / שחרור עמודה מגנטי כתאים להישאר ב1.5 מיליליטר בקבוקון שהוא הכניס במכשיר מגנטי, כך שתאים שכותרתו מחוברים לקיר של הבקבוקון. יכולים להישמר נהלי כביסה בקנה מידה קטן. זה הרחיב פרוטוקול מפחית אובדן תא ומגדיל את כדאיויות תא מאז תאים חווים פחות מניפולציה ולעבור את תהליך הבידוד מהר יותר מאשר פרוטוקולים באמצעות מערכות ערכת בידוד multisort.
כתוצאה מכך, פרוטוקול זה מאפשר להפריד אפילו מספר קטן של תאים ויתרון נוסף: תאים ממוינים להישאר STEלהרגיז לאורך כל ההליך. ניסויי שיבוט לאחר שימוש בדילול מגביל מאפשר התרחבות היעילה של חברים בודדים של התאים המבודדים, כאן Vδ1 + CD4 + נדיר מאוד γδ T תא ישות 18. תאים ממוין להראות כדאיות וclonogenicity מצוינות ולהישאר מתפקד במלואה.
ביישומים עתידיים, להשתמש באסטרטגיה זו כדי לבחור כמותית והצלחה לטהר גופי תא T קטנים ממקורות אנושיים מגוונים כולל דם היקפי טרי נמשך, מוצרים (גייסו) leukapheresis, דם טבורי ומח עצם על ידי שילוב של שתי בחירות חיוביות שבוצעו ברציפות באמצעות תוויות מגנטיות שונות על ידי גודל בכוחות המגנטיים שלהם ואת יכולת ובכך שימור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
