Abstract
De thymus, de voornaamste orgaan voor het genereren van αβ T-cellen en ruggengraat van het adaptieve immuunsysteem bij vertebraten, is lang beschouwd als de enige bron van αβT cellen. Toch thymus involutie begint vroeg in het leven leidt tot een drastisch verminderd vermogen van naïeve αβT cellen in de periferie. Toch kunnen zelfs honderdjarigen bouwen immuniteit tegen nieuw verworven pathogenen. Recent onderzoek suggereert extrathymic αβT cel ontwikkeling, maar ons begrip van de trajecten die kunnen compenseren voor thymus verlies van functie nog rudimentair. γδ T-cellen aangeboren lymfocyten die de belangrijkste T-cel-subgroep in het weefsel vormen. We hebben onlangs een tot nu toe niet gewaardeerd uitstekende functie om een γδ T-cel subgroep toegeschreven door te laten zien dat de schaarse entiteit van CD4 + Vδ1 γδ + T-cellen kunnen transdifferentiëren in αβT cellen in inflammatoire aandoeningen. Hier hebben we provide het protocol voor de isolatie van deze voorlopercellen uit perifeer bloed en de daaropvolgende teelt. Vδ1 cellen positief verrijkt uit PBMC van gezonde humane donoren via magnetische partikels, gevolgd door een tweede stap waarbij we richten de schaarse fractie van CD4 + cellen met een verdere magnetische labeling techniek. De magnetische kracht van het tweede etiket dan die van de eerste magnetische label, waardoor aldus het efficiënt kwantitatieve en specifieke positieve isolatie van de populatie van belang. Vervolgens voeren de techniek en kweekomstandigheid vereist voor klonering en efficiënt uitbreiden van de cellen en voor de identificatie van klonen gegenereerd door FACS-analyse. Zo bieden we een gedetailleerd protocol voor de zuivering, cultuur en ex vivo expansie van CD4 + Vδ1 γδ + T-cellen. Deze kennis is voorwaarde voor studies die betrekking hebben op deze αβT cel progenitor`s biologie en voor degenen die willen identify de moleculaire triggers die betrokken zijn bij de transdifferentiatie.
Introduction
In vertebraten, adaptieve immuniteit die is gestructureerd in de cellulaire en humorale deel van immuniteit speelt een belangrijke rol bij de afweer tegen ziekteverwekkers. De herkenning van een groot aantal antigenen wordt gemedieerd door hyperpolymorphic T- en B-celreceptoren (TCR / BCR), die met betrekking tot T-cellen worden aangenomen dat voornamelijk geproduceerd in de thymus 1. Daartoe hematopoietische stamcellen (HSCs), verkregen uit beenmerg, de thymus zaad en differentiëren langs goed gedefinieerde stadia uiteindelijk aanleiding geven tot alle T-cellijnen. Thymus zaaien voorlopers zijn CD4 - en CD8 - en daarmee de onvolwassen, dubbele ontkenning (DN) thymocyte fractie vormen. Thymus afgeleide signalen vervolgens hun lineage inzet en de differentiatie in ofwel αβ of γδ T-cellen induceren. De expressie van functioneel herschikte TCR-γ en δ TCR-keten genen in DN2 / 3 thymocyten leidt tot δTCR complexen, die cellulaire proliferatie een aandrijving yd bevorderen differentiatie in γ AT cellen 2,3. In tegenstelling, de omlegging van een functionele TCR-β-keten, die koppelen met preTα een preTCR pT bouwen, induceert de transcriptionele silencing van het TCR-γ keten DN3 thymocyten en hun overgang in CD4 + CD8 + dubbel positieve thymocyten 4 . In dit stadium recombinatie van de TCR-α-keten optreedt, verwijderen van de TCR-δ locus dat ligt binnen de TCR-α locus, waardoor intrekking van de productie een γδTCR in deze cellen onherroepelijk 5-9. Herschikt αβTCRs worden vervolgens geselecteerd op hun vermogen om zelf-MHC zwak binden (positieve selectie), die niet een bepaalde drempel overschrijden om auto-immuniteit (negatieve selectie) te vermijden. Volgens hun bindingscapaciteit MHC klasse I of II, het geselecteerde αβT cellen ontwikkelen tot enkele positieve CD4 + of CD8 + T-cellen, die uitgang de thymus als naïeve T-cellen.
Echter, involutie van de thymus begint vroeg in het leven leidt tot exponentieel verminderd vermogen van naïeve T-cellen die bijna gedoofd na de adolescentie 10. Niettemin, de grootte van de T-cel pool blijft constant gedurende het gehele leven, dat slechts gedeeltelijk kan worden verklaard door post-thymus homeostatische proliferatie van T-cellen en de proliferatie van langlevende immunologisch geheugen 11. Bijgevolg moet extrathymic T cel ontwikkeling plaatsvinden. Recent onderzoek heeft aanzienlijke aantrekkingskracht die αβT cel voorlopercellen, die een-op extrathymic locaties-gaven aanleiding tot functionele αβ T-cellen 12-17 gekenmerkt opgedaan. Toch, gedetailleerde kennis over extrathymic αβT cel voorlopers die onafhankelijk zijn van een thymus differentiëren in αβT cellen is zo fragmentarisch als de achtergrond dat we op de route die ze daarbij maken.
We hebben onlangs de kleine T-cel entiteit van Vδ1 + geïdentificeerd + cellen γδT als extrathymic αβT cel prognitor 18, die, wanneer geïsoleerd uit perifeer bloed van gezonde donoren kunnen transdifferentiëren in αβT cellen in een milde inflammatoire omgeving. Interessant en in tegenstelling tot de homeostatische proliferatie van post-thymus T-cellen, transdifferentiatie van Vδ1 CD4 + cellen genereert nieuwe T-cel receptoren, waardoor het verbreden van de diversiteit repertoire, zodat die potentieel nieuwe antigenen kunnen worden herkend en kan de bescherming van de gastheer tegen nieuw verworven pathogenen. Dit draagt bij aan de plasticiteit van T-cellen en voegt nu toe unappreciated nieuwe route voor extrathymic T cel ontwikkeling.
De kwantitatieve isolatie van lymfocyten, opwekking van eencellige klonen en doeltreffend expansie essentieel voor de doelstelling om die merkers en moleculen die leiden deze αβT cel precursor`s extrathymic ontwikkeling te identificeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ethic Verklaring: Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werden goedgekeurd door de Clinical ethische commissie van de universiteit van Tübingen (projecten 38 / 2009B02 en 470 / 2013B02).
1. Isolatie van perifere mononucleaire bloedcellen (PBMCs)
- Neem 50-100 ml van een gezonde vrijwilliger via venapunctie met behulp van een 50 ml spuit met 1000 IE heparine sulfaat en verdunnen het bloed 1: 2 met PBS (pH = 7,2).
- Laag voorzichtig 35 ml van het bloed: PBS-oplossing op 15 ml bloed scheidt oplossing zoals Biocoll (d = 1,077 g / ml) in een 50 ml conische buis. Centrifugeer gedurende 15 min bij 800 x g bij kamertemperatuur.
OPMERKING: rem mag niet worden gebruikt. - Verzamel de cellen van het lymfatische laag met een pipet en was de cellen tweemaal in tenminste 50 ml PBS (centrifugeer gedurende 12 min, bij 400 xg). Verwijder het supernatant na centrifugeren met een pipet.
- Lyse resterende erytrocyten door schorsing en incubAting het lymfocytische fractie met 1-5 ml van een hypotone bufferoplossing gedurende 2-4 min.
OPMERKING: duur van de blootstelling en de hoeveelheid lysisbuffer afhankelijk van het gebruikte lyserende buffer en de hoeveelheid rode bloedcellen verlaten in de lymfocyt fractie. - Verdun de cellen met PBS (1:10) en centrifugeer bij 250 xg gedurende 12 min en vervolgens opnieuw in suspensie en was de celpellet keer in 10 ml PBS bij 300 xg gedurende 12 min.
- Resuspendeer de lymfocyten in PBS en tel de cellen in een Neubauer telkamer met behulp trypan blauwe oplossing.
OPMERKING: Meestal worden> 1 x 10 8 lymfocyten ontvangen van 100 ml vers perifere bloed getrokken.
2. Isolatie van Vδ1 T-cellen
- Neem <1 x 10 6 geïsoleerde lymfocyten voor een eerste FACS waarbij de frequentie van Vδ1 CD4 T-cellen.
OPMERKING: Bevolking grootte van deze T-cel entiteit kan sterk verschillen tussen individuen en op basis van hun immunologische toestand. Typically, ongeveer 1% van T-cellen Vδ1 + en ongeveer 1-5% van Vδ1 + CD4 + cellen.- Verdun de cellen met 1 ml FACS-buffer, die bestaat uit PBS die 2% FCS en 5 mM EDTA. Centrifugeer bij 660 xg gedurende 2 minuten en decanteer het supernatant. De reflux volume van ongeveer 100 ui FACS buffer voldoende is voor de daaropvolgende kleuring. Kort vortex en incubeer de cellen met 5 pi Fc-Blocking Reagent gedurende 5 min bij kamertemperatuur verhoogde specificiteit van de FACS-kleuring.
- Naar humane monoklonale antilichamen direct aan de cellen zonder de Fc-Blocking Reagent. Zorg ervoor dat de cellen vlek met antilichamen tegen Vδ1 (01:50), CD3 (01:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) en TCRαβ (01:25). Bereid de isotype controle met de overeenkomstige immunoglobuline isotypes. Incubeer de cellen met antilichamen gedurende 20 minuten bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen in 1 ml FACS buffer (centrifuge gedurende 2 minuten, bij 660 xg), decanteren de supernatant en ga verder met FACS overname in de resterende buffer volume.
- Pelletiseren de cellen (die niet worden gebruikt in de FACS analyse) door centrifugatie gedurende 12 min; bij 300 g; 8 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cel pelletin 60 ul MACS-buffer per 1 x 10 7 cellen. Voeg 20 ul-Fc Blocking Reagent per 1 x 10 7 cellen en incubeer gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Voeg 10 ul FITC-geconjugeerd anti-humaan antilichaam Vδ1 per 1 x 10 7 cellen direct aan de cellen. Incubeer gedurende 12 min bij 4 ° C in het donker.
- Was de cellen met behulp 14 ml MACS-buffer (centrifugeer gedurende 12 min, bij 300 g; 8 ° C). Gooi supernatant volledig en resuspendeer de cellen in 80 ui MACS buffer per 1x10 7 cellen.
- Neem 1-2 x 10 5 cellen en verdun ze in 100 ul FACS buffer voor de verificatie van de etikettering door FACS analyse. Geen verdere toevoegsels nodig voor deze stap. Zorg ervoor dat er een vol-doende verschil in de helderheid van Vδ1 - en Vδ1 + cellen. Indien dit niet het geval is, herhaal stap 2,3) en 2,4).
- Voeg 20 ul anti-FITC microbolletjes per 1 x 10 7 cellen aan de overige cellen, mengen en incuberen gedurende 15 min in het donker bij 4 ° C. Daarna, was de cellen met behulp van ten minste 10 ml MACS-buffer (centrifuge gedurende 12 min bij 300 xg; 8 ° C).
- Tijdens het centrifugeren, het evenwicht voorgekoelde magnetische kolom aangebracht in een magneet met 500 pl MACS buffer.
- Resuspendeer de cellen in 500 ui MACS-buffer (bij celaantallen groter dan 1 x 10 8, opschalen dit volume daarvan) en de cellen voorzichtig aanbrengen op de kolom. Verzamel de doorstroom met de Vδ1 - cellen.
- Was de kolom driemaal met 500 ui MACS-buffer en opnieuw verzamelen van de doorstroom in dezelfde buis. Merk op dat het reservoir leeg is voordat buffer op de kolom moet zijn.
- Verwijder de kolom uit het magnetische apparaat en plaats deze in een 15 ml conische buis. Snel spoelen van de kolom met 1 ml MACS-buffer door stevig indrukken van de zuiger in de kolom. Vang het eluaat op in een buis.
Opmerking: Om een zuiverheid van> 98% te verkrijgen, is het meestal noodzakelijk te herhalen stappen 2,7-2,9) een tweede kolom. - Controleer de zuiverheid van de cellen door FACS-analyse met 18 dezelfde antilichaam panel als hiervoor (zie 2.1.2) en tel de cellen.
3. Isolatie van Vδ1CD4 + T cellen
- Resuspendeer 25 ui CD4 kralen met een vortex gedurende> 30 sec. Was de kralen (het minimum zoals die door de fabrikant) in 1 ml MACS buffer in een 1,5 ml reactiebuis door het plaatsen van de buis in een magneet voor 1 min. Verwijder het supernatant voorzichtig met een kleine pipet (200 ui) en resuspendeer de kralen in het oorspronkelijke volume van MACS-buffer.
- Pelletiseren Vδ1 + cellen (centrifugeer 12 min; bij 300 g) en zuig het supernatant en resuspendeer alle Vδ1 + cellen in 500 ul MACS-buffer en voeg ze toe aan de buis met de kralen. Meng krachtig en incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C onder constant kantelbare (bijvoorbeeld in een rotator).
- Plaats de buis met de cellen in een magneet voor 2 min. Zorg ervoor dat er geen restanten in het deksel.
OPMERKING: CD4 + cellen de magnetische beads gebonden zijn en hechten aan de zijde van de buis tegenover de magneet. - Open voorzichtig het deksel terwijl de buis in de magnetische inrichting en verzamel de bovenstaande vloeistof die het CD4 bevat - Vδ1 + cellen met een kleine pipet. Plaats CD4 - Vδ1 + cellen in een aparte buis en plaats deze buis in de magneet weer om eventueel te voorkomen resterende CD4-cellen of kralen uit de bevolking.
- Was de CD4 - cellen in 5 ml MACS-buffer (centrifugeer gedurende 12 min, bij 300 xg) eennd resuspendeer ze in een concentratie van 1 x 10 5 cellen per 100 pl medium. CD4 - cellen kunnen gemakkelijk worden gekweekt onder de hieronder (4.2) gegeven omstandigheden.
- Plaats de buis met de CD4 Doelen buiten het magnetisch veld, resuspendeer de cellen in 500 ui MACS-buffer en zet deze weer terug magnetisch apparaat. Herhaal stap 3,3-3,5 maal tot een hogere zuiverheid te verkrijgen. Verwijder supernatant door pipetteren
- Resuspendeer de CD4 + cellen in 100 pi kweekmedium (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-glutamine, 1% penicilline / streptomycine) en voeg 10 ul van een kraal losmaken oplossing. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 45 min met een constante kantelbare (bijvoorbeeld in een rotator).
- Plaats de cellen in een magneet voor 1 min. Het verzamelen van de supernatant die kraal vrije Vδ1 + CD4 + cellen met behulp van een kleinschalig pipet voorzichtig.
- Buitenkant van de magneet, resuspendeer de kralen met 100 ul kweekmedium en herhaalstappen 3,6 en 3,7 maal hogere cel aantallen CD4 + cellen te verkrijgen.
- Pelletiseren de cellen (centrifuge bij 300 xg gedurende 12 min) en de bovenstaande vloeistof volledig door pipetteren. Resuspendeer cellen in verse, voorverwarmde media en tel ze. Controleer de zuiverheid van de Vδ1 + CD4 + cellen door FACS-analyse getoond in stappen 2.1.1-2.1.3.
4. Single-cell klonen door beperkte verwatering
- Isoleer perifere mononucleaire cellen (PBMCs) uit een allogene donor zoals afgebeeld in 1,1-1,6.
- Bestralen 2,5 x 10 7 allogene PBMC met 80 Gy in 25 ml kweekmedium met behulp van γ-straling.
- Add IL-2 (200 U / ml), IL-7 (20 ng / ml) en PHA (2 ug / ml) aan de bestraalde voedingscellen en verspreiden in 96-well U-vormige platen 5 x 10 4 feeder cellen in 50 ul per putje.
- Verdun de Vδ1 + CD4 + cellen tot een concentratie van 0,3 cellen per 50 ul. Pipette 50 ul van de cel oplossing in elk putje herbergen van de bestraalde cellen en cytokines.
Opmerking: Zo worden de cytokinen verdund tot de eindconcentratie van 100 U / ml IL-2, 10 ng / ml IL-7 en 1 ug / ml PHA. Incubeer de 96-well platen in een incubator bij 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde atmosfeer.- Optioneel cultiveer resterende gezuiverde Vδ1 + CD4 + cellen als bulk cultuur onder dezelfde voorwaarden cultuur als de klonen.
- Leveren de cellen om de 3-4 dagen met cytokines en verse media. Hiervoor uitwisseling helft van het medium in de putjes met 50 pl vers medium door pipetteren. Voeg 2-voudige concentratie van cytokinen aan elke suppletie. Voeg 5x10 4 bestraalde feeder cellen per goed elke andere ronde van het voederen.
- Met behulp van een microscoop, observeren eerste klonen zichtbaar na 3-4 weken te worden, omdat ze metaboliseren en dus verandert de kleur van het kweekmedium en vormen kolonies.
LET OP: Voor bontther teelt, resuspendeer de klonen goed en overbrengen naar 96-well platen te scheiden. Analyseer de cellen via FACS zoals in 2.1.1-2.1.3. Klonen onder deze omstandigheden bewaard kan uiteindelijk veranderen hun TCR van Vδ1 naar αβTCR. De tijd voor deze transdifferentiatie varieert van kloon te klonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 toont de verschillende stappen en het resultaat van de isolatie van Vδ1 T-cellen uit perifeer bloed. Figuur 1A toont een typische verdeling van Vδ1 + cellen CD3 + lymfocyten, evenals de co-receptor expressie van de Vδ1 + populatie. In deze donor, de frequentie van Vδ1 + cellen (rood) is 2,3% van de totale lymfocyten en CD4-expressie (groen) van Vδ1 + lymfocyten is 2,6%. Al met al, de doelgroep voor isolatie vertegenwoordigt 0,06% van de totale lymfocyten in deze donor. Figuur 1B toont een optimale kleurintensiteit voor Vδ1 + cellen alvorens tot de magnetische etikettering. Kleuring met het primaire antilichaam moet resulteren in duidelijk onderscheiden Vδ1 negatieve en positieve Vδ1 bevolkingsgroepen zodat de Vδ1 + cellen efficiënt kan worden geëtiketteerd en gescheiden met de magnetic kralen. Figuur 1C toont Vδ1 + cellen na de isolatie procedure door FACS analyse. De zuiverheid van Vδ1 + gewoonlijk> 99% CD3 + cellen. Om de zuiverheid te vergroten, worden geïsoleerde cellen aangebracht op een tweede isolatie kolom. Dit resulteert in een aanzienlijke cel verlies echter deze stap leidt tot kwantitatieve eliminatie van potentieel vervuilende TCRαβ + CD4 + cellen.
De resultaten van de CD4 + isolatie worden getoond in Figuur 2. Door de lage aantallen CD4 + Vδ1 + cellen, en omdat de cellen worden geëxpandeerd in een beperkte verdunning eencellige klonen benadering zuiverheid van CD4 + cellen minder dan 100% kan getolereerd. In de hier getoonde experiment, de zuiverheid van de Vδ1 + CD4 + cellen was ongeveer 90% (Figuur 2A, rechter blot) en daaropvolgende eencellige klonen resulteerde in meer dan 60 Vδ1+ CD4 + T-celklonen. In tegenstelling, in de Vδ1 CD4 + - fractie geen CD4 + cellen bleven (figuur 2B), die de efficiëntie van deze strategie isolement belicht. Van de nota, de CD4 + cellen (blauw) te uiten Vδ1 op een duidelijk te onderscheiden lager niveau dan CD4 - cellen (rood) (Figuur 2A, beide vlekken). Derhalve moet kleuring van Vδ1 + cellen buitensporige zoals beschreven in het protocol-een voldoende labeling en succesvolle isolatie van CD4 + fractie in de Vδ1 + T cel pool zijn.
In figuur 3A, wordt de typische fenotype van een nieuwe kloon gepresenteerd. De TCR bestaat uit een Vδ1 en Vγ9 keten en de klonale cellen brengen CD3 en CD4. Figuur 3B toont het proces van transdifferentiatie van een kloon die met de gepresenteerde techniek. Transdifferentiatie omvat downregulatiop de V'1 keten een lage expressieniveau, die parallel door de de novo expressie van een αβTCR. Dit leidt tot een voorbijgaande TCR-double-positieve fenotype die uiteindelijk leidt tot enkele positieve αβTCR-expressie brengende T-cellen. De co-receptor expressie kan ook veranderen in de loop van transdifferentiatie. Net als thymocyten, kan een CD4 + CD8 + fenotype DP optreden die uiteindelijk ontwikkelt tot SP ofwel CD4 + of CD8 + T-cellen αβ. Onder de kweekomstandigheden hier gepresenteerde, transdifferentiatie is zeldzame gebeurtenis maar niemand een van de 50 klonen veranderde hun Vδ1 + TCR in αβTCR.
Figuur 1. FACS analyses controle alle stadia van het proces isoleren van V δ1 T-cellen uit perifeer bloed. (A </ strong>) Verdeling van Vδ1 + cellen (rood) in CD3 + cellen van perifere bloed lymfocyten en hun co-receptor expressie. CD4 + Vδ1 + cellen worden in blauw (cirkel). (B) kleuring van de Vδ1 fractie alvorens tot magnetische etikettering. (C) FACS analyse van Vδ1 + cellen van positieve fractie na isolatie. Getallen geven percentage van gated cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. FACS analyse van V δ 1 CD4 + isolaten (A) CD4 + fractie en (B) CD4 -. Fractiena CD4 + cellen isolement. Getallen geven percentage van gated cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fenotypische analyse van een kloon direct na detectie. (A) TCR samenstelling en coreceptor expressie van een vers geïsoleerde kloon. Vδ1 en Vγ9 TCR wordt co-expressie met CD3 en CD4. (B) proces van transdifferentiatie in een CD4 + Vδ1 + kloon. Verandering van TCR expressie (boven), en de verandering van de co-receptor expressie (onder) 18. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om het fenotype, biologie en functie van een schaarse (T-) cel entiteit bestuderen, namelijk Vδ1 + CD4 + T-cellen, gebruikten we twee markers: Vδ1 en CD4 om de positieve magnetische celisolatie. Vδ1 een orphan receptor, terwijl CD4 tot expressie op T helpercellen, op een lager niveau op monocyten en dendritische cellen, en op een zeer laag niveau hematopoïetische progenitorcellen.
Technieken voor de verrijking en selectie van cellen in hoge zuiverheid onder fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), een techniek die een populatie cellen in subpopulaties op basis van fluorescentie labeling scheidt. Cellen gekleurd met fluorofoor geconjugeerde antilichamen kunnen worden gescheiden van elkaar, afhankelijk van de fluorofoor (s) zij zijn gebonden. Sorteerders kunnen zuiverheid nagenoeg 98% 19, wat nuttig is als enige noodzaak is het sorteren zelf bereiken. Nadelen van deze techniek omvatten dat gesorteerde cellen een vermindering in cel vivermogen, en in onze doelgroep ook een beperkt potentieel voor transdifferention. Een verminderde cellevensvatbaarheid na sortering wordt verondersteld het gevolg te zijn van de schuifkrachten en hydrodynamische benadrukken dat de FACS oplegt cellen. Bovendien cellen levensvatbaar en zonder verontreiniging van vervolgteelt houden, wordt het experiment worden uitgevoerd aseptisch steriel die moeilijk te beheren. Bovendien FACS-sortering raadt hoge aantallen cellen voor het sorteren.
Isolatie Kits zijn ontwikkeld van verschillende bedrijven voor directe magnetische labeling en het sorteren van cellen volgens meerdere oppervlaktemerkers. Hun strategie berust op de verwijdering van het magnetische label uit de cellen na het sorteren op een release reagens, die ofwel enzymatisch of competitief verwijdert de magnetische label van de structuur waaraan zij gebonden was. Hierdoor kan een tweede magnetische kenmerken en scheiding van de cellen voor andere oppervlaktemerker plaats that wordt bereikt door directe of indirecte labeling met magnetische korrels. Het verwijderen van de label beveelt werken bij lage temperaturen (op ijs, bij 2-8 ° C) gedurende langere tijd, blootstelling aan chemische en herhaalde wasstappen. Wanneer de doelwitcellen van de tweede parameter scheiding aanwezig zijn in een lage concentratie na selectie (<10% doelcellen in de positieve fractie na de eerste scheidingsstap) nog een tweede ronde voor de verwijdering ofany residuele magnetisch gemerkte cellen nodig. Deze procedure is voorzien naast het hebben van een aanzienlijk verlies van doelwitcellen vanwege stappen-at herhaaldelijk wassen met een hoog risico voor het induceren van cellulaire schade en verlies van functie als gevolg van mechanische en fysiologische stressoren. Vergeleken met FACS sortering echter celbereidingen blijven steriel en kleinere aantal cellen kunnen worden gesorteerd.
De strategie die wij nastreven combineert twee na elkaar uitgevoerde positieve selecties, maar het verwijderen van het eerste label is niet vereist als de magnetic labels verschillen in de grootte van de magnetische krachten door verscheidene log fasen. Terwijl de eerste anti-fluorochroom magnetisch gemerkte soort bead is klein, met een diameter van 50 nm, de tweede anti-fluorochroom magnetisch gemerkte bead maatregelen van het type 1 tot 4,5 urn, waarmee de referentiewaarde volume / sterkte van het eerste magnetische label 20 te 90-fold. Daarnaast is de tweede positieve sort weglaat celstress, dat is gekoppeld aan magnetische kolom opsluit / ontgrendeling cellen blijven in een 1,5 ml flacon die in een magnetisch apparaat, zodat gemerkte cellen worden bevestigd aan de wand van het flesje. Wassen procedures kan op kleine schaal worden gehouden. Dit uitgewerkt protocol vermindert cel verlies en verhoogt de levensvatbaarheid van de cellen, omdat de cellen ervaren minder manipulatie en passeren de isolatie proces sneller dan protocollen gebruiken Multisort isolatie kit systemen.
Derhalve Dit protocol maakt het mogelijk om zelfs een klein aantal cellen en andere voordelen scheiden: gesorteerde cellen blijven sterile tijdens de gehele procedure. Daaropvolgende klonering experimenten met beperkende verdunning maakt de efficiënte groei van individuele leden van de geïsoleerde cellen, hier zeer schaars Vδ1 + CD4 + T cellen γδ entiteit 18. Gesorteerde cellen vertonen een uitstekende leefbaarheid en clonogenicity en blijft volledig functioneel.
Voor toekomstige toepassingen, gebruiken deze strategie om kwantitatief te selecteren en met succes te zuiveren kleine T-cel entiteiten uit diverse menselijke bronnen waaronder vers getrokken perifere bloed, (vrijgemaakt) leukaferese producten, navelstrengbloed en beenmerg door het combineren van twee achter elkaar uitgevoerd positieve selecties met behulp van magnetische labels die afwijken door de omvang van hun magnetische krachten en dus retentie capaciteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
