Abstract
胸腺、αβT細胞および脊椎動物における適応免疫系の主鎖を生成するための主要な器官は、長いαβT細胞の唯一の供給源として考えられてきました。しかし、胸腺退縮は、周囲へのナイーブαβT細胞の劇的に減少出力につながる人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、あっても百歳は、新たに取得した病原体に対する免疫を構築することができます。最近の研究では、機能の胸腺損失を補償することができる経路のが我々の理解はまだルディメンタルあり、胸腺外αβT細胞の発生を示唆しています。 γδT細胞は、組織における主要なT細胞のサブセットを構成する生来のリンパ球です。我々は最近、CD4 +Vδ1+の γδの希少エンティティT細胞が炎症状態にαβT細胞に分化転換できることを示すことによって、γδT細胞サブセットに、これまで正しく評価されていない優れた機能を帰する。ここでは、P末梢血から、この前駆細胞の単離およびその後の培養のためのプロトコルをrovide。 Vδ1細胞を積極我々は、磁気標識技術とCD4 +細胞の乏しい部分を対象と第2のステップが続く、磁気ビーズを使用して、健康なヒトのドナーのPBMCから濃縮されます。第二の標識の磁力が第一の磁性ラベルの1を超え、従って、関心の人口の、効率的な定量的・具体的な正の単離を可能にします。それから、細胞をクローニングし、効率的に拡大するためのFACS解析によって生成されたクローンの同定に必要な技術や文化状況を紹介します。そこで、精製、文化および CD4 +Vδ1+γδT細胞のex vivoでの拡大のための詳細なプロトコルを提供します。この知識は、このαβT細胞progenitor`s生物学に関連する研究のため、IDEに目指す人のための前提条件でありますその転換に関与している分子トリガーをntify。
Introduction
脊椎動物では、細胞性および体液性免疫の部分で構成されている適応免疫は、病原体に対する防御において重要な役割を果たしています。抗原の広範囲の認識は、T細胞に関して胸腺1を中心に製造されているものとするhyperpolymorphic T-およびB細胞受容体（TCR / BCR）によって媒介されます。これには、骨髄由来の造血幹細胞（HSC）は、胸腺に播種し、最終的にすべてのT細胞系統を生じる明確に定義されたステージに沿って分化します。およびCD8 - -胸腺播種前駆細胞は、CD4であり、したがって、未熟、ダブルネガティブ（DN）胸腺細胞の割合を構成しています。胸腺由来の信号は、その系統のコミットメントとαβまたはγδT細胞のいずれかへの分化を誘導します。 DN2 / 3胸腺細胞で機能的に再編成されたTCR-γおよびTCR-δ鎖遺伝子の発現は、細胞増殖のANを駆動δTCR複合体を、γにつながりますDγδT細胞2,3への分化を促進します。これとは対照的に、preTCRのpTを構築するためにpreTαとペアにすることができ、機能TCR-β鎖の再配列は、転写DN3胸腺細胞におけるTCR-γ鎖のサイレンシングおよび CD4 + CD8 +ダブルポジティブ胸腺細胞4への移行を誘導。この段階では、TCR-α鎖の再結合は、このようにこれらの細胞取消不能5-9で生産γδTCRを抑止、TCR-α遺伝子座内にたたずむTCR-δ遺伝子座を削除、発生します。再配置αβTCRsはその後自己免疫（ネガティブ選択）を避けるために、特定のしきい値を超えてはならない弱（ポジティブ選択）、自己MHCに結合するそれらの能力のために選択されます。結合MHCクラスIまたはIIの能力に応じて、選択されたαβT細胞は、単一陽性CD4 +またはCD8 + T細胞にその出口胸腺としてナイーブT細胞を開発します。
しかし、胸腺の退縮はほとんど消灯後思春期10でナイーブT細胞の指数関数的に減少する出力をリードする人生の早い段階で開始します。それにもかかわらず、T細胞プールのサイズは、ポスト胸腺恒常性T細胞の増殖および長寿命の免疫メモリ11の増殖によってのみ部分的に説明できる寿命を通して一定のままです。したがって、胸腺外T細胞の開発が行われなければなりません。最近の研究では、胸腺外で機能αβT細胞12-17を生じサイト-たαβT細胞前駆体を、特徴であるかなりの魅力を得ています。しかし、胸腺から独立したが、αβT細胞に分化胸腺外αβT細胞前駆体についての詳細な知識は、我々は、彼らがそれによって取るルート上に持っている背景のように断片的です。
我々は最近、Vδ1+の小さなT細胞エンティティを特定し18、などのp> CD4 +γδT細胞は軽度の炎症環境でαβT細胞に分化転換することができます。興味深いことに、潜在的に新規の抗原を認識することができるように、このように、レパートリーの多様性を拡大後の胸腺T細胞の恒常性増殖、Vδ1CD4 +細胞の分化転換新たなT細胞受容体を生成する逆保護よい新たに取得された病原体に対する宿主。これは、T細胞の可塑性に追加され、胸腺外T細胞の開発のために、これまで正しく評価されていない新しい経路を追加します。
目的は、このαβT細胞が胸腺外発達をprecursor`sトリガこれらのマーカーおよび分子を同定するために、リンパ球の供給源からの定量的な分離は、単一細胞クローンの生成及びその効率的な拡張が必須です。
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Protocol
倫理文：すべての手順は、ヘルシンキ宣言に従って実施し、テュービンゲン大学で臨床倫理委員会によって承認された（38 / 2009B02と470 / 2013B02プロジェクト）。
末梢血単核細胞（PBMC）の単離1。
- 千IUのヘパリン硫酸を含む50 mlシリンジを使用して静脈穿刺を介し健常者50〜100ミリリットルを取り、血液1希釈：PBS（pH値= 7.2）と2。
- 15ミリリットルの血液分離ソリューションのPBS溶液などBiocollとして（D = 1.077グラム/ ml）を50ml中の円錐管：慎重に血液35mlのレイヤ。室温で800×gで15分間遠心します。
注：ブレーキを使用することはできません。 - ピペットでリンパ球層の細胞を収集し、少なくとも50 mlのPBSで細胞を2回洗浄（; 400×gで12分間遠心分離）。ピペットで遠心分離後、上清を取り除きます。
- 溶解残り懸濁させることによって赤血球およびincub2-4分間低張緩衝液1-5 mlのリンパ球画分をレーティング。
注：溶解緩衝液の曝露とボリュームの持続時間は、使用される溶解バッファーにし、リンパ球画分に残った赤血球の量に依存します。 - 12分間250×gでPBS（1:10）、遠心分離で細胞を希釈し、その後12分間300×gで一回10mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁し、洗います。
- PBS中のリンパ球を再懸濁し、トリパンブルー溶液を使用して、ノイバウアーカウントチャンバー内の細胞をカウントします。
注：通常、> 1×10 8のリンパ球を新たに末梢血を集めて100ミリリットルから受信されます。
Vδ1T細胞の単離2。
- <Vδ1CD4 T細胞の頻度を決定する最初のFACSのための1×10 6単離したリンパ球を取ります。
注：このT細胞の実体の人口規模は、個人とその免疫学的状態に応じ間で大きく異なる可能性があります。 Typic味方、T細胞の約1％がVδ1+であり、Vδ1+細胞の約1-5％がCD4 +です。- PBS、2％FCSおよび5mM EDTAを含んで構成され、1mLのFACS緩衝液で細胞を希釈します。 2分間660×gで遠心分離し、上清をデカント。約100μlのFACS緩衝液の還流量は、その後の染色のために十分です。簡単に言うと渦とFACS染色の特異性を増大させるために室温で5分間、5μlのFcをブロッキング試薬で細胞を培養します。
- Fcブロッキング試薬を除去することなく、細胞に直接ヒトモノクローナル抗体を追加します。 （1：200）、CD8（1：200）とTCRαβ（1：25）Vδ1（1時50分）、CD3（1時50分）、CD4に対する抗体で細胞を染色することを確認します。対応する免疫グロブリンアイソタイプとアイソタイプコントロールを準備します。暗所で4℃で20分間、抗体と細胞をインキュベートします。
- （2分間遠心分離; 660×gにて）を1mlのFACS緩衝液中で細胞を洗浄し、supernをデカントatant、残りのバッファ量にFACS取得に進みます。
- 12分間の遠心分離（FACS分析に使用されていない）細胞をペレット化します。 300 gで。 8℃。上清を除去し、1×10 7個の細胞あたり60μlのMACSバッファーpelletin細胞を再懸濁します。 1×10 7個の細胞あたり20μlのFcをブロッキング試薬を加え、4℃で5分間インキュベートします。
- 細胞に直接1×10 7個の細胞あたり10μlのFITC結合抗ヒトVδ1抗体を追加します。暗闇の中で4℃で12分間インキュベートします。
- 14ミリリットルMACSバッファー（; 300グラムで、8℃12分間遠心分離器）を用いて細胞を洗浄します。完全に上澄みを捨て、1×10 7個の細胞あたり80μlのMACS緩衝液で細胞を再懸濁します。
- 1-2×10 5個の細胞を取り、FACS分析により標識の検証のために、100μlのFACS緩衝液でそれらを希釈します。さらなる添加剤は、このステップのために必要とされていません。 suffiがあることを確認してくださいcientのVδ1のための明るさの違い-とVδ1+細胞 。そうでない場合は、繰り返し）は2.3）と2.4を繰り返します。
- 残りのセルに1×10 7細胞あたり20μlの抗FITCマイクロビーズを加え、よく混ぜ、4℃で暗所で15分間インキュベートします。その後、（300×gで、12分間の遠心分離; 8°C）を少なくとも10ミリリットルのMACS緩衝液を用いて細胞を洗浄します。
- 遠心分離の間に、500μlのMACS緩衝液で磁石に配置された予備冷却磁気カラムを平衡化。
- （1×10 8よりも高い細胞数のために、それに応じてこのボリュームをスケールアップ）500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、カラムに慎重に細胞を適用します。細胞- Vδ1を含むフロースルーを収集します。
- 500μlのMACS緩衝液でカラムを3回洗浄し、同じチューブに再びフロースルーを収集します。リザーバーはカラム上にバッファを適用する前に、空でなければならないことに注意してください。
- 磁気デバイスから列を削除し、15ミリリットルコニカルチューブにそれを置きます。すばやくしっかりと列にプランジャーを押して1ミリリットルMACS緩衝液でカラムを洗浄します。チューブに溶出液を収集します。
注：> 98％の純度を得るためには、第二列を含むステップ2.7から2.9）を繰り返すことが通常必要です。 - 前と同じ抗体パネルとのFACS分析18によって細胞の純度を確認します（2.1.2を参照）、細胞をカウントします。
Vδ1CD4+ T細胞の単離3
- > 30秒間ボルテックスでCD4ビーズ25μlの再懸濁します。 1分間磁石にチューブを配置することにより、1.5 mlの反応チューブに1 mlのMACS緩衝液でビーズ（製造業者によって示されるように最小量）を洗浄します。小規模ピペット（200μL）で慎重に上清を廃棄し、MACSバッファーの元のボリュームにビーズを再懸濁します。
- 1Vδ1+細胞 （遠心分離をペレット化2分; 300×gで）し、上清を吸引し、500μlのMACSバッファー内のすべてのVδ1+細胞を再懸濁し、ビーズを含むチューブに追加します。勢いよく混合し、（回転子に、例えば ）一定の傾斜で4℃で20分間インキュベートします。
- 2分間磁石に細胞を含有するチューブを置きます。蓋には名残がないことを確認してください。
注：CD4 +細胞は、磁気ビーズを結合させ、磁石が直面しているチューブの側面に取り付けられています。 - 慎重に、磁気装置内チューブを保持しながら、蓋を開け、CD4含ま上清を収集-小規模のピペットを用いてVδ1+細胞。別のチューブにVδ1+細胞および集団から、おそらく残りのCD4細胞またはビーズを避けるために、再び磁石にこのチューブを置く- CD4を置きます。
- CD4を洗う- 5ミリリットルMACS緩衝液中で細胞（12分間遠心; 300×gで）AND100μlの培地あたり1×10 5細胞の濃度で再懸濁します。 CD4 -細胞が容易に（4.2）の下に与えられた条件下で培養することができます。
- 500μlのMACS緩衝液中で細胞を再懸濁し、磁気デバイスに戻し入れ、磁場の外CD4 + 細胞標的にチューブを置きます。繰り返しは、より高い純度を得るために二度3.3から3.5を繰り返します。ピペットで上清を除去
- 100μlの培養培地中のCD4 +細胞（RPMI 1640、10％FCS、1％L-グルタミン、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）に再懸濁し、ビーズ取り外し溶液10μlを加えます。一定の傾斜（例えば、回転体で）と室温で45分間インキュベートします。
- 1分間磁石に細胞を配置します。注意深く小規模ピペットを用いてビーズを含まないVδ1+ CD4 +細胞を含む上清を収集します。
- 磁石の外では、100μlの培地を繰り返してビーズを再懸濁CD4 +細胞の高い細胞数を得るために、3.6倍及び3.7ステップ。
- 細胞をペレット化する（12分間、300×gで遠心分離）し、ピペッティングにより完全に上清を捨てます。新鮮な、予め温めておいたメディアで細胞を再懸濁し、それらを数えます。ステップ2.1.1-2.1.3に示されたFACS分析によってVδ1+ CD4 +細胞の純度を調べます。
限界希釈4.単一細胞クローニング
- 1.1〜1.6に示すように、同種異系のドナーからの末梢血単核細胞（PBMC）を単離します。
- γ線照射を用いて、25 mlの培養培地中で80グレイで2.5×10 7の同種異系のPBMCを照射します。
- 照射されたフィーダー細胞をIL-2（200 U / ml）を、IL-7（20ng / ml）およびPHA（2μg/ ml）を添加し、96ウェルU型プレートに配布し、5×10 4フィーダウェルあたり50μl中の細胞。
- 50μlの0.3細胞の濃度にVδ1+ CD4 +細胞を希釈します。ピペット各ウェル照射された細胞およびサイトカインを保有する細胞溶液の50μlのTE。
注：このように、サイトカインは、100 U / mlのIL-2を10ng / mlのIL-7とを1μg/ mLのPHAの最終濃度に希釈します。 37℃、5％CO 2の加湿雰囲気でインキュベーター中で96ウェルプレートをインキュベートします。- 必要に応じて、クローンの同じ培養条件下でバルク培養物としてVδ1+ CD4 +細胞を精製したまま養います。
- サイトカインおよび新鮮な培地で3〜4日ごとに細胞を供給してください。このため、ピペッティングにより50μlの新鮮な培地でウェル中の培地の交換半分。すべての補充にサイトカインの2倍の濃度を追加します。給餌のも、他のすべてのラウンドあたり5×10 4照射フィーダー細胞を追加します。
- 彼らは代謝、したがって、培地およびフォームコロニーの色を変更すると、顕微鏡を用いて、観察最初のクローンは、3〜4週間後に目に見えるようになります。
注：毛皮のためにTHER栽培は、よくクローンを再懸濁し、96ウェルプレートを分離するためにそれらを転送します。 2.1.1-2.1.3に示すように、FACSを介して細胞を分析します。これらの条件の下に保持したクローンは、最終的にαβTCRにVδ1から自分のTCRを変更することがあります。この分化転換のための時点は、クローンからクローンに変化します。
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Representative Results
図1は、種々の段階及び末梢血からVδ1T細胞の単離の結果を示している。 図1Aは、CD3 +リンパ球におけるVδ1+細胞の代表的な分布、ならびにVδ1+集団の共受容体の発現を示します。このドナーでは、Vδ1+細胞 （赤）の周波数は、総リンパ球数の2.3％であり、Vδ1+リンパ球のCD4発現（緑）が2.6％です。要するに、分離のための標的集団は、このドナーの総リンパ球の0.06％を表している。 図1Bは、磁気標識に進む前に、Vδ1+細胞に最適な染色強度を示しています。 Vδ1+細胞を効率的に標識し、MAGNで分離することができるように一次抗体で染色は、明らかに異なるVδ1 ネガティブとポジティブ Vδ1集団をもたらすはずですETICビーズ。 図1Cは、FACS分析によって単離手順後Vδ1+細胞を示します。 Vδ1+の純度は、通常、CD3 +細胞の> 99％です。純度を高めるために、単離された細胞は、第2分離カラムに適用されます。これはかなりの細胞の損失につながるしかし、これは潜在的にTCRαβ+ CD4 +細胞の混入の定量的排除にリードを繰り返します。
CD4 +単離の 結果を図2に示されている。これによりCD4 +Vδ1+細胞の数が少ないために、細胞をCD4 +細胞の限界希釈単細胞クローニングアプローチ純度100％未満に拡大しているので、缶許容されます。ここに示した実験では、Vδ1+ CD4 +細胞の純度は約90％（ 図2A、右ブロット）とその後の単一細胞クローニングは、60以上のVδ1をもたらしました+ CD4 + T細胞クローン。逆に、Vδ1+ CD4に-分数何CD4 +細胞は、この分離戦略の効率を強調した （図2B）を 、残っていません。注目すべきは、CD4 +細胞 （青）は、CD4よりも識別可能な低いレベルでVδ1を表現-細胞（赤）（ 図2A、両方のブロット）。したがって、Vδ1+細胞の染色は、過度-ように記載されているプロトコル-ためVδ1+ T細胞プール内の CD4 + 画分の十分な標識化および成功分離する必要があります。
図3Aに 、新興のクローンの典型的な表現型を提示します。 TCRはVδ1とVγ9鎖から構成され、クローン細胞は、CD3およびCD4を発現している。 図3（b）が提示技術を用いて単離し一つのクローンの分化転換の過程を描いています。転換はdownregulatiを含みαβTCRのデノボ発現と平行低発現レベルV'1鎖の上。これは、最終的には、単一の正αβTCRを発現するT細胞を生じる過渡TCR-二重陽性表現型につながります。共受容体の発現はまた、分化転換の過程で変更することができます。胸腺細胞と同様に、CD4 + CD8 + DPの表現型は、最終的には、SP、CD4 +またはCD8 +αβT細胞のいずれかに発展する、発生することがあります。ここで紹介するの培養条件下で、分化転換は稀なイベントのみ50個のクローンのうちαβTCRに彼らVδ1+ TCRを変更します。
図1. FACSは、末梢血からのVδ1T細胞の単離プロセスのすべての段階を監視し分析します。（<末梢血リンパ球とそのコレセプターの発現CD3 +細胞でVδ1+細胞 （赤）の/強い>）配布。 CD4 +Vδ1+細胞は青（丸）で示されています。 （B）磁気標識に進む前に、Vδ1画分の染色。分離後の陽性画分のVδ1+細胞の（C）のFACS分析。数字は、ゲート細胞の割合を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2は、FACS Vδ1 CD4 +単離物の分析（A）CD4 +画分と （B）CD4 -フラクションCD4 +細胞を単離した後。数字は、ゲート細胞の割合を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
右の検出後のクローンの図3.表現型解析。（A）新たに単離したクローンのTCR組成とコレセプターの発現。 Vδ1とVγ9TCRはCD3およびCD4と共発現です。 （B）CD4 +Vδ1+クローンにおける分化転換の過程。 TCR発現（上）、および共受容体の発現（下）18の変化の変化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
その正磁気細胞分離のためVδ1およびCD4：希少（T-）細胞エンティティ、すなわちVδ1+ CD4 + T細胞の表現型、生物学と機能を研究するために、我々は二つのマーカーを使用していました。 CD4は、Tヘルパー細胞上に発現されるのに対し、Vδ1は、単球および樹状細胞上に低レベルで、および造血前駆細胞上で非常に低レベルで、オーファン受容体です。
高純度の細胞の濃縮および選択するための技術は、蛍光は細胞選別（FACS）、蛍光標識に基づいてサブ集団に細胞集団を分離する技術を活性化することを含みます。フルオロフォア結合抗体を用いて染色された細胞は、それらが結合されたているフルオロフォア（S）に応じて互いから分離することができます。ソーターは唯一の必要性は、それ自体のソートされている場合に便利です98％19、に近い純度を達成することができます。この手法の欠点は、選別された細胞は、細胞VIの減少を示すことを含みます能力、およびtransdifferentionのための私達の標的集団でも減少した可能性。選別後の減少した細胞生存率は、剪断力及びFACSを細胞に課すことが、流体力学的ストレスに起因すると仮定されます。また、実行可能なおよびその後の培養のための汚染なしの細胞を維持するために、実験を管理することは困難である無菌無菌状態で行われるべきです。また、FACS分類は、ソートのために細胞の高い数値を推奨しています。
単離キットは、直接磁気標識し、複数の表面マーカーによる細胞分離のためのいくつかの会社から開発されています。彼らの戦略は、酵素的または競合的にそれが結合した構造からの磁気ラベルを削除リリース試薬を使用して最初のソート後の細胞からの磁気ラベルの除去に依存しています。これは、金利股関節の他の表面マーカーのための第二磁気標識細胞を分離することができtは、磁性ビーズに直接または間接的標識を使用することによって達成されます。ラベルの除去は、長時間（2〜8℃で、氷上で）低温で働く化学的および繰り返し洗浄工程への曝露することをお勧めします。二番目のパラメータ分離の標的細胞は、残留磁気標識細胞ofany除去のためであっても第二ラウンドの選択（最初の分離後の陽性画分の<10％の標的細胞）の後に低濃度で存在する場合に必要とされています。この手順は、ほかに標的細胞の実質的な損失を持つ繰り返しによる洗浄工程-で、機械的および生理学的なストレス要因に対する細胞の損傷および機能喪失を誘導するための高リスクに。 FACSソーティングと比較しかし細胞調製物は、無菌のままであり、より小さな細胞数をソートすることができます。
私たちが追求する戦略は、二つの連続して実行正の選択を組み合わせた、まだ最初のラベルの除去は、Mとして必要とされていませんagneticラベルは、複数のログフェーズによってその磁力の大きさが異なります。ビーズ型磁気標識最初の抗蛍光色素は、50nmの直径と、小さいが、第二の抗蛍光色素は、このように第一の磁性ラベル20の音量/強さを超える、ビーズ型対策1ミクロン〜4.5磁気標識90倍。さらに、第2の正の並べ替えは、細胞が標識された細胞は、バイアルの壁に取り付けられているように、磁気装置に入れて1.5ミリリットルバイアルに残るように、その磁気カラム保持/リリースに関連付けられている、細胞ストレスを省略しています。洗浄手順は、小規模に抑えることができます。これは、詳述プロトコルは、細胞の損失を減少させ、細胞がより少ない操作を経験し、より高速なマルチソートキット分離システムを使用してプロトコルより単離プロセスを通過するので、細胞の生存率を増加させます。
したがって、このプロトコルは、さらに少数の細胞および他の利点を分離することができます。分類された細胞は、STEまま手順全体波立たせます。限界希釈を使用して、その後のクローニング実験は、単離された細胞の個々のメンバーの効率的な拡張が可能になり、ここでは非常に希少Vδ1+ CD4 + T細胞エンティティ18を γδ。選別された細胞は、優れた生存率およびクローン原性を示し、完全に機能している場合。
将来の用途のために、異なる磁気標識を使用して、2つの連続して行う正の選択を組み合わせることによって（動員）白血球アフェレーシス産物、臍帯血および骨髄、定量的に選択し、正常に新たに描画された末梢血を含む多様なヒトの供給源からの小さなT細胞エンティティを精製するために、この方法を使用その磁力ので、保持容量の大きさだけ。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
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