Abstract
흉선, αβ T 세포와 척추 동물에서 적응 면역계의 주쇄의 생성을위한 주요 기관은, 긴 αβT 세포의 공급원으로서 만 고려되고있다. 그러나, 흉선 퇴화는 주변에 순진 αβT 세포의 대폭 감소 출력에 이르는 인생의 초기에 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, 심지어 백세인은 새로 인수 한 병원균에 대한 면역을 구축 할 수 있습니다. 최근의 연구 기능의 흉선 손실을 보상 할 수있다 경로의 그러나 우리의 이해는 여전히 rudimental 있으며, extrathymic αβT 전지 개발을 제안합니다. γδ T 세포는 주 조직에서 T 세포 서브 세트를 구성 타고난 림프구이다. 우리는 최근 보여 γδ T 세포의 서브 세트에 지금까지 뛰어난 기능을 인정받지 기인하는 CD4의 부족한 엔티티 Vδ1 + + γδ T 세포가 염증 상태의 세포 내로 αβT transdifferentiate있다. 여기, 우리 쪽말초 혈로부터이 선조의 분리 및 그 후속 재배 프로토콜 rovide. Vδ1 세포 양 우리가 상기 자성 라벨링 기술에 CD4 + 세포의 부족 부분을 대상으로 상기 제 2 단계이어서, 자성 비드를 이용하여 건강한 인간 공여자로부터의 PBMCs를 충실. 제 라벨링의 자력은 제 1 자기 라벨의 하나 초과하고, 따라서 관심 인구의 효율적인 양적 및 특정 양의 절연을 허용한다. 우리는 그 다음 세포를 복제하고 효율적으로 확장과 FACS 분석에 의해 생성 된 클론의 식별을 위해 필요한 기술과 문화 조건을 소개합니다. 따라서, 우리는 정제, 문화와 CD4 + Vδ1 + γδ T 세포의 생체 확장에 대한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 지식이 αβT 세포 progenitor`s 생물학 관련 연구 및 IDE하는 것을 목표로 사람들을위한 전제 조건입니다그 분화에 관여하는 분자 트리거를 ntify.
Introduction
척추 동물에서 세포 및 면역의 체액 부분으로 구성되어 적응 면역은 병원체에 대한 방어에 중요한 역할을한다. 항원의 광범위한 인식은 T 세포와 관련하여 흉선 1에서 주로 생성되는 것으로 가정 hyperpolymorphic B 및 T- 세포 수용체 (TCR / BCR)에 의해 매개된다. 이에는 골수로부터 유도 된 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포)는, 흉선 시드 최종적 모든 T 세포 계통을 발생주고 잘 정의 된 스테이지를 따라 차별화. 및 CD8 - - 흉선 시드 조상은 CD4이며, 따라서 미성숙, 더블 네거티브 (DN) 흉선 세포의 일부를 구성한다. 흉선에서 유래 신호는 자신의 계보 헌신과 αβ 또는 γδ T 세포 중 하나에 분화를 유도. DN2 / 3 흉선 세포에 기능적으로 재 배열 된 TCR-γ 및 TCR-δ 사슬 유전자의 발현은 세포 증식의 드라이브 δTCR 단지를, γ에 이르게γ의 ΔT 세포 2,3로 분화를 촉진 거라고. 대조적으로, preTCR하여, Pt를 구축 preTα 페어링 수 기능적 TCR-β 사슬의 재 배열은, 전사 DN3의 흉선 세포의 TCR-γ 사슬의 사일런 및 CD4 + CD8 + 이중 양성 흉선 세포 (4)에 그들의 전이를 유도 . 이 단계에서, TCR-α 사슬의 재조합은 따라서 이들 세포 돌이킬 5-9 생산 γδTCR를 폐지, TCR-α 궤적 내에 멈춰서 TCR-δ 궤적 삭제를 발생한다. 재 배열 αβTCRs 이후자가 면역 (부정적인 선택)를 방지하기 위해 특정 임계 값을 초과 할 수 없습니다 약하게 (긍정적 인 선택을) 자기 MHC를 결합 할 수있는 능력, 선택됩니다. MHC 클래스 I 또는 II를 결합 그들의 능력에 따라, 선택된 셀 αβT은 단일 양성 CD4 + 또는 CD8 + T 세포, 흉선 출구로서 나이브 T 세포로 발달.
그러나, 흉선의 퇴화 일찍 거의 소멸 후 사춘기 10 나이브 T 세포의 기하 급수적으로 감소 출력에 최고의 인생에서 시작됩니다. 그럼에도 불구하고, T 세포 풀의 크기는 포스트 흉선 항상성 T 세포의 증식 및 수명이 긴 면역 메모리 (11)의 확산에 의해 부분적으로 만 설명 될 수 수명 내내 일정하게 유지된다. 따라서 extrathymic T 세포 발달이 발생한다. 최근의 연구-에서 extrathymic 기능 αβ T 세포 12-17을 초래 사이트 - 준 αβT 세포 전구 세포를 특징으로 상당한 매력을 얻고있다. 그러나, 흉선 독립적가 αβT 세포로 분화 extrathymic αβT 세포 전구체에 대한 자세한 지식은 우리가 그들이하여 수행 경로에있는 배경으로 단편이다.
우리는 최근 Vδ1 +의 작은 T 세포 개체를 식별 (18), 같은 CD4 + γδT 세포. 흥미롭게 잠재적 새로운 항원을 인식 할 수 있도록, 따라서 레퍼토리의 다양성을 확대 후 흉선 T 세포의 항상성 증식 Vδ1 CD4 + 세포의 분화 새로운 T 세포 수용체를 생성하고, 반대로 보호 수도 새롭게 취득한 병원체에 대해 숙주. 이는 T 세포의 가소성에 가산 extrathymic T 세포 개발 원경 인정받지 새로운 경로를 추가한다.
대물이 αβT 셀 extrathymic 개발 precursor`s 트리거 이들 마커 분자를 식별하기위한 소스로부터 림프 정량적 격리는 단일 세포 클론의 발생 및 그 효율적인 확장이 필수적이다.
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Protocol
윤리 문 : 모든 절차는 헬싱키 선언에 따라 수행하고, 튀빙겐 대학의 임상 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (38 / 2009B02 470 / 2013B02 프로젝트).
말초 혈액 단핵 세포의 1. 분리 (PBMC를)
- 1,000 IU의 헤파린 황산을 포함하는 50 ML의 주사기를 사용하여 정맥 천자를 통해 건강한 지원자에서 50 ~ 100 mL를 취하여 혈액 1 희석 : PBS (PH = 7.2)과 (2).
- 15 ml의 혈액 분리 솔루션에 PBS 용액 등 Biocoll로 (D = 1.077 ㎍ / ㎖) 50 ㎖에 원뿔 튜브 : 조심스럽게 혈액 35 ml의 레이어. 실온에서 800 XG에 15 분 동안 원심 분리기.
참고 : 브레이크는 사용할 수 없습니다. - 피펫 림프 층의 세포를 수집하고, 적어도 50 ml의 PBS로 두 번 세포를 씻어 (400 XG에서 12 분간 원심 분리). 피펫과 원심 분리 한 후 상층 액을 제거합니다.
- 를 Lyse는 일시 중지 및 incub에 의해 적혈구 남아2-4 분간 저장성 완충액 1-5 mL를 림프 분획 ating.
주 : 노광, 용균 완충액의 양 기간이 사용될 용균 버퍼와 림프구 분획에 남아 적혈구의 양에 의존한다. - 12 분 동안 250 XG에서 PBS (1시 10분)와 세포와 원심 분리기를 희석하고, 이후에 재현 탁하고 12 분 동안 300 XG에 10 ml의 PBS에 한 번 세포 펠렛을 씻는다.
- PBS에서 림프구를 재현 탁하고 트리 판 블루에게 솔루션을 사용 노이 바 우어 계산 실에서 세포를 계산합니다.
참고 : 일반적으로,> 1 × 8 림프구가 100 ㎖에서받은 갓 말초 혈액을 그려.
Vδ1 T 세포의 격리 2.
- Vδ1 CD4 T 세포의 빈도를 결정하는 초기 FACS를위한 <1 × 106 림프구 절연 걸릴.
참고 :이 T 세포 개체의 인구 크기는 개인과 자신의 면역 상태에 따라 따라 크게 다를 수 있습니다. Typic아군, T 세포의 약 1 % 및 Vδ1 Vδ1 + + 세포의 1~5 %의 시간 CD4 +이다.- PBS가 2 % FCS, 5 mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 이루어져의 FACS 완충액으로 세포를 희석. 2 분 동안 660 XG에 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다. 약 100 ㎕의 FACS 완충액 환류 량은 후속 염색 충분하다. 간단히 소용돌이 5 μL는 FACS 염색의 증가 특이성을 실온에서 5 분 동안 시약 된 Fc-차단과 세포를 품어.
- 은 FC-차단 시약을 제거하지 않고 세포에 직접 인간 단일 클론 항체를 추가합니다. , CD8 (1 : 200)와 TCRαβ (1시 25분) : Vδ1 (1시 50분), CD3 (1시 50분), CD4 (200 1)에 대한 항체와 세포를 염색해야합니다. 해당 면역 글로불린 아이소 타입과 이소 제어를 준비합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 항체와 세포를 품어.
- (2 분 동안 원심 분리, 660 XG에) 1 ML의 외과 버퍼에 세포를 씻으, supern을 가만히 따르다atant 나머지 버퍼 볼륨 외과 인수를 진행합니다.
- 12 분 동안 원심 분리하여 (FACS 분석에 사용되지 않는다) 세포를 펠릿 화; 300g에; 8 ° C. 상층 액을 제거하고 1 × 10 7 세포 당 60 μL의 맥 버퍼 pelletin 셀을 재현 탁. 1 × 10 7 세포 당 20 μL 된 Fc-차단 시약을 추가하고 4 ℃에서 5 분 동안 품어.
- 직접 세포에 1 × 10 7 세포 당 10 μL FITC - 복합 항 - 인간 Vδ1 항체를 추가합니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 12 분 동안 품어.
- 14 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 세척 (12 분 동안 원심 분리기를 300 g에서 8 ° C)를. 완전히 뜨는을 취소하고 1 × 7 세포 당 80 μL의 맥 버퍼에있는 세포를 재현 탁.
- 1-2 × 10 5 세포를 가지고 FACS 분석하여 라벨의 확인을 위해 100 μL FACS 버퍼를 희석. 더 이상의 첨가제는이 단계에서 필요하지 않습니다. suffi이 있는지 확인Vδ1의 밝기 효율적인 차이 - 그리고 Vδ1 + 세포. 그렇지 않은 경우, 반복) 2.3) 2.4 단계.
- 나머지 셀에 1 × 10 7 세포 당 20 μl를 방지 FITC 마이크로 비드를 추가, 잘 섞는다 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 품어. 그 후, (300 XG에서 12 분 동안 원심 분리기 8 ° C)를 최소 10 ml의 맥 버퍼를 사용하여 세포를 씻으십시오.
- 원심 분리 동안, 500 μL의 맥 버퍼와 자석에 배치 미리 냉각 자기 열 평형.
- (세포 수보다 높은 1 × 8이 볼륨 따라 규모를 확대) 500 μL의 MACS-버퍼에 세포를 재현 탁하고 컬럼에 조심스럽게 세포를 적용합니다. Vδ1 함유 관류 수집 - 셀.
- 500 μL의 맥 버퍼로 열 세 번 세척하고 같은 튜브에 다시 흐름을 통해 수집합니다. 저수지 컬럼에 버퍼를 적용하기 전에 비어 있어야합니다.
- 자기 장치에서 열을 제거하고 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다. 빨리 단단히 열에 플런저를 밀어 1 ml의 맥 버퍼와 컬럼을 세척하십시오. 튜브에 용출액을 수집합니다.
주 :> 98 %의 순도를 얻기 위해, 그것은 일반적으로 반복 할 필요가 초 컬럼) 2.7부터 2.9까지 단계. - (2.1.2 참조) 이전과 같은 항체 패널 FACS 분석 (18)에 의해 세포의 순도를 확인하고 세포를 카운트.
Vδ1CD4 + T 세포의 3. 분리
- > 30 초 동안 소용돌이와 CD4 비즈의 25 μl를 재현 탁. 1 분 동안 자석에 튜브를 배치하여 1.5 ml의 반응 튜브에 1 ㎖의 MACS 완충액 비드 (제조자에 의해 도시 된 바와 같이 최소한의 양)을 세척한다. 작은 규모의 피펫 (200 μL) 조심스럽게 뜨는을 취소하고 맥 버퍼의 원래 볼륨에서 구슬을 재현 탁.
- 1 Vδ1 + 세포 (원심 분리기를 펠릿2 분; 등) 300 XG에서하면 뜨는을 대기음 500 μL의 맥 버퍼의 모든 Vδ1 + 세포를 재현 탁하고 구슬이 들어있는 튜브에 추가합니다. 적극적으로 믹스 (회 전자에서, 예를 들어) 일정한 경사와 4 ° C에서 20 분 동안 품어.
- 2 분 동안 자석에 세포를 포함하는 튜브를 놓는다. 뚜껑에는 잔해가 없는지 확인합니다.
주 : CD4 + 세포는 자성 비드를 결합하고 자석에 대향 관의 측면에 부착 한 것이다. - 소규모 피펫을 사용하여 Vδ1가 + 세포를 - 조심스럽게 자기 장치 내부에 튜브를 유지하면서 뚜껑을 열고 CD4이 포함 된 상층 액을 수집합니다. 별도의 튜브에 Vδ1가 + 세포 인구에서 CD4 세포 또는 구슬 남아 가능성 피하기 위해 다시 자석으로이 관을 배치 - CD4를 놓습니다.
- CD4 워시 - 세포를 5 ml의 맥 - 버퍼 (원심 분리기 12 분 동안 300 XG에)ND 100 μL 용지 당 1 × 105 세포의 농도로 재현 탁 그들을. CD4 - 세포 용이 (4.2) 아래에 주어진 조건에서 재배 할 수있다.
- , 외부 자계의 CD4 + 세포 표적과 관을 배치 500 μL의 MACS 완충액에 세포를 재현 탁하고, 자기 장치에 다시 넣어. 반복은 더 높은 순도를 얻기 위해 두 번 3.3-3.5 단계를 반복합니다. 피펫으로 상층 액을 제거
- 100 μL 문화 미디어에서 CD4 + 세포 (RPMI 1640, 10 % FCS, 1 % L 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신)를 재현 탁하고 비드 분리 용액 10 μl를 추가합니다. 일정한 경사 (예를 들면, 회전)에 45 분 동안 RT에서 배양한다.
- 1 분 동안 자석에서 세포를 놓습니다. 신중 소규모 피펫을 사용하여 비드없는 Vδ1 + CD4 + 세포를 포함하는 상층 액을 모은다.
- 자석의 외부, 100 μL 문화 미디어와 반복과 구슬을 재현 탁CD4 + 세포의 높은 세포 수를 얻기 위해 두 번 3.6 및 3.7 단계를 반복합니다.
- 세포를 펠릿 화 (12 분, 300 XG에 원심 분리기)와 피펫 팅에 의해 완전히 상층 액을 버린다. 신선한, 미리 예열 미디어 세포를 재현 탁하고이를 계산합니다. 2.1.1-2.1.3 단계에 묘사 된 FACS 분석에 의해 Vδ1 + CD4 + 세포의 순도를 검사합니다.
제한 희석 4. 단일 세포 복제
- 1.1-1.6에 도시 된 바와 같이, 동종 기증자로부터 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리.
- γ 방사선을 사용하여 25 ml의 배양 배지에서 80 Gy를 2.5 × 10 7 동종 PBMC를 조사.
- 96- 웰 U 형 플레이트에 5 × 104 공급기들을 조사 피더 세포에 IL-2 (200 U / ㎖), IL-7 (20 NG / ㎖) 및 PHA (2 μg의 / ㎖)를 첨가하고, 분산 물론 당 50 μL 세포.
- 50 μL 당 0.3 세포의 농도로 Vδ1 + CD4 + 세포를 희석. 피펫TE 각 웰 조사 세포 및 사이토 카인에 형질 세포 용액 50 μL.
주 : 따라서, 사이토 카인을 100 U / ㎖의 IL-2, 10 NG / ml의 IL-7 및 1 μg의 / ㎖의 PHA의 최종 농도로 희석된다. 37 ° C, 5 % CO 2 분위기에서 가습 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 배양한다.- 선택적으로, 클론과 동일한 배양 조건에서 대량으로 배양 Vδ1 + CD4 + 세포를 정제하고 남은 배양.
- 사이토 카인과 신선한 미디어 3-4 일마다 세포를 제공합니다. 이를 위해, 50 μL 피펫 신선한 배지로 웰에 배지 교환 절반. 모든 보충에 사이토 카인의 2 배 농도를 추가합니다. 수유 아니라 다른 모든 라운드 당 5 × 4 조사 피더 세포를 추가합니다.
- 배지 및 콜로니 형태의 색상을 변경할 따라서 그들은 대사로서, 제 클론 3-4 주 후 가시가 관찰하고, 현미경 사용.
참고 : 모피를 들어THER 재배, 잘 클론을 재현 탁하고 96 웰 플레이트를 분리 전송합니다. 2.1.1-2.1.3에서 나타낸 바와 같이 FACS를 통해 세포를 분석한다. 이러한 조건에서 유지 클론은 결국 αβTCR에 Vδ1에서 자신의 TCR을 변경할 수 있습니다. 이 분화에 대한 시점은 복제하는 복제에 따라 다릅니다.
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Representative Results
도 1은 다른 단계 및 말초 혈액으로부터 Vδ1 T 세포의 분리의 결과를 도시한다.도 1a는 CD3 + 림프구 Vδ1 + 세포의 전형적인 분포뿐만 아니라 Vδ1 + 인구의 공 수용체의 발현을 나타낸다. 이 도너에서 Vδ1 + 세포 (적색)의 주파수는 총 림프구 수가 2.3 %이고 Vδ1 + 림프구의 CD4 발현 (녹색) 2.6 %이다. 요컨대, 분리를위한 표적 집단이 도너의 총 림프구의 0.06 %를 나타낸다.도 1b는 자기 라벨로 진행하기 전에 Vδ1 + 세포에 대한 최적의 염색 강도를 나타낸다. Vδ1 + 세포를 효율적으로 분류하고 magn으로 분리 할 수 있도록 차 항체로 염색하는 것은 분명히 구별 Vδ1 네거티브 및 포지티브 Vδ1 인구 초래한다etic 구슬.도 1C는 FACS 분석에 의해 분리 절차 후에 Vδ1 + 세포를 나타낸다. Vδ1 +의 순도는 CD3 + 세포의 대개> 99 %이다. 순도를 증가시키기 위해, 분리 된 세포는 제 2 격리 컬럼에 적용된다. 상당한 셀 손실이 결과는 그러나이 잠재적 TCRαβ + CD4 + 세포 오염의 양적 제거에 리드 단계를 반복합니다.
CD4 + 분리의 결과는도 2에 도시되어있다. 인해 세포가 CD4 + 세포의 접근 순도 복제 제한 희석 단일 셀에서 확장되므로 CD4 + Vδ1가 + 세포, 및 100 % 미만의 수의 로우 번호 용인. 여기에 표시된 실험, Vδ1 + CD4 + 세포의 순도에 있던 약 90 % (그림 2A, 바로 오) 이후 단일 세포 복제는 60 개 이상의 Vδ1 결과+ CD4 + T 세포 클론. 반대로, CD4 + Vδ1 - 다른 분획에는 CD4 + 세포를 상기 분리 전략의 효율을 강조 (도 2b)를 유지하지 않는다. 참고로, CD4 + 세포 (파란색) CD4보다 구별 낮은 수준에서 Vδ1을 표현 - 세포 (적색) (그림 2A, 모두 말). 따라서, Vδ1 + 세포의 염색 과도한-AS에 기술 된 프로토콜에 대한 Vδ1 + T 세포 풀에서 CD4 + 분획의 충분한 표시하고 성공적인 분리해야합니다.
도 3a에, 새로운 클론의 전형적인 표현형이 제시된다. TCR은 Vδ1과 Vγ9 체인 클론 세포의 CD3와 CD4. 그림 3b는 제시된 기술로 고립 된 하나의 클론의 분화의 과정을 묘사 표현으로 구성되어있다. 분화는 downregulati를 포함αβTCR의 드 노보 식으로 병렬되어 낮은 발현 수준에 V'1 체인의에. 이것은 결국 하나의 양성 αβTCR 발현 T 세포에 상승을 제공하는 과도 TCR 더블 양성 표현형으로 이어집니다. 공동 수용체 발현은 분화의 과정에서 변경 될 수 있습니다. 흉선 세포와 유사하게, CD4 + CD8 + DP 표현형은 결국 SP CD4 + 또는 CD8 + αβ T 세포 하나에 개발되는 발생할 수 있습니다. 여기에 제시된 배양 조건에서 분화는 αβTCR에 자신의 Vδ1 + TCR을 변경 드문 경우 전용 한 50 클론 중입니다.
도 1 FACS 말초 혈액으로부터의 V δ1 T 세포의 분리 공정의 모든 단계를 모니터링 분석한다. (</ 말초 혈액 림프구과 공동 수용체 발현의 CD3 + 세포의 Vδ1 + 세포 (적색의 강한>) 유통). CD4 + Vδ1 + 세포는 파란색 (원)에 표시됩니다. 자성 표지로 진행하기 전에 Vδ1 분획 (B) 염색. Vδ1가 차단 후 긍정적 인 부분의 세포를 +의 (C) FACS 분석. 숫자는 문이 세포의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 분수 - 그림 2. 외과는 V의 δ 분석 한 CD4 +는 (A) CD4 + 분수와 (B) CD4를 분리CD4 + 세포의 분리 후. 숫자는 문이 세포의 비율을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
바로 감지 후 복제 그림 3. 표현형 분석. (A) 갓 고립 된 클론의 TCR 조성과 공동 수용체 발현. Vδ1 및 Vγ9 TCR은 CD3와 CD4와 공동으로 표현된다. CD4 + Vδ1 + 클론의 분화의 (B) 프로세스. TCR 식 (위), 공동 수용체 발현 (아래) (18)의 변화를 변경합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
긍정적 자기 세포 분리를 위해 Vδ1 및 CD4 : 부족한 (T-) 세포의 표현형 엔티티, 생물학 및 기능을 연구하기 위해, 즉 Vδ1 + CD4 + T 세포, 우리는 두 개의 마커를 사용 하였다. CD4가 단핵 세포 및 수상 세포에 낮은 레벨, T 헬퍼 세포에 발현 한 조혈 전구 세포에 매우 낮은 레벨에있는 반면 Vδ1는 고아 수용체이다.
고순도 세포 농축하고 선택하기위한 기술은 형광 세포 분류 (FACS), 형광 라벨에 기초하여 하위 집단으로 세포 집단을 분리하는 방법을 포함 활성화. 형광 접합 된 항체를 사용하여 염색 된 세포는 다른 어느 형광 물질은 이들이 결합에 의존 한 하나로부터 분리 될 수있다. 종류로는 유일한 필요성 자체를 정렬하는 경우에 유용 % 19 98에 가까운 순도를 달성 할 수있다. 이 기법의 단점은 정렬 된 세포 세포 VI의 감소를 보여주는 것을 포함능력, 그리고 우리의 목표 또한 인구 transdifferention에 대한 감소 된 전위. 정렬 후 감소 된 세포 생존율은 전단력과 외과 세포에 부과하는 것을 유체 역학적 스트레스로 인한 것으로 가정한다. 또한, 가능한 후속 문화에 대한 오염없이 세포를 유지하기 위해 실험을 관리하기 어렵다 무균 멸균 조건에서 수행되어야한다. 또한, FACS 정렬은 정렬 세포의 높은 숫자를 권장합니다.
분리 키트는 직접 자기 라벨링 및 여러 표면 마커에 따라 세포의 분류에 대한 여러 회사에서 개발되었다. 이들 전략은 하나 또는 효소 적으로 경쟁하는 바인드되었던 구조에서 자기 라벨을 제거 분리 시약을 사용하여 첫 번째 정렬 후 셀로부터 자기 라벨의 제거에 의존한다. 이 관심 그쪽의 또 다른 표면 마커에 대한 제 2 자기 라벨 및 세포의 분리를 할 수 있습니다t는 자성 비드에 직접적 또는 간접적으로 표지 중 하나를 사용함으로써 달성된다. 라벨의 제거는 장기간의 기간, 화학 물질에 대한 노출과 반복 세척 단계에 대한 (2-8 ° C에서, 얼음에) 낮은 온도에서 작동하는 것이 좋습니다. 두번째 파라미터 분리 대상 세포는 잔류 자기 표지화 된 세포 ofany 제거 짝수 번째 라운드의 선택 (1 분리 후의 긍정적 분획 <10 %의 표적 세포) 후에 낮은 농도로 존재하는 경우 필요하다. 이 절차는 IS-또한 표적 세포의 실질적인 손실을 갖는 반복에 의한 세척 단계-에 의한 기계적 스트레스에 생리 세포 손상과 기능의 상실을 유발하는 위험이 높은 것이다. FACS 분류와 비교하지만 세포 제제는 멸균 유지하고 작은 세포 수를 정렬 할 수있다.
우리가 추구하는 전략은 두 연속 실행 양성 선택을 겸비한, 아직 제 라벨의 제거는 m으로 요구되지 않는다agnetic 라벨은 여러 로그 단계하여 자기 힘의 크기에 차이가 있습니다. 비드 형 자기 - 표지 제 안티 형광 색소가 50 nm의 직경을 갖는 작은 반면, 두 번째 항, 형광 따라서 제 1 자기 라벨 (20)의 체적 / 강도를 초과 비드 형 대책 1 ㎛ 내지 4.5 자기 - 표지 90 배. 또한, 제 2 포지티브 종류의 세포 스트레스를 생략 세포 표지 세포가 유리 병의 벽에 부착되도록 자기 장치에 넣고 1.5 ml의 유리 병에 남아있는, 즉 자기 열 유지 / 해제와 관련된다. 세척 절차는 소규모로 유지 될 수있다. 이 프로토콜은 세포 손실을 감소시키고, 세포가 적은 조작을 체험 multisort 분리 키트 시스템 프로토콜을 이용하여보다 빠르게 분리 공정을 통과 이후 세포 생존을 증가 정교.
따라서,이 프로토콜은 심지어하는 소수의 세포 및 다른 이점을 분리 할 수 : 정렬 세포 인트 남아절차 전반에 걸쳐 화나게. 제한 희석을 사용하여 후속 복제 실험은 여기에 분리 된 세포의 개별 구성원의 효율적인 확장이 매우 부족 Vδ1 + CD4 + γδ T 세포 엔티티 (18)를 할 수 있습니다. 정렬 세포는 뛰어난 생존 능력과 clonogenicity을 표시하고 완전한 기능을 유지.
미래의 애플리케이션을 위해 정량적으로 선택하고 성공적 갓 그린 말초 혈액 등 다양한 인간 출처 작은 T 세포 개체를 정화이 전략을 사용하여, (동원) 백혈구 성분 채집 제품 다를 자기 라벨을 사용하여 두 개의 연속적으로 수행 양성 선택을 조합함으로써 제대혈 및 골수 자신의 자력에 크기 때문에 유지 용량으로.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
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