Abstract
Тимус, основной орган для генерации ар Т-клеток и позвоночника адаптивной иммунной системы позвоночных, уже давно рассматривается как единственный источник αβT клеток. Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к снижению производительности резко наивных αβT клеток в периферии. Тем не менее, даже долгожители могут построить иммунитет против вновь приобретенных патогенов. Последние исследования показывают, развитие extrathymic αβT клеток, однако наше понимание путей, которые могут компенсировать потери тимуса функции по-прежнему рудиментарные. γδ Т-клетки-лимфоциты, что врожденные составляющие основную подмножество Т-клеток в тканях. Мы недавно приписывали до сих пор недооцененный выдающийся функцию к γδ Т-клеток подмножества, показав, что мало субъект CD4 + Vδ1 + γδ Т-клетки могут трансформироваться в αβT клеток в воспалительных процессах. Здесь мы рrovide протокол для изоляции этого прародителя из периферической крови и ее последующего выращивания. Vδ1 клетки положительно обогащенные от РВМС от здоровых доноров с использованием магнитных шариков, после чего на второй стадии, где мы нацелены на дефицитный фракцию CD4 + клеток с последующей техники магнитного маркировки. Магнитная сила второго маркировки превышает одним из первых магнитного этикетке, и, таким образом позволяет эффективно, количественный и конкретные положительные изоляции населения интерес. Затем мы вводим техники и культуры условие, необходимое для клонирования и эффективно расширять клетки и для идентификации созданных клонов анализа FACS. Таким образом, мы предоставляем подробный протокол для очистки, культуры и экс естественных условиях расширения CD4 + Vδ1 + γδ Т-клеток. Это знание является непременным условием исследований, которые относятся к этой αβT сотовые progenitor`s биологии и для тех, кто стремиться к IDEntify молекулярные триггеры, которые участвуют в его трансдифференцировки.
Introduction
У позвоночных, адаптивный иммунитет, который структурирован сотовый и гуморального звена иммунитета играет важную роль в защите от патогенов. Признание широкого спектра антигенов опосредуется hyperpolymorphic Т- и В-клеточных рецепторов (TCR / BCR), который в связи с Т-клетками, как предполагается, производится в основном в тимусе 1. Туда, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), полученные из костного мозга, семя тимуса и дифференцироваться строго определенные этапы, наконец, давая начало всем клеточных клонов Т. Тимуса посева предшественники CD4 - и CD8 - и, таким образом составляют незрелые, двойное отрицание (DN) тимоцитов фракции. Тимус-полученные сигналы, то индуцировать их коммитирование и дифференциацию в любой ар или γδ Т-клеток. Выражение функционально перестроенных ТКС-Г и TCR-дельта генов цепей в Dn2 / 3 тимоцитов приводит к Г δTCR комплексы, которые приводят сотовой ап оружияd способствовать дифференциации в γ & Delta; t клеток 2,3. В противоположность этому, перестановка функционального TCR & beta; цепи, которые могут спариваться с preTα построить preTCR рт, индуцирует транскрипцию молчание ТКР гамма цепи в DN3 тимоцитов и их переход в CD4 + CD8 + двойной положительных тимоцитов 4 , На этом этапе, рекомбинация ТКР -цепи имеет место, удалив TCR-дельта локус, что прижимается в TCR-альфа локуса, таким образом, отменяя продукции в γδTCR в этих клетках безвозвратно 5-9. Переставленные αβTCRs впоследствии отобраны за их способности связывать собственного MHC слабо (положительный выбор), который не может превышать определенный порог, чтобы избежать аутоиммунных реакций (негативный отбор). По своей способности связывания МНС класса I или II, выбранные ячейки αβT развиваться в клетках одного-положительных CD4 + или CD8 + Т, выход из тимуса, как наивных Т-клеток.
Тем не менее, инволюция тимуса начинается рано в жизни, ведущей к экспоненциально уменьшается выход наивных Т-клеток, что является почти потушен после отрочества 10. Тем не менее, размер ячейки бассейн Т остается постоянным на протяжении всей жизни, что может быть объяснено только в рамках пост-тимуса гомеостатической пролиферации Т-клеток и пролиферации долгоживущего иммунологической памяти 11. Следовательно, extrathymic развитие Т-клеток должно произойти. Недавние исследования приобрела значительный аттракцион, который характеризуется клеток предшественников αβT, которые, по крайней extrathymic сайтов-породили функциональный ар Т-клеток 12-17. Тем не менее, детальное знание о extrathymic предшественников клеток αβT, что независимо от тимуса дифференцируются в клетки αβT как фрагментарно в качестве фона, что у нас на маршруте, таким образом, они берут.
Мы недавно определили небольшой объект Т-клеток Vδ1 + CD4 + клетки γδT качестве extrathymic αβT клеток prognitor 18, который, когда, выделенных из периферической крови здоровых доноров может трансформироваться в αβT клеток в мягком воспалительного среды. Интересно и то, в отличие от гомеостатического распространения пост-тимуса Т-клеток, трансдифференцировкой Vδ1 CD4 + клеток генерирует новые Т-клеточные рецепторы, тем самым расширяя репертуар разнообразие, так что потенциально новые антигены могут быть признаны и могут защита хозяина против вновь приобретенных патогенов. Это добавляет к пластичности Т-клеток и добавляет так далеко недооцененными новый путь для развития extrathymic Т-клеток.
Количественный изоляция от лимфоцитов источников, генерация одного клеточных клонов и их эффективное расширение имеют важное значение для цель идентифицировать те маркеры и молекулы, которые вызывают это αβT клеток precursor`s extrathymic развития.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этика себе: Все процедуры были проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией и было одобрено клинической Комитета по этике в университете Тюбингена на (проекты 38 / 2009B02 и 470 / 2013B02).
1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК)
- Возьмем 50-100 мл из здорового добровольца с помощью венепункции, используя 50 мл шприц, содержащий 1000 МЕ гепарина сульфата и разбавленной крови 1: 2 PBS (рН = 7,2).
- Тщательно слой 35 мл крови: PBS раствора на 15 мл крови, разделяющей раствор, такой как Biocoll (D = 1,077 г / мл) в 50 мл коническую трубку. Центрифуга в течение 15 мин при 800 х г при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тормоз не должен использоваться. - Сбор клетки лимфоцитарного слоя с помощью пипетки и промыть клетки дважды в, по меньшей мере 50 мл PBS (центрифуги в течение 12 мин; 400 мкг на). Удалить супернатант после центрифугирования с помощью пипетки.
- Lyse остальные эритроциты путем приостановления и incubэксплуатации данного лимфоцитарный фракцию с 1-5 мл гипотонического буферного раствора дл 2-4 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность воздействия и объема лизиса буфер зависит от используемого лизирующим буфера и количества красных кровяных клеток, оставшихся во фракции лимфоцитов. - Развести клетки с PBS (1:10) и центрифугируют при 250 х г в течение 12 мин, а затем ресуспендируют и промывают осадок клеток один раз в 10 мл PBS при 300 х г в течение 12 мин.
- Ресуспендируют лимфоцитов в PBS и считать клетки в счетной камере Neubauer использованием трипанового синий раствор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило,> 1 х 10 8 лимфоцитов, полученных от 100 мл свежего обращается периферической крови.
2. Выделение Vδ1 Т-клеток
- Take <1 х 10 6 изолированных лимфоцитов в течение начальных FACS, определяющих частоту Vδ1 CD4 Т-клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Численность населения этого Т-клеток лица могут сильно отличаться между частными лицами и в соответствии с их иммунологической государства. Typicсоюзник, около 1% Т-клетки Vδ1 + и около 1-5% Vδ1 + клеток CD4 +.- Развести клеток с 1 мл FACS буфера, который состоит из ФБР, содержащим 2% FCS и 5 мМ ЭДТА. Центрифуга при 660 х г в течение 2 мин и декантируют супернатант. Объем рефлюкс около 100 мкл FACS буфера является достаточным для последующим окрашиванием. Кратко вихря и инкубировать клетки с 5 мкл Fc-блокирующий реагент в течение 5 мин при комнатной температуре повышенной специфичностью окрашивания FACS.
- Добавить человеческих моноклональных антител непосредственно к клеткам без удаления Fc-блокирующего реагента. Убедитесь, что пятно клеток с антителами против Vδ1 (1:50), CD3 (1:50), CD4 (1: 200), CD8 (1: 200) и (1:25 TCRαβ). Подготовьте контроль изотипа с соответствующими изотипов иммуноглобулинов. Инкубируйте клетки с антителами в течение 20 мин при 4 ° С в темноте.
- Вымойте клеток в 1 мл FACS буфера (центрифуги в течение 2 мин, при 660 мкг), переливать supernatant и приступить к приобретению FACS в остальном объеме буфера.
- Гранулирование клетки (которые не используются в анализе FACS) центрифугированием в течение 12 мин; на 300 г; 8 ° С. Удалить супернатант и ресуспендируют клетки pelletin 60 мкл MACS-буфера на 1 х 10 7 клеток. Добавить 20 мкл Fc-блокирующего реагента для 1 х 10 7 клеток и инкубируют в течение 5 мин при 4 ° С.
- Добавить 10 мкл ФИТЦ-конъюгированного антитела против человеческого антитела Vδ1 для 1 х 10 7 клеток непосредственно к клеткам. Инкубируют в течение 12 мин при 4 ° С в темноте.
- Промыть клеток с использованием 14 мл MACS-буфера (центрифуги в течение 12 мин; на 300 г; 8 ° C). Удалите супернатант полностью и ресуспендирования клеток в 80 мкл MACS буфера на 1х10 7 клеток.
- Принимать по 1-2 х 10 5 клеток и разбавить их в 100 мкл FACS буфера для проверки маркировки путем анализа FACS. Никаких дополнительных добавок не требуется для этого шага. Убедитесь, что есть suffiРазница циент яркости для Vδ1 - и Vδ1 + клеток. Если это не так, повторите шаги 2.3 и 2.4)).
- Добавить 20 мкл анти-FITC микрошарики на 1 х 10 7 клеток на оставшиеся клетки, хорошо перемешать и выдержать в течение 15 мин в темноте при 4 ° С. После этого промыть клетки с помощью по меньшей мере 10 мл MACS буфера (центрифуги в течение 12 мин, при 300 х г; 8 ° C).
- В центрифугирования уравновесить предварительно охлажденный магнитного колонку помещают в магните с 500 мкл буфера MACS.
- Ресуспендируют клеток в 500 мкл буфера MACS-(для количества клеток выше, чем 1 × 10 8, наращивать этот объем соответственно) и тщательно применять клетки в колонку. Сбор проточные, содержащий Vδ1 - клетки.
- Промыть колонку три раза 500 мкл буфера MACS-и собирать проточные снова в той же пробирке. Следует отметить, что резервуар должен быть пустым перед применением буфера на колонку.
- Удалить столбец из магнитного устройства и поместите его в 15 мл коническую пробирку. Быстро промыть колонку с 1 мл буфера MACS, крепко нажимая на поршень в колонну. Собирают элюат в пробирку.
Примечание: Для того чтобы получить чистоту> 98%, как правило, необходимо повторить шаги 2,7-2,9) с второй колонке. - Проверка чистоты клеток путем FACS анализа 18 с тем же антителом панели, как и раньше (см 2.1.2) и подсчет клеток.
3. Выделение Vδ1CD4 + Т-клеток
- Ресуспендируют 25 мкл из бисера CD4 с вихрем для> 30 сек. Вымойте бисером (минимальное количество, как изображено на производителя) в 1 мл буфера MACS в 1,5 мл реакционной трубки путем размещения трубы в магнит в течение 1 мин. Удалите супернатант осторожно малого пипетки (200 мкл) и ресуспендируют бусины в первоначальный объем MACS-буфера.
- Гранулирование Vδ1 + клеток (центрифуги для 12 мин; 300 мкг) и аспирации супернатант и ресуспендирования все + клеток Vδ1 в 500 мкл MACS-буфера и добавить их в пробирку, содержащую бусы. Смешайте энергично и инкубировать в течение 20 мин при 4 ° С с постоянным наклоном (например, в ротатор).
- Поместите пробирку, содержащую клетки в магните в течение 2 мин. Убедитесь, что нет остатков в крышке.
Примечание: CD4 + клетки были связаны будет магнитных шариков и приложить к стороне трубки, обращенной к магнит. - Осторожно откройте крышку, держа трубку в магнитном устройстве и собирать верхний слой, который содержит CD4 - Vδ1 + клеток с помощью мелкого пипетки. Поместите CD4 - Vδ1 + клеток в отдельную пробирку и поместите эту трубку в магнит снова, чтобы избежать возможности оставшиеся клетки CD4 или шарики от населения.
- Вымойте CD4 - клеток в 5 мл MACS-буфера (центрифуги в течение 12 мин, при 300 XG) ай ресуспендируют их в концентрации 1 × 10 5 клеток на 100 мкл среды. CD4 - клетки могут быть легко культивируется при условиях, указанных ниже (4,2).
- Поместите пробирку с целями клеток CD4 + за пределами магнитного поля, ресуспендирования клеток в 500 мкл буфера MACS-и положил их обратно в магнитном устройстве. Повторите шаги 3.3-3.5 раза, чтобы получить более высокую чистоту. Удалить супернатант с помощью пипетки
- Ресуспендируют клеток CD4 + в 100 мкл культуральной среды (RPMI 1640, 10% FCS, 1% L-глутамина, 1% пенициллина / стрептомицина) и добавить 10 мкл шарик-отсоединения раствора. Выдержите при комнатной температуре в течение 45 мин при постоянном наклоне (например, в ротатор).
- Поместите клетки в магните в течение 1 мин. Осторожно собрать супернатант, содержащий шарик без Vδ1 + CD4 + клеток с помощью мелкого пипетки.
- Вне магнита, ресуспендируйте бусы с 100 мкл культуральной среды и повторениешаги 3.6 и 3.7 раза, чтобы получить более высокие количества клеток CD4 + клеток.
- Гранулирование клетки (центрифуге при 300 мкг, в течение 12 мин) и отбросить супернатант полностью с помощью пипетки. Ресуспендируют клеток в свежей, подогретого СМИ и считать их. Изучение чистоту Vδ1 + CD4 + клеток с помощью анализа FACS, изображенных на шагах 2.1.1-2.1.3.
4. Одноклеточный Клонирование по ограниченной разведение
- Изолировать мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) из аллогенной донора, как показано на 1,1-1,6.
- Облучают 2,5 × 10 7 аллогенных МНПК 80 Гр в 25 мл культуральной среды с помощью гамма-излучения.
- Добавить IL-2 (200 ед / мл), IL-7 (20 нг / мл) и РНА (2 мкг / мл) в облученных питающих клеток и распределить их в 96-луночный U-формы пластин, 5 х 10 4 подачи клетки в 50 мкл на лунку.
- Развести клетки Vδ1 + CD4 + в концентрации 0,3 клеток на 50 мкл. Пипеткате 50 мкл клеточной раствора в каждую лунку укрывает облученные клетки и цитокины.
Примечание: Таким образом, цитокины разбавляли до конечной концентрации 100 ед / мл IL-2, 10 нг / мл IL-7 и 1 мкг / мл РНА. Инкубируйте 96-луночных планшетах в термостате при 37 ° С, 5% СО 2 влажной атмосфере.- При желании, развивать остальные очищают Vδ1 + CD4 + клеток, как объемной культуры в тех же условиях культивирования, как клоны.
- Поставка клетки каждые 3-4 дня с цитокинами и свежих средств массовой информации. Для этого, обмен половина среды в лунках с 50 мкл свежей среды с помощью пипетки. Добавить 2-кратной концентрации цитокинов в каждом добавок. Добавить 5X10 4 облученные фидерные клетки на лунку и любой другой раунд кормления.
- Использование микроскопа, наблюдать первые клоны становятся видимыми через 3-4 недель, так как они усваивают и, таким образом, изменить цвет культуральной среды и образовывать колонии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мехаь еще выращивание, ресуспендируйте клонов также и передавать их на отдельные 96-луночных планшетах. Анализ клеток с помощью FACS, как указано в 2.1.1-2.1.3. Клоны содержали в таких условиях может в конечном итоге изменить их TCR от Vδ1 в αβTCR. Момент времени для этой трансдифференцировки варьируется от клона клонирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана различные этапы и исход изоляции Vδ1 Т-клеток из периферической крови. 1А показывает типичное распределение Vδ1 + клеток в CD3 + лимфоцитов, а также ко-рецептор выражение населения Vδ1 +. В этом донора, частота Vδ1 + клеток (красный) 2,3% от общего числа лимфоцитов и экспрессии CD4 (зеленый) из Vδ1 + лимфоцитов 2,6%. В общей сложности, целевой группой для изоляции представляет 0,06% от общего числа лимфоцитов в этой донора. 1В показывает оптимальную интенсивность окрашивания для Vδ1 + клеток, прежде чем приступить к магнитному маркировки. Окрашивание первичного антитела должны приводить к четко различающихся Vδ1 отрицательных и положительных Vδ1 популяций так, чтобы + клеток Vδ1 эффективно могут быть помечены и разделены на магн сEtic шарики. Рисунок 1С изображает Vδ1 + клеток после процедуры изоляции путем анализа FACS. Чистота Vδ1 +, как правило,> 99% CD3 + клеток. Для повышения чистоты, изолированные клетки наносят на вторую колонну изоляции. Это приводит к значительной потере клеток, однако это приводит к шаги количественного ликвидации потенциально загрязняющих клеток CD4 + TCRαβ +.
Результаты CD4 + изоляции приведены на рисунке 2. Из-за низкой численности CD4 + Vδ1 + клеток, а так как клетки расширяются в ограниченное разведения одной ячейки клонирование чистоту подход CD4 + клеток менее 100% может допускаться. В эксперименте, показанном здесь, чистоты + клеток CD4 + Vδ1 было около 90% (Фигура 2А, правильно блот) и последующее клонирование отдельных клеток в результате более 60 Vδ1+ CD4 + Т-клеточные клоны. Наоборот, в Vδ1 + CD4 - фракции не CD4 + клетки оставались (рис 2б), в котором подчеркивается эффективность этой стратегии изоляции. Следует отметить, что клетки CD4 + (синие) выражают Vδ1 на различимого низком уровне, чем CD4 - клетки (красный) (фиг.2А, оба блоты). Таким образом, окрашивание Vδ1 + клеток должно быть чрезмерным, как описано в протоколе-в течение достаточного маркировки и успешного выделения фракции CD4 + в клетке пула Vδ1 + T.
На рисунке 3А, типичный фенотип формирующейся клона представлена. ТКР состоит из Vδ1 и цепи Vγ9 и клональных клеток экспрессируют CD3 и CD4. 3В изображен процесс трансдифференцировкой одного клона изолированы представленной техники. Трансдифференцировки включает downregulatiна о V'1 цепи на низком уровне экспрессии, который параллельно с De Novo экспрессии αβTCR. Это приводит к кратковременному ТКР дважды положительного фенотипа которые в конечном итоге приводит к образованию одного положительных αβTCR экспрессирующих Т-клеток. Выражение корецептор может также изменить в ходе трансдифференцировки. Подобно тимоцитов, фенотип CD4 + CD8 + DP может произойти, который в конечном счете превращается либо SP CD4 + или CD8 + Т-клеток αβ. В условиях культуры, представленные здесь, трансдифференцировка является редким событием только один из 50 клонов изменили свое Vδ1 + TCR в αβTCR.
Рисунок 1. FACS анализ мониторинг всех этапов процесса изоляции V б1 Т-клеток из периферической крови. (А </ STRONG>) Распределение Vδ1 + клеток (красный) в CD3 + клеток лимфоцитов периферической крови и выражения их корецептора. CD4 + клетки Vδ1 + указаны в синем (круг). (В) Окрашивание фракции Vδ1 прежде чем перейти к магнитной маркировки. (С) FACS-анализ Vδ1 + клетки положительной фракции после выделения. Цифры показывают, процент закрытых ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. FACS анализы V б 1 CD4 + изолирует (A) CD4 + фракции и (б) - CD4. Фракциюпосле выделения клеток CD4 +. Цифры показывают, процент закрытых ячеек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Фенотипическая анализ клона сразу после обнаружения. (А) ТКС состав и корецептором выражение свежевыделенными клона. Vδ1 и Vγ9 ТКР совместно выражены с CD3 и CD4. (Б) Процесс трансдифференцировки в клоне CD4 + Vδ1 +. Изменение TCR выражения (вверху), и изменения корецептора выражения (нижней) 18. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для изучения фенотипа, биологию и функцию мало (Т) клеток лица, а именно Vδ1 + CD4 + T-клетки, мы использовали два маркера: Vδ1 и CD4 для его положительного изоляции магнитного элемента. Vδ1 сирота рецепторов, в то время как CD4 экспрессируется на Т-клеток-хелперов, на более низком уровне на моноцитах и дендритных клеток, и на очень низком уровне по гемопоэтических клеток-предшественников.
Методы обогащения и отбора клеток в высокой чистоты, включают флуоресценции активирован сортировки клеток (FACS), метод, который отделяет популяцию клеток в подгруппах, основанные на флуоресцентной маркировки. Клетки окрашивали с использованием конъюгированного с флуорофором антитела могут быть отделены друг от друга в зависимости от того, какой флуорофора (ы) они связаны. Сортировщики может достичь чистоты, близкий к 98% 19, что полезно, если только необходимость в самой сортировки. Недостатки этого метода включают, что сортированные клетки показывают уменьшение клеточной VIВозможность, а в нашей целевой популяции также снижается вероятность transdifferention. Уменьшенный жизнеспособность клеток после сортировки Предполагается, что за счет усилий сдвига и гидродинамического стресса, что накладывает на FACS клеток. Кроме того, чтобы сохранить клетки жизнеспособны и без загрязнения для последующего культуры, эксперимент должен проводиться в асептических условиях, стерильных трудно управлять. Кроме того, сортировка FACS рекомендует большое число клеток для сортировки.
Изоляционные комплекты были разработаны из нескольких компаний для прямого магнитного маркировки и сортировки клеток по нескольким маркерам на поверхности. Их стратегия основана на удалении магнитного этикетке из клеток после первого рода с помощью фиксатора реагент, который либо ферментативно или конкурентно удаляет магнитного этикетку от структуры, к которой он был связан. Это позволяет второй магнитный маркировку и разделение клеток для другого поверхностным маркером процентной тхат достигается с помощью прямых или косвенных маркировку с магнитных шариков. Удаление этикетки рекомендует работать при низких температурах (на льду, при температуре 2-8 ° С) в течение длительных периодов времени, воздействие химических веществ и повторные стадии промывки. Если клетки-мишени второго разделения параметров присутствуют в низкой концентрации после выбора (<10% клеток-мишеней в положительном фракции после первой разделения), даже второй раунд для удаления остаточных ofany магнитно меченых клеток необходим. Эта процедура-помимо того, значительные потери клеток-мишеней в связи с неоднократными стиральных шагов-при высоком риске для индукции клеточного повреждения и потери функции из-за механических и физиологических факторов стресса. По сравнению с FACS сортировки, однако клеточные препараты остаются стерильными и меньшие количества клеток могут быть отсортированы.
Стратегия, которую мы преследуем две последовательно объединяет выполненные положительные выборы, но удаление первого этикетке не требуется, так как мagnetic этикетки отличаются по величине их магнитных сил на несколько фаз журнала. В то время как первый анти-флуорохромом магнитно-меченных шарик типа мал, с диаметром 50 нм, второй анти-флуорохромом магнитно-меченных меры шарик типа 1 к 4,5 мкм, что превышает объем / прочность первого магнитного этикетке 20 до 90-кратный. Кроме того, второй положительный рода опускает клеточный стресс, который связан с магнитным колонке удерживания / выпуска, как клетки остаются в 1,5 мл флаконе, который ставится в магнитном устройстве таким образом, чтобы меченые клетки прикрепляются к стенке флакона. Стиральные процедуры могут быть в небольших масштабах. Это разработаны протокол уменьшает потерю клеток и увеличивает жизнеспособность клеток, так как клетки испытывают меньше манипуляций и пройти процесс изоляции быстрее, чем протоколов, использующих системы изоляции Multisort комплект.
Следовательно, этот протокол позволяет отделить даже небольшое количество клеток и еще одно преимущество: отсортированные клетки остаются Steраздражать в течение всей процедуры. Последующие эксперименты по клонированию, используя предельного разбавления позволяет эффективно расширение отдельных членов изолированных клеток, здесь очень мало Vδ1 + CD4 + Т γδ лицо клеток 18. Сортировка клетки показывают отличную жизнеспособность и clonogenicity и остаются полностью функциональны.
Для будущих приложений, использовать эту стратегию, чтобы количественно выбрать и успешно очистить субъектов малого Т-клеточные из различных антропогенных источников, включая свежеотобранным периферической крови (мобилизованные) Лейкаферез продукты, пуповинной крови и костного мозга путем объединения двух последовательно выполняемых положительные выборы с использованием магнитных меток, которые отличаются по величине в их магнитных сил и, таким образом, сохранения емкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
