Abstract
الغدة الصعترية، الجهاز الرئيسي لتوليد αβ T الخلايا والعمود الفقري للنظام المناعي التكيفي في الفقاريات، منذ فترة طويلة تعتبر المصدر الوحيد للخلايا αβT. ومع ذلك، وارتداد الغدة الصعترية يبدأ في وقت مبكر في الحياة مما يؤدي إلى انخفاض شديد في انتاج الخلايا αβT ساذجة في الهامش. ومع ذلك، يمكن حتى المعمرين بناء مناعة ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. تشير الأبحاث الحديثة إلى تطوير خلية αβT extrathymic، لكن فهمنا للمسارات التي يمكن أن تعوض عن فقدان الغدة الصعترية وظيفة لا تزال اولى. خلايا T γδ هي الخلايا الليمفاوية الفطرية التي تشكل فرعية T-الخلية الرئيسية في الأنسجة. نحن المسند في الآونة الأخيرة وظيفة العالقة حتى تأخذ حقها من الآن إلى γδ الخلايا التائية فرعية من خلال إظهار أن الكيان نادرة من CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في حالات الالتهابات. هنا، نحن صrovide بروتوكول لعزل هذه السلف من الدم المحيطي وزراعته لاحقة. يتم إثراء خلايا Vδ1 إيجابيا من PBMCs من المانحين البشرية السليمة باستخدام حبات مغناطيسية، تليها الخطوة الثانية التي نحن فيها استهداف جزء نادرة من CD4 + الخلايا مع مزيد من تقنية وضع العلامات المغناطيسية. القوة المغناطيسية لوضع العلامات الثاني تجاوز واحدة من التسمية المغناطيسية الأولى، وبالتالي تسمح للعزلة إيجابية فعالة، والكمية المحددة للسكان الفائدة. نحن ثم إدخال هذه التقنية والثقافة الشرط المطلوب لاستنساخ وكفاءة توسيع الخلايا والتعرف على الحيوانات المستنسخة الناتجة عن تحليل FACS. وهكذا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة لتنقية والثقافة وفيفو السابقين توسيع CD4 + Vδ1 + γδ خلايا T. هذه المعرفة هي شرط أساسي للدراسات التي تتصل هذا αβT progenitor`s خلية البيولوجيا وبالنسبة لأولئك الذين يهدفون إلى بيئة تطوير متكاملةntify مشغلات الجزيئية التي تشارك في transdifferentiation لها.
Introduction
في الفقاريات، والحصانة التكيفية التي يتمحور في الخلوية وجزء الخلطية الحصانة تلعب دورا رئيسيا في الدفاع ضد مسببات الأمراض. وتوسط الاعتراف مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي كتبها T- hyperpolymorphic وB مستقبلات الخلايا (TCR / BCR)، الذي فيما يتعلق خلايا T يفترض أن تنتج بشكل رئيسي في الغدة الصعترية 1. بذلك، الجذعية الخلايا المكونة للدم (HSCs)، المشتقة من نخاع العظام، والبذور الغدة الصعترية والتفريق على مراحل محددة جيدا يعطي في النهاية إلى ظهور كل الأنساب الخلايا التائية. الغدة الصعترية الأسلاف بذر هي CD4 - وCD8 - وبالتالي تشكل غير ناضجة، النفي المزدوج (DN) خلية توتية الكسر. إشارات التوتة المشتقة ثم حمل التزام نسبهم والتمايز إلى أي خلايا T αβ أو γδ. التعبير عن ترتيبها وظيفيا TCR-γ وTCR-δ الجينات سلسلة في DN2 / 3 thymocytes يؤدي إلى جاما δTCR المجمعات، التي تدفع الخلوي تكاثرد تعزيز التمايز إلى خلايا γ δT 2،3. في المقابل، فإن إعادة ترتيب وظيفية سلسلة TCR-β، التي يمكن أن الزوج مع preTα لبناء preTCR حزب العمال، الحث على إسكات النسخي من سلسلة TCR-γ في thymocytes DN3 وانتقالها إلى CD4 + CD8 + نقرا مزدوجا إيجابية thymocytes 4 . في هذه المرحلة، إعادة التركيب من سلسلة TCR-α يحدث، وحذف موضع TCR-δ التي يعشعش داخل مكان TCR-α، وبالتالي إلغاء إنتاج وγδTCR في هذه الخلايا لا رجعة فيه 5-9. ويتم اختيار αβTCRs ترتيبها بعد ذلك لقدرتها على ربط MHC الذاتي ضعيف (اختيار الإيجابية)، والتي قد لا تتجاوز عتبة معينة لتجنب المناعة الذاتية (اختيار السلبية). وفقا لقدرتها على الطبقة MHC ملزم الأول أو الثاني، فإن الخلايا αβT المختارة تتطور إلى واحدة إيجابية CD4 + أو CD8 + T الخلايا، والتي الخروج الغدة الصعترية خلايا T ساذجة كما.
ومع ذلك، ارتداد من الغدة الصعترية يبدأ في الحياة مما أدى إلى انخفاض أضعافا مضاعفة الناتج من الخلايا T السذاجة أن يسقط تقريبا بعد سن المراهقة 10 في وقت مبكر. ومع ذلك، يظل حجم تجمع الخلايا T المستمر طوال الحياة، والتي يمكن تفسيرها إلا في جزء من انتشار التماثل الساكن بعد التوتة الخلايا T وانتشار ذاكرة مناعية طويلة العمر 11. ونتيجة لذلك، يجب أن يحدث نمو الخلايا T extrathymic. وقد اكتسب البحوث التي أجريت مؤخرا الجذب الكبير الذي تتميز الأسلاف خلية αβT، التي، في extrathymic مواقع أدت إلى αβ وظيفية الخلايا التائية 12-17. ومع ذلك، ومعرفة تفصيلية حول extrathymic السلائف الخلية αβT التي مستقلة من الغدة الصعترية التمايز إلى خلايا αβT مجزأة مثل الخلفية التي لدينا على الطريق أنها تأخذ بذلك.
حددنا مؤخرا الكيان T-خلية صغيرة من Vδ1 + + γδT باعتبارها extrathymic αβT خلية prognitor 18، والتي عندما عزل من الدم المحيطي من المانحين البشرية السليمة يمكن أن تحورها إلى خلايا αβT في بيئة التهابات خفيفة. ومن المثير للاهتمام، وخلافا لانتشار استتبابي من الخلايا T بعد الغدة الصعترية، transdifferentiation من Vδ1 CD4 + الخلايا يولد مستقبلات الخلايا التائية جديدة، وبالتالي توسيع التنوع ذخيرة، بحيث مستضدات جديدة محتملة يمكن الاعتراف بها ويجوز حماية المضيف ضد مسببات الأمراض المكتسبة حديثا. وهذا يضيف إلى ليونة من الخلايا T ويضيف مسارا جديدا لذلك محل تقدير بعيدا عن تطوير الخلايا T extrathymic.
العزلة الكمية من مصادر مفاوي، جيل من الحيوانات المستنسخة وحيدة الخلية وتوسعها كفاءة ضرورية لتحقيق الهدف لتحديد تلك العلامات والجزيئات التي تؤدي هذه الخلية αβT precursor`s تطوير extrathymic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان أخلاقيات: تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي وتمت الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات الطبية في جامعة توبنغن (المشاريع 38 / 2009B02 و 470 / 2013B02).
1. عزل خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)
- خذ 50-100 مل من المتطوعين الأصحاء عن طريق بزل الوريد باستخدام حقنة 50 مل تحتوي على 1000 وحدة دولية الهيبارين كبريتات وتمييع الدم 1: 2 مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.2).
- طبقة بعناية 35 مل من الدم: حل PBS على حل فصل 15 ملليتر دم مثل Biocoll (د = 1.077 جم / مل) في 50 مل المخروطية أنبوب. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 800 x ج في RT.
ملاحظة: الفرامل يجب ألا تستخدم. - جمع الخلايا من طبقة الليمفاوي مع ماصة وغسل الخلايا مرتين في لا يقل عن 50 مل PBS (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 400 x ج). إزالة طاف بعد الطرد المركزي مع ماصة.
- ليز المتبقية خلايا الدم الحمراء من خلال تعليق وincubأثناء التشغيل جزء الليمفاوي مع 1-5 مل من محلول العازلة منخفض التوتر لمدة 2-4 دقيقة.
ملاحظة: مدة التعرض وحجم الناشر عازلة تعتمد على المخزن المؤقت الناشر المستخدمة وعلى كمية من خلايا الدم الحمراء اليسار في جزء اللمفاويات. - تمييع الخلايا مع PBS (01:10) وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 12 دقيقة وبعد ذلك و resuspend ويغسل بيليه الخلايا مرة واحدة في 10 مل PBS في 300 x ج لمدة 12 دقيقة.
- Resuspend والخلايا الليمفاوية في برنامج تلفزيوني وعدد الخلايا في غرفة الفرز نويباور باستخدام التريبان حل الأزرق.
ملاحظة: عادة، يتم استلام> 1 × 10 8 الخلايا الليمفاوية من 100 مل ضعت حديثا الدم المحيطي.
2. عزل خلايا T Vδ1
- خذ <1 × 10 6 الخلايا الليمفاوية المعزولة لFACS الأولية تحديد وتيرة خلايا CD4 T Vδ1.
ملاحظة: حجم سكان هذا الكيان T-الخلية قد تختلف اختلافا كبيرا بين الأفراد وفقا لحالتهم المناعية. Typicحليف، وحوالي 1٪ من خلايا T هي Vδ1 + وحوالي 1-5٪ من Vδ1 + CD4 + الخلايا هي.- تمييع الخلايا مع 1 مل FACS العازلة، والذي يتألف من برنامج تلفزيوني يحتوي على 2٪ FCS و 5 ملي EDTA. أجهزة الطرد المركزي في 660 x ج لمدة 2 دقيقة وصب طاف. حجم الجزر حوالي 100 ميكرولتر FACS العازلة كافية لتلطيخ لاحقة. دوامة لفترة وجيزة واحتضان الخلايا مع 5 ميكرولتر FC-حجب الكاشف لمدة 5 دقائق على RT لزيادة خصوصية تلطيخ FACS.
- إضافة الاجسام المضادة الإنسان مباشرة إلى الخلايا دون إزالة كاشف الحظر لكرة القدم. تأكد من وصمة عار على الخلايا مع أجسام مضادة ضد Vδ1 (01:50)، CD3 (01:50)، CD4 (1: 200)، CD8 (1: 200) وTCRαβ (01:25). إعداد isotype السيطرة مع isotypes المناعي المقابلة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا في 1 مل FACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة، في 660 x ج)، صب supernatant، والشروع في اكتساب FACS في حجم العازلة المتبقية.
- بلتيز الخلايا (التي لا يتم استخدامها في تحليل FACS) بواسطة الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 غرام؛ 8 ° C. إزالة طاف و resuspend الخلية pelletin 60 ميكرولتر MACS العازلة لكل 1 × 10 7 الخلايا. إضافة 20 ميكرولتر حجب التيسير الكاشف لكل 1 × 10 7 الخلايا واحتضان لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- إضافة 10 ميكرولتر FITC مترافق الأجسام المضادة Vδ1 مكافحة الإنسان في 1 × 10 7 الخلايا مباشرة إلى الخلايا. احتضان لمدة 12 دقيقة على 4 درجات مئوية في الظلام.
- غسل الخلايا باستخدام 14 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 غرام؛ 8 ° C). تجاهل طاف تماما وresuspend الخلايا في 80 ميكرولتر MACS العازلة في 1X10 7 الخلايا.
- يستغرق 1-2 × 10 5 خلايا وتمييع لهم في 100 ميكرولتر FACS العازلة للتحقق من وضع العلامات من خلال تحليل FACS. وهناك حاجة إلى أي إضافات أخرى لهذه الخطوة. تأكد أن هناك suffiالفرق cient في سطوع لVδ1 - والخلايا Vδ1 +. إذا لم تكن هذه هي الحالة، كرر الخطوات من 2.3) و 2.4).
- إضافة 20 ميكرولتر بلي لمكافحة FITC في 1 × 10 7 الخلايا إلى الخلايا المتبقية، وتخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الظلام في 4 درجات مئوية. بعد ذلك، وغسل الخلايا باستخدام 10 مل على الأقل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج، 8 ° C).
- أثناء الطرد المركزي، تتوازن العمود المغناطيسي تبرد قبل وضعها في مغنطيس مع MACS 500 ميكرولتر العازلة.
- resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة (للأرقام الخلية أعلى من 1 × 10 8، توسيع نطاق هذا الكتاب وفقا لذلك) وتطبيق خلايا بعناية على العمود. جمع من خلال تدفق تحتوي على Vδ1 - الخلايا.
- غسل العمود ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر MACS العازلة وجمع من خلال تدفق مرة أخرى في نفس الأنبوب. لاحظ أن الخزان يجب أن تكون فارغة قبل تطبيق عازلة على العمود.
- إزالة العمود من الجهاز المغناطيسي ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل. تدفق بسرعة العمود مع 1 مل MACS العازلة عن طريق دفع بقوة المكبس في العمود. جمع شطافة في أنبوب.
ملاحظة: من أجل الحصول على نقاء> 98٪، فإنه عادة ما يكون من الضروري تكرار الخطوات 2،7-2،9) مع العمود الثاني. - التحقق من نقاء الخلايا عن طريق تحليل FACS 18 مع نفس الفريق الضد كما كان من قبل (انظر 2.1.2) وعدد الخلايا.
3. عزل Vδ1CD4 + T الخلايا
- و resuspend 25 ميكرولتر من الخرز CD4 مع دوامة ل> 30 ثانية. تغسل حبات (الحد الأدنى كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة) في 1 مل MACS العازلة في أنبوب 1.5 مل رد فعل عن طريق وضع أنبوب إلى المغناطيس لمدة 1 دقيقة. تجاهل طاف بعناية مع ماصة صغيرة الحجم (200 ميكرولتر) و resuspend الخرز في حجم الأصلي للMACS العازلة.
- بلتيز Vδ1 خلايا + (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة. في 300 x ج) ونضح طاف و resuspend كل Vδ1 + الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة وإضافتها إلى أنبوب يحتوي على حبات. مزيج بقوة واحتضان لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة).
- ضع الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا في مغناطيس لمدة 2 دقيقة. تأكد من عدم وجود أي بقايا في الغطاء.
ملاحظة: خلايا CD4 + وربطت حبات مغناطيسية ونعلق على جانب الأنبوب تواجه المغناطيس. - فتح بعناية الغطاء مع الحفاظ على أنبوب داخل الجهاز المغناطيسي وجمع طاف التي تحتوي على CD4 - Vδ1 + الخلايا باستخدام ماصة على نطاق صغير. وضع CD4 - Vδ1 + خلايا في أنبوب منفصل ووضع هذا الأنبوب إلى المغناطيس مرة أخرى لتجنب ربما تبقى خلايا CD4 أو حبات من السكان.
- غسل CD4 - الخلايا في 5 مل MACS العازلة (الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة، في 300 x ج) لالثانية و resuspend لهم في تركيز 1 × 10 5 خلايا لكل 100 ميكرولتر وسائل الإعلام. CD4 - خلايا يمكن زراعتها بسهولة تحت ظروف معينة أقل من (4.2).
- وضع أنبوب مع أهداف خلية CD4 + خارج الحقل المغناطيسي للأرض، resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر MACS العازلة ووضعها مرة أخرى في الجهاز المغناطيسي. كرر الخطوات من 3،3-3،5 مرتين للحصول على نقاء أعلى. إزالة طاف قبل pipetting
- Resuspend وCD4 + الخلايا في 100 ميكرولتر سائل الإعلام والثقافة (RPMI 1640، 10٪ FCS، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البنسلين / الستربتوميسين) وإضافة 10 ميكرولتر من حل فصل حبة. في احتضان RT لمدة 45 دقيقة مع إمالة ثابتة (على سبيل المثال، في المدورة).
- وضع الخلايا في المغناطيس لمدة 1 دقيقة. جمع بعناية طاف تحتوي على Vδ1 + CD4 + الخلايا الحرة حبة باستخدام ماصة على نطاق صغير.
- خارج المغناطيس، resuspend والخرز مع وسائل الإعلام الثقافة 100 ميكرولتر وتكرارخطوات 3.6 و 3.7 ضعف للحصول على أرقام الخلية أعلى من خلايا CD4 +.
- بلتيز الخلايا (أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 12 دقيقة) وتجاهل طاف تماما من قبل pipetting. الخلايا resuspend في والإعلام قبل حرارة الطازجة والاعتماد عليها. فحص نقاء Vδ1 + CD4 + الخلايا عن طريق تحليل FACS يصور في الخطوات 2.1.1-2.1.3.
استنساخ 4. وحيدة الخلية التي كتبها المحدودة التخفيف
- عزل الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs) من متبرع خيفي كما هو مبين في 1،1-1،6.
- أشرق 2.5 × 10 7 PBMCs خيفي مع 80 غراي في 25 مل سائل الإعلام والثقافة باستخدام جاما للإشعاع.
- إضافة IL-2 (200 U / مل)، IL-7 (20 نانوغرام / مل)، وجمعية المستشفيات الخاصة (2 ميكروغرام / مل) إلى الخلايا المغذية المشع وتوزيعها في لوحات 96-جيدا U-النموذج، 5 × 10 4 التغذية الخلايا في 50 ميكرولتر لكل بئر.
- تمييع الخلايا Vδ1 + CD4 + إلى تركيز 0.3 خلايا في 50 ميكرولتر. الماصةالشركة المصرية للاتصالات 50 ميكرولتر من محلول الخلية إلى كل بئر بإيواء الخلايا المعرضة للإشعاع والسيتوكينات.
ملاحظة: وهكذا، وتضعف السيتوكينات إلى تركيز النهائي من 100 U / مل IL-2، 10 نانوغرام / مل IL-7 و 1 ميكروغرام / مل PHA. احتضان لوحات 96-جيدا في حاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 مرطب الجو.- اختياريا، زراعة المتبقية تنقية Vδ1 + CD4 + الخلايا كثقافة الأكبر في ظل نفس الظروف الثقافة باعتبارها الحيوانات المستنسخة.
- تزويد خلايا كل 3-4 أيام مع السيتوكينات وسائل الإعلام الجديدة. لهذا، صرف نصف المتوسط في الآبار مع 50 متوسطة جديدة ميكرولتر من قبل pipetting. إضافة تركيز 2 أضعاف السيتوكينات إلى كل مكملات. إضافة 5X10 4 الخلايا المغذية المشع لكل بئر في كل جولة أخرى من التغذية.
- باستخدام المجهر، ومراقبة الحيوانات المستنسخة الأولى تصبح مرئية بعد 3-4 أسابيع، لأنها استقلاب، وبالتالي تغيير لون المستعمرات مستنبت والشكل.
ملاحظة: للحصول على الفراءزراعة ذر، resuspend واستنساخ جيدا ونقلها إلى فصل لوحات 96-جيدا. تحليل الخلايا عن طريق FACS كما هو مبين في 2.1.1-2.1.3. استنساخ أبقى في ظل هذه الظروف قد تتغير في نهاية المطاف TCR بهم من Vδ1 إلى αβTCR. النقطة الوقت لهذا transdifferentiation تختلف من استنساخ استنساخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الشكل 1 يصور المراحل المختلفة ونتائج عزل الخلايا Vδ1 T من الدم المحيطي. ويبين الشكل 1A توزيع نموذجي من Vδ1 + الخلايا في CD3 + الخلايا الليمفاوية، فضلا عن التعبير شارك في مستقبلات السكان Vδ1 +. في هذا المانحة، وتواتر Vδ1 خلايا + (الأحمر) هو 2.3٪ من إجمالي تعداد اللمفاويات والتعبير CD4 (الأخضر) من Vδ1 + الخلايا الليمفاوية هو 2.6٪. وإجمالا، فإن السكان المستهدفين لعزل يمثل 0.06٪ من إجمالي الخلايا الليمفاوية في هذا المانحة. ويبين الشكل 1B كثافة تلطيخ الأمثل لVδ1 + الخلايا قبل الشروع في وضع العلامات المغناطيسي. يجب تلطيخ مع الأجسام المضادة الأولية يؤدي إلى Vδ1 السكان إيجابي سلبي وVδ1 متميزة بوضوح بحيث Vδ1 + الخلايا يمكن أن يكون المسمى بكفاءة وفصل مع magnحبات ETIC. الشكل 1C يصور الخلايا Vδ1 + بعد إجراء العزل عن طريق تحليل FACS. نقاء Vδ1 + عادة> 99٪ من CD3 + الخلايا. لزيادة نقاء، يتم تطبيق خلايا معزولة على عمود العزلة الثاني. هذه النتائج في فقدان الخلية كبيرة ولكن هذه الخطوات يؤدي إلى القضاء الكمي من المحتمل تلويث TCRαβ + CD4 + الخلايا.
وأظهرت نتائج CD4 + العزلة في الشكل 2. نظرا لانخفاض عدد CD4 + Vδ1 خلايا +، ومنذ يتم توسيع الخلايا في خلية واحدة، تخفيف محدود استنساخ النهج نقاء CD4 + الخلايا يمكن أقل من 100٪ السكوت عليها. في التجربة هو موضح هنا، نقاء Vδ1 + CD4 + الخلايا وأسفرت عن 90٪ (الشكل 2A، وصمة عار على اليمين) واللاحقة استنساخ خلية واحدة في أكثر من 60 Vδ1+ CD4 + T استنساخ الخلية. على العكس، في Vδ1 + CD4 - جزء لا CD4 + الخلايا بقي (الشكل 2B)، الذي يسلط الضوء على كفاءة هذه الاستراتيجية العزلة. من المذكرة، وCD4 + الخلايا (الأزرق) تعبر عن Vδ1 على مستوى أدنى تمييز من CD4 - خلايا (أحمر) (الشكل 2A، سواء البقع). وبالتالي، يجب أن يكون تلطيخ Vδ1 + الخلايا المفرط كما هو موضح في بروتوكول لوضع العلامات كافية والعزلة الناجحة للCD4 + جزء داخل تجمع الخلايا Vδ1 + T.
في الشكل 3A، يتم تقديم النمط الظاهري نموذجي لاستنساخ الناشئة. يتكون TCR من Vδ1 وسلسلة Vγ9 والخلايا نسيلي تعبير عن CD3 CD4 و. يصور الشكل 3B عملية transdifferentiation واحد استنساخ معزولة مع تقنية المقدمة. ويشمل Transdifferentiation وdownregulatiعلى من V'1 سلسلة إلى مستوى التعبير المنخفض، الذي يقابل من جانب التعبير دي نوفو من αβTCR. وهذا يؤدي إلى النمط الظاهري TCR-انقر نقرا مزدوجا إيجابي عابرة الذي يعطي في نهاية المطاف إلى ظهور خلايا وحيدة إيجابية αβTCR، معربا عن T. قد يتغير التعبير شارك في مستقبلات أيضا أثناء transdifferentiation. على غرار thymocytes، قد يحدث النمط الظاهري CD4 + CD8 + DP، الذي يتطور في نهاية المطاف إما إلى SP CD4 + الخلايا CD8 + أو αβ T. في ظل الظروف ثقافة المعروضة هنا، transdifferentiation هو نادر حدث واحد فقط من أصل 50 استنساخ تغير من Vδ1 + TCR إلى αβTCR.
الشكل 1. FACS تحليلات رصد جميع مراحل عملية عزل V δ1 T الخلايا من الدم المحيطي. (A </ قوي>) توزيع Vδ1 خلايا + (الحمراء) في CD3 + الخلايا من الخلايا الليمفاوية الدم المحيطي والتعبير عنها شارك في مستقبلات. يشار إلى خلايا CD4 + Vδ1 + في الزرقاء (الدائرة). (B) تلطيخ الكسر Vδ1 قبل الشروع في وضع العلامات المغناطيسي. (C) FACS تحليل Vδ1 + خلايا جزء إيجابية بعد العزلة. الأرقام تشير إلى نسبة الخلايا المغلقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يحلل الشكل 2. FACS من V δ 1 CD4 + يعزل (A) CD4 + جزء و (B) CD4 - جزءبعد عزل خلايا CD4 +. الأرقام تشير إلى نسبة الخلايا المغلقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. تحليل المظهري من استنساخ الحق بعد الكشف. (A) تكوين TCR وشارك في مستقبلات التعبير عن استنساخ المعزولة حديثا. وشارك اعرب Vδ1 وVγ9 TCR مع CD3 CD4 و. (B) عملية transdifferentiation في استنساخ CD4 + Vδ1 +. تغيير TCR التعبير (أعلى)، وتغير التعبير شارك في مستقبلات (القاع) 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لدراسة النمط الظاهري والبيولوجيا وظيفة من ندرة (T-) كيان الخلية، وهي خلايا CD4 + Vδ1 + T، استخدمنا اثنين علامات: Vδ1 وCD4 لعزل الخلايا المغناطيسية الإيجابية. Vδ1 هو مستقبل الأيتام، في حين يتم التعبير عن CD4 على الخلايا التائية المساعدة، على مستوى أدنى في وحيدات الخلايا الجذعية، وعلى مستوى منخفض جدا على الخلايا المكونة للدم السلف.
وتشمل التقنيات لإثراء واختيار من الخلايا في نقاء عالية مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS)، وهي تقنية يفصل السكان من الخلايا في مجموعات من السكان على أساس وضع العلامات الفلورية. الخلايا الملون باستخدام الأجسام المضادة fluorophore مترافق يمكن فصلها عن بعضها البعض اعتمادا على fluorophore (ق) أنها ملزمة. يمكن فارزات تحقيق نقاء قريبة من 98٪ 19، وهو أمر مفيد إذا كان ضرورة الوحيد هو فرز نفسه. وتشمل عيوب هذه التقنية أن الخلايا التي تم فرزها تظهر انخفاضا في السادس الخليةالقدرة، والسكان هدفنا أيضا إمكانية تخفيض لtransdifferention. A بقاء الخلية انخفاض بعد الفرز وافترض أن ذلك يعود إلى قوى القص والضغط الهيدروديناميكية أن FACS تفرض على الخلايا. وعلاوة على ذلك، للحفاظ على خلايا قابلة للحياة وبدون تلوث للثقافة اللاحقة، ينبغي إجراء التجربة في ظروف معقمة خالية من الجراثيم والتي من الصعب السيطرة عليها. بالإضافة إلى ذلك، FACS الفرز يوصي أعداد كبيرة من الخلايا للفرز.
وقد وضعت أطقم بمعزل عن العديد من الشركات لوضع العلامات المغناطيسي المباشر والفرز من الخلايا وفقا لعلامات سطح متعددة. وتعتمد استراتيجيتها على إزالة التسمية المغناطيسية من الخلايا بعد الفرز الأول باستخدام كاشف الإفراج عنهم، التي إما إنزيمي أو تنافسية يزيل التسمية المغناطيسية من الهيكل الذي كان لا بد منه. وهذا يسمح وضع العلامات المغناطيسي الثاني وفصل الخلايا عن علامة السطح آخر من الاهتمام ثاويتحقق ر باستخدام الوسم إما مباشرة أو غير مباشرة مع حبات مغناطيسية. توصي إزالة التسمية التي تعمل في درجات حرارة منخفضة (على الجليد، في 2-8 درجة مئوية) لفترات طويلة من الزمن، والتعرض لمادة كيميائية وخطوات الغسيل المتكرر. إذا كانت الخلايا المستهدفة للفصل المعلمة الثانية موجودة في تركيز منخفض بعد اختيار (<10٪ الخلايا المستهدفة في جزء إيجابية بعد الفصل الأول) حتى جولة ثانية لإزالة ofany الخلايا المسمى مغناطيسيا المتبقية هو مطلوب. هذا الإجراء هو وبالاضافة الى وجود خسارة كبيرة من الخلايا المستهدفة نظرا لتكرار غسل خطوات في خطر كبير لإحداث تلف الخلايا وفقدان وظيفة بسبب الضغوطات الميكانيكية والفسيولوجية. مقارنة مع FACS الفرز ولكن الاستعدادات الخلية تظل عقيمة وأرقام الهواتف المحمولة أصغر يمكن فرزها.
الاستراتيجية التي نسعى يجمع بين اثنين من الاختيارات الإيجابية المنفذة على التوالي، ولكن ليس هناك حاجة لإزالة التسمية الأولى على النحو مالتسميات agnetic تختلف في حجم قواتهم المغناطيسي بعدة مراحل السجل. في حين أن الأول لمكافحة تألقي مغناطيسيا المسمى نوع حبة صغيرة، يبلغ قطرها 50 نانومتر، والثانية لمكافحة تألقي مغناطيسيا المسمى التدابير نوع حبة 1-4،5 ميكرون، وبالتالي تزيد من حجم / قوة من أول تسمية المغناطيسية 20 ل 90 أضعاف. بالإضافة إلى ذلك، هذا النوع الإيجابي الثاني يغفل الإجهاد الخلية، مقترن العمود الإبقاء / الإفراج المغناطيسي حيث تظل الخلايا في 1.5 مل قنينة التي يتم وضعها في جهاز مغناطيسي بحيث يتم إرفاق الخلايا المسمى على جدار القارورة. يمكن أن تظل إجراءات الغسيل على نطاق صغير. وضع هذا البروتوكول يقلل من فقدان الخلايا ويزيد من بقاء الخلية منذ خلايا أقل خبرة التلاعب وتمر عملية عزل أسرع من البروتوكولات باستخدام نظم عدة multisort العزلة.
ونتيجة لذلك، هذا البروتوكول يسمح لفصل حتى عدد قليل من الخلايا وميزة أخرى: تبقى الخلايا مرتبة الظريفيثير غضب في جميع أنحاء الداخلي. تجارب الاستنساخ اللاحقة باستخدام تخفيف الحد تسمح للتوسع الفعال للأفراد من الخلايا المعزولة، من هنا نادرة جدا Vδ1 + CD4 + T γδ كيان الخلية 18. تظهر الخلايا مرتبة قابلية ممتازة وclonogenicity ولا تزال تعمل بكامل طاقتها.
وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية، واستخدام هذه الاستراتيجية لتحديد الكمية وتنقية الكيانات الخلايا T صغيرة من مصادر بشرية متنوعة بما في ذلك رسمها حديثا الدم المحيطي بنجاح، (حشد) منتجات فصادة الكريات البيض، دم الحبل السري ونخاع العظام من خلال الجمع بين اثنين من الاختيارات الإيجابية يؤديها على التوالي باستخدام بطاقات المغناطيسية التي تختلف بحسب حجم قواتهم في المغناطيسية وبالتالي القدرة على الاحتفاظ به.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biocoll Solution | Biochrom | L 6113 | lymphocyte separating solution |
| Lysing Buffer | BD BioSciences | 555899 | lysis of erythrocytes |
| Phosphate-buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | |
| MACS buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | supplement with BSA and pre-cool before use |
| BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human Vd1 FITC (clone: TS8.2) | Thermo Scientific | TCR2730 | not mandatorily from this supplier |
| anti-human CD3 PerCP (clone: SK7) | BD BioSciences | 345766 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human TCRab PE (clone: T10B9.1A-31) | BD BioSciences | 555548 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD4 VioBlue (clone: M-T466) | Miltenyi Biotec | 130-097-333 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| anti-human CD8 APC-H7 (clone: SK1) | BD BioSciences | 641400 | not mandatorily from this supplier or this flurochrome |
| Anti-FITC MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-058-701 | yields better results than anti-FITC MicroBeads |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | pre-cool before use |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| CD4 Positive Isolation Kit | life technologies | 11331D |
References
- Bhandoola, A., von, B. H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26 (6), 678-689 (2007).
- Von, B. H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nat. Immunol. 11 (1), 14-20 (2010).
- Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nat. Immunol. 7 (9), 995-1003 (2006).
- Ferrero, I., et al. TCRgamma silencing during alphabeta T cell development depends upon pre-TCR-induced proliferation. J. Immunol. 177 (9), 6038-6043 (2006).
- Krangel, M. S., Carabana, J., Abbarategui, I., Schlimgen, R., Hawwari, A. Enforcing order within a complex locus: current perspectives on the control of V(D)J recombination at the murine T-cell receptor alpha/delta locus. Immunol. Rev. 200, 224-232 (2004).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Role for rearranged variable gene segments in directing secondary T cell receptor alpha recombination. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (3), 903-907 (2007).
- Hawwari, A., Krangel, M. S. Regulation of TCR delta and alpha repertoires by local and long-distance control of variable gene segment chromatin structure. J. Exp. Med. 202 (4), 467-472 (2005).
- Hawwari, A., Bock, C., Krangel, M. S. Regulation of T cell receptor alpha gene assembly by a complex hierarchy of germline Jalpha promoters. Nat. Immunol. 6 (5), 481-489 (2005).
- Hager, E., Hawwari, A., Matsuda, J. L., Krangel, M. S., Gapin, L. Multiple constraints at the level of TCRalpha rearrangement impact Valpha14i NKT cell development. J. Immunol. 179 (4), 2228-2234 (2007).
- Linton, P. J., Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5 (2), 133-139 (2004).
- Sprent, J., Tough, D. F.
- Guy-Grand, D., et al. Extrathymic T cell lymphopoiesis: ontogeny and contribution to gut intraepithelial lymphocytes in athymic and euthymic mice. J. Exp. Med. 197 (3), 333-341 (2003).
- McClory, S., et al. Evidence for a stepwise program of extrathymic T cell development within the human tonsil. J. Clin. Invest. 122 (4), 1403-1415 (2012).
- Jbakhsh-Jones, S., Jerabek, L., Weissman, I. L., Strober, S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells. J. Immunol. 155 (7), 3338-3344 (1995).
- Garcia-Ojeda, M. E., et al. Stepwise development of committed progenitors in the bone marrow that generate functional T cells in the absence of the thymus. J. Immunol. 175 (7), 4363-4373 (2005).
- Arcangeli, M. L., et al. Extrathymic hemopoietic progenitors committed to T cell differentiation in the adult mouse. J. Immunol. 174 (4), 1980-1988 (2005).
- Maillard, I., et al. Notch-dependent T-lineage commitment occurs at extrathymic sites following bone marrow transplantation. Blood. 107 (9), 3511-3519 (2006).
- Ziegler, H., et al. Human Peripheral CD4(+) Vdelta1(+) gammadeltaT Cells Can Develop into alphabetaT Cells. Front Immunol. 5, 645 (2014).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Computer simulations of the energy dissipation rate in a fluorescence-activated cell sorter: Implications to cells. Biotechnol Bioeng. 100 (2), 260-272 (2008).
