Introduction
من المعروف أن الكروية متعددة الخلايا 3D كنموذج الورم لعدة عقود، إلا أنه في الآونة الأخيرة فقط أنهم جاءوا إلى استخدام أكثر شيوعا نموذجا في المختبر لكثير من السرطانات الصلبة. ويتزايد استخدامها في الإنتاجية العالية شاشات اكتشاف الأدوية كمادة وسيطة بين المجمع ومكلفة والنماذج الحية تستغرق وقتا طويلا وبسيط، وانخفاض تكلفة 2D نموذج أحادي الطبقة 1-6. دراسات في الثقافة 2D غالبا ما تكون غير قادرة على تكرارها في الجسم الحي. نماذج كروي من أنواع عديدة من السرطان قادرة على محاكاة خصائص النمو، والحساسية المخدرات، واختراق المخدرات، والتفاعلات خلية خلية، وتوافر المقيد من الأوكسجين والمواد المغذية وتطوير نخر أن ينظر في الجسم الحي في الأورام الصلبة 6-11. الكروية تطوير نواة نخرية، وهي منطقة هادئة أو G1 القبض المحيطة الأساسية، والخلايا المتكاثرة في محيط كروي 7. تطوير هذه المناطققد تختلف تبعا لكثافة الخلايا، ومعدل انتشار وحجم كروي 12. تم الافتراض بأن عدم التجانس الخلوية ينظر في هذه المناطق الفرعية المختلفة قد يسهم في علاج السرطان المقاومة 13،14. وبالتالي القدرة على تحليل الخلايا في هذه المناطق أمر حاسم لردود المخدرات فهم الورم بشكل منفصل.
ويستند (FUCCI) نظام مضان ubiquitination مؤشر دورة الخلية على أحمر (Kusabira أورانج - KO) والأخضر (الأعظمي الأخضر - AG) العلامات الفلورية من Cdt1 وgeminin، والتي تدهورت في مراحل مختلفة من دورة الخلية 15. وبالتالي نواة الخلية تظهر حمراء في G1، الأصفر في أوائل S والخضراء في S / G2 / M المرحلة. وصفنا هنا طريقتين التكميلية على حد سواء باستخدام FUCCI لتحديد دورة الخلية، جنبا إلى جنب مع استخدام برامج التصوير أو تدفق نشر صبغة الخلوي فحص لتحديد ما إذا كانت الخلايا الموجودة في مركز اعتقال G1 أو proliferatin الخارجيز حلقة، والمسافة من الخلايا الفردية من على حافة كروي. وقد وضعت هذه الأساليب لدينا في المنشور السابق، حيث أثبتنا أن خلايا سرطان الجلد في مناطق ميتة في وسط كروي و / أو في وجود العلاجات المستهدفة تكون قادرة على البقاء في اعتقال G1 لفترات طويلة من الزمن، ويمكن إعادة دخول دورة الخلية عندما تنشأ ظروف أكثر ملاءمة 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FUCCI تنبيغ والثقافة خلية
- FUCCI تنبيغ
- إنشاء خطوط الخلايا معربا عن ستابلي FUCCI يبني mKO2-hCdt1 (30-120) وMAG-hGem (1-100) 15 باستخدام الفيروسة البطيئة المشارك تنبيغ كما هو موضح سابقا 7.
ملاحظة: نظام FUCCI هو الآن متاحة تجاريا. - توليد الحيوانات المستنسخة الفرعية مع مضان مشرق من خلال الفرز وحيدة الخلية. خلايا النوع احدة إيجابية لكلا AG وKO (الأصفر) من خلال مضان خلية تنشيط الفرز في لوحة 96-جيدا كما هو موضح سابقا 7،16.
- إنشاء خطوط الخلايا معربا عن ستابلي FUCCI يبني mKO2-hCdt1 (30-120) وMAG-hGem (1-100) 15 باستخدام الفيروسة البطيئة المشارك تنبيغ كما هو موضح سابقا 7.
- ثقافة خلية سرطان الجلد
- ثقافة C8161 خلايا سرطان الجلد البشري كما هو موضح سابقا 7،17.
2. 3D كروي تشكيل (كما هو موضح سابقا 3،9)
- إعداد لوحة الاغاروز
- حل 1.5٪ الاغاروز (أو أجار النبيل) في 100 مل من محلول هانك الملح المتوازن (HBSS) أو buffere الفوسفاتد المالحة (PBS) من الغليان في الميكروويف لمدة 3-5 دقائق مع دوامات. تأكد من حل الاغاروز تماما.
- الاستغناء على الفور 100 ميكرولتر من الحل الاغاروز لكل بئر إلى 96-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مسطحة القاع باستخدام ماصة متعدد القنوات.
ملاحظة: قد الاغاروز يصلب في نصائح بعد فترة قصيرة من الزمن، للتغلب يجب تغيير هذه المشكلة النصائح بين لوحات إذا جعل أكثر من لوحة الاغاروز. - ترك لوحة 96-جيدا على سطح مستو لتتصلب الاغاروز لا يقل عن 1 ساعة.
- إعداد الخلايا وتراكب على الاغاروز
- تنمو الخلايا إلى ما يقرب من 80٪ confluency في قارورة T75. تغسل مع 10 مل من HBSS.
- فصل الخلايا باستخدام 1.5 مل من 0.05٪ التربسين / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) وresuspend في 10 مل من المتوسط العادي.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات 18 أو غيرها من طريقة العد الآلي.
- الخلايا resuspend إلى تركيز النهائي من 25000 خلية / مل في القاعدةآل المتوسطة.
- تراكب الآبار الاغاروز مع 200 ميكرولتر من تعليق خلية لالعدد النهائي للخلايا في 5000 أيضا.
- لوحات عودة إلى حاضنة الثقافة الخلية (5٪ CO 2 و 37 ج) لتشكيل الأجسام الشبه الكروية على ما يقرب من 3 أيام.
ملاحظة: الوقت المستغرق لتشكيل كروي يختلف بين خطوط مختلفة من الخلايا. بعض خطوط الخلايا لا تشكل الأجسام الشبه الكروية باستخدام هذه الطريقة على الإطلاق. - صورة كروي التشكل مع مجهر مقلوب باستخدام الهدف 4X ومرشح النقيض من المرحلة. A خط الخلية التي تشكل بنجاح سوف الكروية تنتج المدمجة، وحدات الخلايا كروية تقريبا، وينبغي أن يكون هناك كروي واحد فقط لكل بئر.
ملاحظة: اختياري: مرة واحدة وقد شكلت الكروية، فإنها يمكن زرعها في الكولاجين أو مصفوفة أخرى لمزيد من التحليل للنمو والغزو 3،7،17. لإزالة الأجسام الشبه الكروية من الكولاجين، علاج مع 500 ميكرولتر من 2 ملغ / مل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية حتى يذوب الكولاجين يكفي لspherالكويكبات القادمة مجانية في وسائل الإعلام (حوالي 30 دقيقة). بلطف إزالة الأجسام الشبه الكروية باستخدام ماصة 1 مل. - لباجتزاء / التصوير الكروية الإصلاح (إما معزولة من الكولاجين أو نمت لمدة 3-5 أيام على الاغاروز) في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة (تنبيه: الفورمالين ينبغي أن تستخدم في خزانة الدخان) لا يقل عن 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) ، أو بين عشية وضحاها (O / N) في 4 درجات مئوية. قد يتم تخزين الكروية في HBSS في 4 درجات مئوية لعدة أيام.
3. الجسم الشبه الكروي Vibratome باجتزاء
- حل 5 غرام من انخفاض الاغاروز نقطة انصهار في 100 مل من HBSS في زجاجة 500 مل في الميكروويف. استخدام إعداد الحرارة المتوسطة مع دوامات. تنبيه: حافظ على غطاء فضفاض عند الغليان الحل بحيث يمكن أن يتم الافراج عن الضغط. استخدام القفازات المقاومة للحرارة وقائية لحماية اليدين من حروق عند التعامل مع زجاجة ساخنة.
- انتظر حتى يبرد الاغاروز قليلا - حتى يمكن لمسه الزجاجة دون حرق اليدين.
- صب approximately 2 مل من الاغاروز في الجزء السفلي من عداد كوب كولتر أو قالب من البلاستيك مماثلة. نضح على الفور كروي ثابت (انظر القسم 2.2.8) باستخدام ماصة 1 مل في أصغر حجم ممكن السائل. إضافة كروي إلى الاغاروز. ويمكن إضافة عدد قليل من الكروية (تصل إلى 10) للكوب الواحد.
- تغطية الكروية مع 2 مل أكثر من الاغاروز. القيام بذلك بسرعة لتجنب تصلب الاغاروز قبل إضافة الطبقة الثانية.
- السماح للالاغاروز لتتصلب في RT في الظلام لمدة لا تقل عن 3 ساعة. قد تكون مخزنة في هذه النقطة الكؤوس لفترة قصيرة في 4 ° C مع 2-3 مل من HBSS مضافين لمنع الجفاف.
- إزالة الاغاروز من الكأس. تقليم الاغاروز التي تحتوي على الأجسام الشبه الكروية بحيث يناسب على كتلة معدنية vibratome، والكروية هي قريبة من الجزء العلوي من الاغاروز. ويمكن رؤية الأجسام الشبه الكروية ككائنات صغيرة بيضاء داخل الاغاروز. سوبر الغراء الاغاروز إلى كتلة.
- ملء vibratome مع الماء المقطر وجبل كتلة في vibratome. تعيينvibratome لقطع 100 ميكرون المقاطع باستخدام سرعة منخفضة (وضع 2) والاهتزاز عالية (وضع 8). ضبط زاوية شفرة القطع إلى 16 درجة. تحويل vibratome على، بدوره على ضوء vibratome وقطع مقاطع من الجزء العلوي من الاغاروز حتى يتم قطع 100 ميكرون أقسام كروي. وضع المقاطع كروي يقتطع HBSS في 24 لوحة جيدا.
- اختيار المقاطع المتوسطة لتحليل الصور. أقسام جبل على الشرائح عن طريق تحويل قسم شقة على الشريحة باستخدام الملقط. حقنة ملء برميل 10 مل مع الشحوم فراغ. إضافة سطر رقيقة من الشحوم فراغ حول حواف القسم من أجل منع وسائل الإعلام متزايدة من يلوذ بالفرار حواف الشريحة ومساعدة ختم هذا الباب في ساترة. تغطية القسم مع تصاعد المتوسطة وساترة. ختم حواف ساترة مع طلاء الأظافر. متجر الشرائح في 4 درجات مئوية قبل التصوير.
4. متحد البؤر الحصول على الصور
- التقاط صورة ض شريحة من قسم كروي منتصف FUCCI باستخدام 10Xأو الهدف 20X كما هو موضح سابقا 7. تأكد من عدم تداخل أو الحديث المتبادل يحدث بين Kusabira Orange2 والأعظمي الأخضر. إذا بمقارنة تحليل الصور بين أقسام كروي متعددة، والحفاظ على قوة الليزر وغيرها من الأماكن نفسها بين العينات.
5. هويشت صبغ إنتشار الفحص عن تدفق الفرز
- نقل الكروية الحية (3-5 أيام بعد البذر الاغاروز) إلى أنبوب 15 مل. السماح الكروية خطورة تترسب في قاع الأنبوب. قد تكون ملطخة عدة الكروية في أنبوب. وهناك حاجة إلى ما يقرب من 20 الكروية للحصول على أرقام الخلية كافية لالتدفق الخلوي.
- إزالة المتوسطة الزائد وإضافة 1 مل من 10 ميكرومتر هويشت مخففة في المتوسط العادي. احتضان الكروية عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 1 ساعة. استخدام عبها لطيف ل resuspend الكروية مرة أو مرتين خلال الحضانة.
ملاحظة: فترة حضانة قد تكون متنوعة لتغيير مدى تخترق صبغ هويشت في الكروية. وتختلف هذه القائمة علىحجم كروي والكثافة وخط الخلية. بالنسبة لبعض الكروية الكبيرة / الكثيفة قد يكون هناك اختراق صبغ الأقصى الذي هو أقل من 100٪. - غسل الكروية بلطف مع 5 مل من HBSS باستخدام الجاذبية تسوية.
- اختياري: لتصوير تغلغل الصبغة: إصلاح الكروية مع 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لا يقل عن 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. إعداد vibratome أقسام، جبل على الشرائح والصورة على مبائر كما هو موضح في الخطوات 3 و 4 أعلاه.
- لإعداد الخلايا للالتدفق الخلوي، ويعرض للتريبسين الكروية مع 1 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 30 دقيقة مع التحريك كل 10 دقيقة لكسر الكروية على حدة.
ملاحظة: الأجسام الشبه الكروية هي صعبة للوصول الى تعليق خلية واحدة، قد تكون هناك حاجة إلى أن يكون الأمثل الظروف. جدوى C8161 4 أيام الكروية القديمة بعد هذه العملية هي حوالي 95٪. - خلايا صمة عار مع العيش بالقرب من الأشعة تحت الحمراء / وصمة عار الميتة وفقا لبروتوكول المصنعين. يغسل مع HBSS ثم إصلاح مع 1مل من 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لحوالي 30 دقيقة. قد يتم تخزين الخلايا في HBSS في 4 درجات مئوية لعدة أيام قبل تحليل التدفق.
6. تحليل تدفق الخلوي من هويشت الملون FUCCI الأجسام الشبه الكروية
- لا تجمعت ضمان الخلايا معا عن طريق تمرير لهم من خلال مصفاة الخلية. و resuspend ملطخة هويشت الكروية FUCCI في الجليد غسل FACS الباردة (PBS مع 5٪ الجنين مصل العجل) بتركيز 1-5 × 10 6 خلية / مل. نقل 200 ميكرولتر من عينة إلى 5 مل جولة أنابيب أسفل.
- إعداد عينات السيطرة لون واحد التالية كما هو موضح في 6.1: خلايا سرطان الجلد الملون للأمم المتحدة؛ خلايا سرطان الجلد الملتصقة ملطخة 10 ميكرومتر هويشت لمدة 1 ساعة. AZAMI الأخضر يعبر فقط خلايا سرطان الجلد. وKusabira البرتقالي يعبر فقط خلايا سرطان الجلد.
ملاحظة: الضوابط لون واحد قد تكون ثابتة في الفورمالين وتخزينها في FACS غسل بنسبة 0.1٪ أزيد الصوديوم في 4 درجة مئوية لمدة أسابيع أو حتى أشهر. - تعليق خلية واحدة تشغيل ستدفق غ الخلوي محلل مع الليزر المناسبة ولون واحد / الضوابط غير ملوثين كما سبق وصفه 7،16.
- استخدام البرمجيات الخلوي التجاري مثل FlowJo لتحليل الداخلية مقابل الخلايا كروي الخارجي على النحو التالي:
- إزالة الأنقاض التي تبوب على السكان الخلية الرئيسية في ضوء توجيه مبعثرة (FSC) مقابل الجانب على ضوء مبعثرة (SSC).
- إزالة الحلل التي تبوب على الخلايا واحدة باستخدام FSC (المنطقة) مقابل FSC (الارتفاع)
- بوابة للخلايا الحية النابضة على الحي / الميت السكان منخفضة.
- تعريف هويشت خلايا عالية، بوابات بناء على اشارة ايجابية من الخلايا الملتصقة ملطخة هويشت، وخلايا "الخارجي".
- تعريف هويشت خلايا منخفضة أو سلبية، بوابات بناء على إشارة من السيطرة الملطخة الأمم المتحدة، وخلايا "الداخلية".
- بعد النابضة للسكان الداخلي والخارجي، وخلايا يمكن بوابات أخرى لFUCCI الأحمر (G1)، والأصفر (S المبكر) والأخضر (S / G2 / M) أو السلبي (G1 المبكر).
ملاحظة: Compensation باستخدام عناصر التحكم لون واحد قد تكون هناك حاجة لتعريف صحيح FUCCI السكان الأحمر والأصفر والأخضر والسلبية.
- مرة واحدة وقد تم تحسين الفحص والتحقق من صحة هويشت الاختراق عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، تشغيل خلايا دون تحديد على فارز خلية تدفق كما هو موضح سابقا 7،16 لمزيد من التحليل للخلية الحية الفرعية من السكان.
تحليل 7. صورة من أقسام FUCCI كروي
- البرمجيات مفتوحة على سبيل المثال. Volocity، واختيار التكوين الوحيد الكميات.
- إنشاء مكتبة جديدة. استيراد FUCCI كروي ملف صورة مبائر في البرنامج عن طريق سحب ملف البيانات الخام من متحد البؤر في المكتبة. بدلا من ذلك، استخدم ملف> الأمر استيراد.
- انتقل إلى علامة التبويب قياسات لبناء بروتوكول تحليل الصور. هو مبني على البروتوكول عن طريق سحب وإسقاط الأوامر المناسبة في الترتيب الصحيح على النحو التالي في إطار البروتوكول.
- البحث عن الكائناتالنظام الأوروبي في القناة الخضراء: اسحب الكائنات اكتشاف الأمر (وجدت في "الحقائق") في إطار بروتوكول، حدد القناة الصحيحة في الكائنات العثور protocol.Add أمر مفتوح (وجدت في "معالجة")، ثم اعترض لمس منفصلة الأمر (وجدت في "معالجة" - وهذا سوف فصل الخلايا). استبعاد الكائنات عن طريق حجم <50 ميكرون (وجدت في "تصفية" - وهذا سوف استبعاد الأشياء غير الخلوية الصغيرة).
ملاحظة: متغيرات مثل الكائنات العثور على العتبة، عدد التكرارات مفتوحة، وحجم الكائنات التي سيتم فصلها وحجم الكائنات إلى استبعاد يجب أن يكون الأمثل يدويا حتى تطابق أقنعة وجوه الصورة. - العثور على كائنات في القناة الحمراء: تكرار عثور على الأشياء على النحو الوارد أعلاه للقناة الحمراء. قد تحتاج بروتوكولات الخضراء والحمراء لتعديلها بشكل منفصل.
ملاحظة: نظرا لنوى يجري في G2، نوى الخضراء غالبا ما تكون أكبر قليلا. - تأكيد الأشياء التي يعثر عليها هي دقيقة: تأكيد الأحمر وتطابق الكائنات الخضراء للنوى الحمراء والخضراء في الصورة عن طريق إيقاف وعلى قنوات خضراء وحمراء (باستخدام إخفاء أو إظهار القيادة قناة) أثناء عرض أقنعة حمراء وخضراء وجدت من قبل البروتوكول. خيارات الملاحظات (القياسات> خيارات ردود الفعل) يمكن أن تستخدم لتعديل مظهر أقنعة وجوه.
- العثور على كائنات صفراء (خلايا مرحلة مبكرة S): العثور على خلايا صفراء، إضافة تتقاطع مع الخلايا الحمراء الخضراء الأوامر (وجدت في "الجمع"). استبعاد الأشياء حسب الحجم (<50 ميكرون، وجدت في 'تصفية') لاستبعاد أي أشياء غير الخلوية الصغيرة.
- البحث عن الكائنات الحمراء حصرا (خلايا المرحلة G1): لإيجاد نواة الحمراء حصرا، وطرح الخلايا الصفراء من خلايا الدم الحمراء (وجدت في "الجمع"). استبعاد الكائنات عن طريق حجم <50 ميكرون، (وجدت في 'تصفية') لإزالة أي أجسام غير الخلوية الصغيرة التي تم إنشاؤها.
- البحث عن الكائنات الخضراء حصرا (خلايا المرحلة S / G2 / M): كرر لقناة الخضراء لتجد الأخضر حصرا.
لاالشركة المصرية للاتصالات: إذا كان لا يزال هناك أشياء غير الخلوية المتبقية، يمكن إضافة أمر السكان مرشح لبروتوكولات الخضراء أو حصرية حصرية الحمراء (وجدت في 'تصفية') للاحتفاظ فقط الكائنات مع عامل شكل أكبر من 0.25. سيؤدي هذا إلى إزالة الكائنات غير دائرية. - العثور على مخطط كروي: العثور على مخطط كروي باستخدام العثور على كائنات الأوامر (وجدت في "الحقائق") مع قناة خضراء أو حمراء (أيهما ديه المزيد من الخلايا حول حافة كروي). A أقل بكثير عتبة (وجدت في العثور على الأشياء المتغيرات) سوف تحتاج إلى استخدامها للعثور على مخطط كروي مقارنة مع الخلايا الفردية.
- استخدام أمر وثيق للانضمام الأجسام (وجدت في "معالجة")، ثم ملء الثقوب في الأشياء (وجدت في "معالجة")، ثم استخدام عامل تصفية غرامة (وجدت في 'تصفية') لإزالة الضوضاء من الكائنات. وأخيرا، واستبعاد الكائنات عن طريق حجم لإزالة الأجسام الصغيرة <30000 ميكرون (اعتمادا على حجم كروي).
ملاحظة: هذا البروتوكول سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل يدويا حتى مخطط كروي دقيق. ويمكن أيضا صورة brightfield استخدامها - ولكن هذا عادة ما يكون أقل دقة مع قسم كروي، وأمر قلب (وجدت في "الجمع") سوف تحتاج لاستخدامه.
- استخدام أمر وثيق للانضمام الأجسام (وجدت في "معالجة")، ثم ملء الثقوب في الأشياء (وجدت في "معالجة")، ثم استخدام عامل تصفية غرامة (وجدت في 'تصفية') لإزالة الضوضاء من الكائنات. وأخيرا، واستبعاد الكائنات عن طريق حجم لإزالة الأجسام الصغيرة <30000 ميكرون (اعتمادا على حجم كروي).
- قياس المسافات من نواة لمخطط كروي: قياس المسافات (وجدت في 'المتعلقة') من سكان الأصفر والأخضر والأحمر حصرا حصرا من النقطه الوسطى الخلية إلى حافة كروي outline.To تصور الحد الأدنى للمسافات التي ينبغي أن تكون من الخلية إلى أقرب حافة كروي، بدوره على عرض المسافات في علامة التبويب العلاقات في الخيارات ردود الفعل (القياسات> خيارات ملاحظات> العلاقات).
- حفظ البروتوكول. هذا البروتوكول يجوز إعادة تطبيقها لغيرها من الصور باستخدام القياسات> الأمر استعادة البروتوكول.
- إنشاء عنصر القياسات (القياسات> جعل قياس البند). يجوز تحليل البيانات باستخدام تحليلالدالات.
- انتقل إلى علامة التبويب تحليل في هذا البند القياسات. انتقل إلى القائمة التحليل (تحليل> تحليل) وتحليل الحد الأدنى للمسافة من النقطه الوسطى خلية (أحمر، أخضر أو أصفر) إلى حافة كروي، لخصها العد والتي نظمتها السكان.
- لحساب عدد من الخلايا التي توجد على مسافة معينة من على حافة إنشاء فلتر (تحليل> تصفية). يستند عامل لمدة لا تقل عن بعد في الشكل 2 على هويشت الاختراق (مثل الحد الأدنى للمسافة أقل من 80 يعطي السكان "الخارجي"). بدلا من ذلك، تصدير البيانات الخام إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
هناك عدة طرق لإنتاج الأجسام الشبه الكروية الورم، ويستخدم هذا البروتوكول طريقة نمو غير ملتصقة، حيث يتم استزراع الخلايا على أجار أو 3،7،9 الاغاروز الشكل يظهر 1 مثال على كروي C8161 سرطان الجلد بعد 3 أيام على أجار. الكروية C8161 شكل الكروية العادية الحجم التي يبلغ قطرها 500-600 ميكرون (يعني = 565، SD = 19، ن = 3) بعد 3 أيام. خطوط الخلايا سرطان الجلد الأخرى التي ستشكل الكروية وتشمل: WM793، WM983C، WM983B، WM164، 1205lu (الكروية شكلت مع هذا الخط الخلوي غير منتظمة وأقل كثافة 19).
من أجل تصور دورة الخلية من الخلايا الفردية ضمن نموذج كروي 3D، تم transduced خلايا سرطان الجلد C8161 مع نظام FUCCI 7،15. نظرا لحجم كبير من الكروية (تصل إلى 1 مم في القطر بعد 3 أيام على الاغاروز و 24 ساعة في نمو الكولاجين لC8161)، باجتزاء هو الخيار الأفضل لتصور الخلايا في وسط كروي. كاملقد يمكن تصوير الكروية (حية أو ثابت) بواسطة المجهر متحد البؤر، ولكن التصوير متحد البؤر هو فقط قادرة على اختراق ما يصل الى حوالي 150 ميكرون، وبالتالي شريحة البصرية الوسطى من كروي لا يمكن الحصول عليها في الكروية التي يبلغ قطرها أصغر من 300 ميكرون. الشكل 2A، B و C يدل على سبيل المثال من خلال قسم كروي C8161 FUCCI. A الأساسية النخر، وتحيط بها خلايا G1 القبض، مع التدرج من الخلايا المتكاثرة في الطبقات الخارجية هو واضح. لتحديد وقياس الخلايا استنادا موقفهم في حالة كروي ودورة الخلية، تم إجراء تحليل صورة شبه الآلية. ويبين الشكل 2D في FUCCI أقنعة الخلية وكروي مخطط، ويبين الشكل 2E الكمي لأعداد الأحمر (G1) و(S / G2 / M) خلايا خضراء أو صفراء إما أقل من 80 ميكرون من حافة كروي (خلايا الخارجي) أو أكبر من 80 ميكرون من حافة كروي (الخلايا الداخلية). هذا quantificatiيظهر على أن الخلايا الحمراء في G1 يتم إثراء كبيرا في المنطقة الداخلية للكروي، كما هو متوقع.
من أجل تحديد ويحتمل أن تكون فرز الخلايا استنادا الوضع دورة الخلية والموقف في كروي، تم استخدام هويشت صبغ نشر الفحص في تركيبة مع نظام FUCCI. الحضانة من الكروية بأكملها مع نتائج صبغ هويشت في انتشار محدود من الصبغة إلى الطبقات الخارجية للكروي، وهذا يمكن أن تستخدم لفصل هويشت خلايا الطبقة الخارجية الإيجابية من هويشت خلايا كروي الداخلية السلبية عن طريق التدفق الخلوي. ويبين الشكل 2F تغلغل هويشت تصل إلى حوالي 80 ميكرون من حافة كروي. تم الحصول على المسافة الإيجابية هويشت من 80 ميكرون من حافة طريق تحليل البصري للأقسام كروي وتعظيم الاستفادة من الوقت تركيز الصبغة والحضانة بحيث تغلغل هويشت شهد عن كثب الخلايا المتكاثرة في الطبقات الخارجية (التي توجد إلى حد كبير أقلمن 80 ميكرون من حافة)، ولم تخترق G1 القبض area.The فترة حضانة مع هويشت قد تكون متنوعة للحصول على أعمق أو ضحالة الاختراق. مثال متفاوتة هويشت اختراق على مر الزمن في موضح في الشكل (3). ويبين الشكل 4A مثال على النابضة لهويشت السكان العالية والمنخفضة، في حين أن الشكل 4C وD يدل على النابضة لFUCCI خلايا الدم الحمراء، الصفراء والخضراء. الشكل 4B يبين الكمي لعدد من الأحمر (G1) و (S / G2 / M) خلايا خضراء أو صفراء إما في هويشت عالية (خلايا الخارجي) أو هويشت (الخلايا الداخلية) منخفضة. مرة أخرى تظهر هذه التقنية أن خلايا الدم الحمراء في G1 يتم إثراء كبيرا في المنطقة الداخلية للكروي (راجع. تشابه لتحليل الصورة في الشكل 2E).
الشكل1: C8161 كروي المرحلة التمثيلية النقيض من الصورة التي اتخذت في 10X التكبير من كروي C8161 بعد 3 أيام الثقافة على أجار. يساوي شريط مقياس 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: C8161 FUCCI كروي تحليل الصور صورة الممثل من C8161 FUCCI كروي vibratome القسم الذي اتخذ في 20X التكبير. كان كروي مثقف لمدة ثلاثة أيام على الاغاروز، ثم 24 ساعة إضافية في مادة الكولاجين. متحد البؤر Z-شريحة من (A) الأعظمي الأخضر، (B) Kusabira Orange2 و (C) FUCCI تراكب. على نطاق وبار = 100 ميكرون. (D) الأحمر والأخضر أقنعة كائن تم إنشاؤه في Volocity، مع مخطط كروي في الرمادي. ARالصف يشير 80 ميكرون المسافة من الحافة كروي. (E) الكمي لأعداد الأحمر (G1) والأصفر (S / G2 / M) خلايا خضراء / داخل الداخلية (> 80 ميكرون من حافة كروي) والخارجي (<80 ميكرون من حافة كروي) المناطق. أشرطة الخطأ تمثل SD من 4 أقسام كروي من 2 تجارب مستقلة. (F) الاختراق من 10 ميكرومتر هويشت صبغ بعد 1.5 ساعة الحضانة. على نطاق وبار = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: C8161 كروي هويشت صبغ إنتشار الوقت دورة متحد البؤر الممثل الصور ض شريحة من منتصف كله C8161 الكروية مثقف على الاغاروز لمدة 4 أيام وحضنت مع 10 ميكرومتر هويشت عن الأوقات المحددة. التي اتخذت في 10X التكبير. أشرطة بيضاء تشير إلى عمق الاختراق هويشت تقريبي. لاحظ أن الكروية C8161 الاغاروز هي أكثر كثافة من الكروية C8161 التي تم زرعها في الكولاجين لمدة 24 ساعة في الشكل 2، مما أدى إلى أقل صبغ اختراق في النقطة الزمنية نفسها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: C8161 FUCCI كروي تحليل تدفق (A) مثال هويشت النابضة العالية والمنخفضة بعد الحضانة من 20 الكروية مع 10 ميكرومتر هويشت. الخط الأزرق يشير إلى مراقبة غير ملوثين، الخط الأخضر يشير إلى السيطرة هويشت الملون بالكامل. (B) الكمي لأعداد / خلايا صفراء حمراء وخضراء داخل الداخلي (منخفض هويشت) والخارجي (هويشت عالية) صopulations. أشرطة الخطأ تمثل SD من 8 تجارب مستقلة (بما في ذلك فرز الحية وتحليل الخلية ثابت). مثال FUCCI النابضة لالداخلي (C) والخارجي (D) السكان كروي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
حدد تحليل الصور الآلي شبه والداخلية G1 القبض المنطقة كروي، وتنتشر الطبقات الخارجية. هذه الطريقة يمكن أن تستخدم في الكروية الحية باستخدام الجزء البصري، أو في أقسام كروي ثابت، لتحديد التغييرات ليس فقط في دورة الخلية ولكن علامة التعبير (عن طريق المناعي)، موت الخلايا، أو مورفولوجيا الخلايا في هذه المناطق المختلفة. الحركة خلية داخل المناطق كروي مختلفة أيضا أن يكون كميا - إذا تم إضافة الحية متحد البؤر وقت التصوير انقضاء جنبا إلى جنب مع خطوة تحليل الصور تتبع الخلية. حاسمة لتحليل الصور هي التي يتم الحصول عليها شريحة مبائر الصور عالية الجودة Z- والصور عالية الدقة تتيح التعرف بشكل أفضل على الخلايا. قيود واحد مع تحليل الصور هو أنه ليس من الممكن أن يجد كل خلية بشكل صحيح إذا نوى كثيفة جدا، أو إذا كان هناك الكثير من الاختلاف في شدة الحمراء والخضراء. الخلايا السلبية FUCCI (في G1 المبكر) ليست قادرة على أن تكون وجدت مع هذه الصورة أسلوب التحليل والأحمر فقط (G1)،الصفراء (المرحلة الأولى S) والأخضر (S / G2 / M). عيب واحد آخر من أسلوب التحليل القائم على الصورة الموضحة هنا هو أنه لا يأخذ بعين الاعتبار طبيعة 3D الكاملة للالكروية. على الرغم من أن برنامج Volocity يمكن أن تؤدي قياسات 3D باستخدام الصور ض المكدس، الفحص المجهري متحد البؤر غير قادر على اختراق والصورة من خلال كروي كامل نظرا لحجم كبير. ويمكن استخدام التصوير متعددة الفوتون للحصول على ض المكدس من كروي كامل ل3D القياسات 7 كما تسمح هذه التكنولوجيا اختراق تصل إلى 500 ميكرون، على الرغم من أن بعض الأجسام الشبه الكروية قد تكون لا تزال كبيرة جدا لصورة كاملة الكروية عبر هذه الطريقة. وثمة خيار آخر لتصوير كروي كله المجهر أساس ورقة ضوئية، والذي يسمح التصور كروي من زوايا متعددة وتخترق ما يصل الى 200 ميكرون داخل الكروية الكبيرة 20،21. اختيار استراتيجية التصوير قد يتأثر حجم كروي، كثافة التعبئة الخلية ونوع من الخلايا.
الصبغة diffusio هويشتوكان أول وصف طريقة ن لفصل الخلايا الداخلية والخارجية في كروي متعددة الخلايا عبر التدفق الخلوي في عام 1982 (22). ويستند هذا الأسلوب على حقيقة أن الصبغة هويشت ينتشر ببطء في كروي، مع الخلايا الخارجية يجري ملطخة أولا. بروتوكول الموصوفة هنا يجمع بين الأسلوب هويشت مع نظام FUCCI 15، والذي يسمح ليس فقط فصل الخلايا كروي الداخلية والخارجية، ولكن أيضا تصور هويشت الاختراق فيما يتعلق الحلقة الداخلية للخلايا G1 القبض عليه. وهذا يسمح فصل دقيق للمنطقة G1 القبض كروي. باستخدام FUCCI وحدها لا يسمح فصل الخلايا G1 الداخلي اعتقل من كروي، بالنظر إلى أن الخلايا المتكاثرة الخارجية تحتوي أيضا على خلايا في G1. وجود قيود هو أن هذا الأسلوب يسمح فقط لفصل الخام من كروي إلى منطقتين ("الخارجية" هويشت إيجابية و "الداخلية" هويشت سلبية). صالح هذه الطريقة على تحليل الصور، هو أن fانخفاض الخلوي يسمح علامات متعددة لفحصها في وقت واحد، والفصل المادي بين الخلايا الحية لمزيد من التحليل المصب مثل الجينات أو تعبير البروتين، وإعادة زراعة في ظروف بيئية مختلفة، العلاج بالعقاقير أو التحليلات الأخرى.
نظام كروي FUCCI في تركيبة مع التدفق الخلوي وتحليل الصور يسمح بتحديد من الحلقة الداخلية للخلايا G1 القبض المحيطة الأساسية النخر، وطبقة خارجية من الخلايا المتكاثرة. هو اعتقال نخر وG1 وجدت في وسط كروي بسبب نقص الأوكسجين والمواد المغذية، ويتطور مع نمو كروي في الحجم. سابقا، نحن وغيرنا أظهرت شارك توطين للعلامة نقص الأكسجة pimonidazole مع G1 القبض مركز كروي 7،23. علينا أن نبرهن أيضا أن انتشار يحدث إلى حد كبير داخل حوالي 100 ميكرون من حافة كروي. هذا يتطابق مع دراسات سابقة في الكروية 12،23،24، وأيضا يرتبط مع دistance من الخلايا المتكاثرة من أقرب الأوعية الدموية في الجسم الحي 25،26.
طريقة بديلة التي يمكن أن تستخدم لفصل الخلايا استنادا موقفهم في كروي لالتدفق الخلوي أو تحليل الآخر هو trypsinization متتابعة 24،27. في هذه الطريقة يتم إزالة المتعاقبة "قذائف" كروي من قبل قصيرة، وفترات حضانة متتابعة مع التربسين في درجات الحرارة المنخفضة. لكن استخدام هذا الأسلوب هو أكثر صعوبة للتأكد على وجه الدقة حجم القشرة الخارجية (في سمك ميكرومتر) التي يتم إزالتها بالمقارنة مع هويشت طريقة صبغ نشرها، حيث تغلغل هويشت يمكن تصور مباشرة وقياسها.
فصل الخلايا "الداخلية" و "الخارجية" عن طريق الانتشار صبغ و / أو تحليل الصور يمكن أن تمتد إلى دراسات FUCCI xenografts ورم في الفئران. ومع ذلك، لتحليل دورة الخلية في الجسم الحي، كما ينبغي أن يكون وجود الأوعية الدموية تاكين في الاعتبار، والخلايا في الورم قد يكون قادرا على الوصول إلى الأوكسجين والمواد المغذية من الأوعية الدموية في المناطق الوسطى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
