Introduction
Multicellulaire sferoïden 3D zijn bekend als een tumormodel decennia, maar het is pas onlangs aan dat zij vaker gebruik als een in vitro model voor vele vaste kankers zijn gekomen. Ze worden steeds vaker gebruikt in high-throughput drug discovery schermen als intermediair tussen complexe, kostbare en tijdrovende in vivo modellen en de eenvoudige, goedkope 2D monolaag model 1-6. Studies in 2D cultuur zijn vaak niet in staat om te worden gerepliceerd in vivo. Bolvormige modellen van vele soorten kanker kunnen de groeikenmerken, drug gevoeligheid, geneesmiddelpenetratie, cel-cel interacties, beperkte beschikbaarheid van zuurstof en voedingsstoffen en ontwikkeling van necrose die wordt gezien in vivo bij vaste tumoren 6-11 nabootsen. Sferoïden ontwikkelen van een necrotische kern, een zwakke of G1 aangehouden regio rond de kern, en prolifererende cellen op de omtrek van de sferoïde 7. De ontwikkeling van deze regio'sis afhankelijk van de celdichtheid, proliferatiesnelheid en de omvang van de sferoïde 12. Er is verondersteld dat de cellulaire heterogeniteit waargenomen in de verschillende sub-gebieden kunnen bijdragen tot kankertherapie weerstand 13,14. Daarom is de mogelijkheid om cellen te analyseren in deze gebieden afzonderlijk is cruciaal inzicht tumorgeneesmiddel responsen.
De fluorescentie ubiquitinatie celcyclus indicator (Fucci) is gebaseerd op de rode (Kusabira Orange - KO) en groene (Azami Green - AG) fluorescerende tagging van CDT1 en geminin, die worden afgebroken in verschillende fasen van de celcyclus 15. Zo celkernen verschijnen rood in G1, geel in de vroege S en groen in S / G2 / M-fase. We beschrijven hier twee complementaire methoden beide met Fucci de celcyclus identificeren, samen met het gebruik van beeldverwerkingssoftware of kleurstofdiffusie flowcytometrie test om te bepalen of cellen in de G1 aangehouden midden of buitenste proliferatin verblijfG ring, en de afstand van de individuele cellen van de rand van de sferoïde. Deze methoden werden ontwikkeld in onze eerdere publicatie waarin we aangetoond dat melanoomcellen in hypoxische gebieden in het midden van het bolvormige of / en in aanwezigheid van gerichte therapieën kunnen in G1 arrest voor langere tijd blijft en opnieuw kan voer de celcyclus bij gunstiger voorwaarden ontstaan 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fucci Transductie en Cultuur van de Cel
- Fucci transductie
- Maak cellijnen stabiel tot expressie de Fucci construeert mKO2-hCdt1 (30-120) en MAG-hGem (1-100) 15 met behulp van lentivirus co-transductie zoals eerder beschreven 7.
Opmerking: Het Fucci systeem is nu in de handel verkrijgbaar. - Genereren sub-klonen met heldere fluorescentie door eencellige sorteren. Sorteer enkele cellen positief voor zowel AG en KO (geel) van fluorescentie-geactiveerde celsortering in een 96-putjes plaat zoals hierboven beschreven 7,16.
- Maak cellijnen stabiel tot expressie de Fucci construeert mKO2-hCdt1 (30-120) en MAG-hGem (1-100) 15 met behulp van lentivirus co-transductie zoals eerder beschreven 7.
- Melanoom celcultuur
- Culture C8161 humane melanoomcellen zoals eerder beschreven 7,17.
2. 3D Sferoïde Formation (zoals eerder beschreven 3,9)
- Agarose plaat voorbereiding
- Ontbinding van 1,5% agarose (of nobel agar) in 100 ml Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) of fosfaat Buffered zoutoplossing (PBS) door het koken in de magnetron 3-5 minuten met wervelende. Zorg ervoor dat de agar volledig is opgelost.
- Onmiddellijk afzien 100 ul van de agarose oplossing per goed op een vlakke bodem 96-well weefselkweek plaat met behulp van een multi-channel pipet.
Opmerking: Agarose kan stollen in de tips na een korte tijd, om dit probleem te verhelpen uiteinden worden gewijzigd tussen platen als die met verscheidene agarose plaat. - Laat 96-well plaat op een vlak oppervlak te harden agarose gedurende tenminste 1 uur.
- Voorbereiding cel en overlay op agarose
- Kweek cellen ongeveer 80% confluentie in een T75 fles. Wassen met 10 ml HBSS.
- Los cellen met behulp van 1,5 ml 0,05% trypsine / ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en resuspendeer in 10 ml normaal medium.
- Tellen cellen met een hemocytometer 18 of andere geautomatiseerde telmethode.
- Resuspendeer cellen tot een uiteindelijke concentratie van 25.000 cellen / ml in normal medium.
- Overlay agarose putjes met 200 ul van de celsuspensie voor een laatste aantal 5.000 cellen per putje.
- Terug platen aan de celkweek incubator (5% CO2 en 37 ° C) tot sferoïden gevormd gedurende ongeveer 3 dagen.
Opmerking: De tijd die een sferoïde vorming varieert tussen verschillende cellijnen. Sommige cellijnen niet sferoïden deze methode helemaal te vormen. - Afbeelding bolvormige morfologie met een omgekeerde microscoop met een 4X doelstelling en een fase contrast filter. Een cellijn die met succes vormt bolletjes zullen compact, ruwweg bolvormige cel aggregaten te produceren, en er mag slechts één bolvormige per goed.
Opmerking: Optie: Nadat sferoïden zijn gevormd, kunnen ze worden getransplanteerd in collageen of andere matrix voor verdere analyse van de groei en invasie 3,7,17. Om sferoïden van collageen verwijderen behandelen met 500 gl van 2 mg / ml collagenase bij 37 ° C totdat het collageen genoeg voor de koba opgelostOIDs komen vrij in het medium (ongeveer 30 min). Verwijder voorzichtig sferoïden met een pipet 1 ml. - Voor snijden / imaging fix sferoïden (hetzij geïsoleerd van collageen en gekweekt gedurende 3-5 dagen agarose) in 10% neutraal gebufferde formaline (NB: formaline worden gebruikt in een zuurkast) gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur (RT) of overnacht (O / N) bij 4 ° C. Sferoïden worden bewaard in HBSS bij 4 ° C gedurende enkele dagen.
3. Sferoïde Vibratome Sectioning
- Los in een 500 ml glazen fles in een magnetron 5 g laag smeltpunt agarose in 100 ml HBSS. Gebruik een matig vuur instelling met wervelende. VOORZICHTIG: Houd het deksel los wanneer de oplossing te koken, zodat de druk kan worden vrijgegeven. Gebruik beschermende hittebestendige handschoenen om de handen te beschermen tegen brandwonden bij het hanteren van het hete glazen fles.
- Wacht totdat de agarose koelt iets - dus de fles kan worden aangeraakt zonder te verbranden handen.
- Pour approximately 2 ml agarose in de bodem van een Coulter teller beker of dergelijke plastic mold. Onmiddellijk zuigen vaste sferoïde (zie paragraaf 2.2.8) met een pipet 1 ml in het kleinste volume van de vloeistof mogelijk. Sferoïde toe te voegen aan de agarose. Een paar sferoïden (tot 10) kunnen worden toegevoegd per kopje.
- Bedek de sferoïden met 2 ml meer van agarose. Doe dit snel om de agarose uitharden voorkomen voordat de tweede laag wordt toegevoegd.
- Laat de agarose uitharden bij kamertemperatuur in het donker gedurende minimaal 3 uur. Op dit moment koppen worden bewaard gedurende korte tijd bij 4 ° C met 2-3 ml HBSS bedekt om uitdroging te voorkomen.
- Verwijder agarose uit de beker. Knip de agarose met de sferoïden zodat deze past op het vibratome metalen blok en sferoïden zijn dicht bij de top van de agarose. Sferoïden kunnen worden gezien als kleine witte voorwerpen in de agarose. Super lijm de agarose aan het blok.
- Vul het vibratome met gedestilleerd water en monteer het blok in de vibratome. Stel devibratome tot 100 micrometer secties met lage snelheid (stand 2) en hoge trillingen (instelling 8) snijden. Stel het snijblad hoek 16 °. Zet vibratome, zet de vibratome licht gesneden gedeelten van de bovenkant van de agarose tot 100 urn bolvormige delen worden gesneden. Plaats gesneden spheroïde secties in HBSS in een 24-well plaat.
- Kies middelste secties voor beeldanalyse. Mount secties op dia's door de overdracht van de sectie plat op de dia met een pincet. Vul een 10 ml spuit met vacuüm vet; voeg een dunne lijn van vacuüm vet rond de randen van het deel teneinde te voorkomen dat de fixeermiddelen worden uitgevoerd buiten de randen van de schuif en te verzegelen het gedeelte onder het dekglaasje. Bedek de sectie met montage medium en een dekglaasje. Verzegelen randen van dekglaasje met nagellak. WINKEL glijdt bij 4 ° C voor de beeldvorming.
4. Confocale Image Acquisition
- Neem een z-slice afbeelding van een midden Fucci spheroïde sectie met behulp van een 10Xof 20X objectief 7 zoals eerder beschreven. Zorg ervoor dat er geen overlap of overspraak optreedt tussen de Kusabira Orange2 en Azami Green. Als het vergelijken van beeldanalyse tussen meerdere sferoïde secties, houden laservermogen en andere instellingen hetzelfde tussen de monsters.
5. Hoechst Dye Diffusion Assay voor Flow sorteren
- Overdracht levende sferoïden (3-5 dagen na zaaien agarose) naar een 15 ml buis. Laat sferoïden zwaartekracht naar de bodem van de buis. Meerdere sferoïden kunnen worden gekleurd per buis. Ongeveer 20 sferoïden zijn nodig om voldoende aantallen cellen te verkrijgen voor flowcytometrie.
- Verwijder overtollig medium en voeg 1 ml van 10 M Hoechst verdund in normaal medium. Sferoïden Incubeer bij 37 ° C gedurende ongeveer 1 uur. Gebruik zachte tikken om de bolletjes mengen of twee keer tijdens incubatie.
Opmerking: De incubatietijd worden gevarieerd te veranderen hoeverre de Hoechst kleurstof dringt in de sferoïden. Dit zal variëren op basis vande bolvormige grootte, dichtheid en cellijn. Voor sommige grote / dichte sferoïden er een maximum kleurstofpenetratie die minder dan 100% bedragen. - Was de sferoïden voorzichtig met 5 ml HBSS met behulp van de zwaartekracht bezinken.
- Optioneel: Voor beeldvorming van kleurstofpenetratie: Bevestig sferoïden met 10% neutraal gebufferd formaline gedurende ten minste 2 uur bij kamertemperatuur of O / N bij 4 ° C. Bereid vibratoomcoupes, zet op objectglaasjes en het confocale beeld zoals beschreven in stappen 3 en 4 hierboven.
- Cellen voorbereiden voor stroming cytometrie, trypsinize sferoïden met 1 ml 0,05% trypsine / EDTA bij 37 ° C gedurende ongeveer 30 min bij tikken elke 10 min de sferoïden splitsen.
Opmerking: Sferoïden zijn moeilijk te krijgen in enkele celsuspensie, kan het nodig zijn voorwaarden waaraan moet worden geoptimaliseerd. Levensvatbaarheid van C8161 4 dagen oude sferoïden na dit proces is ongeveer 95%. - Stain cellen met een infrarood levend / dood kleuring volgens protocol van de fabrikant. Wassen met HBSS bevestig met 1ml 10% neutrale gebufferde formaline gedurende ongeveer 30 min. Cellen worden bewaard in HBSS bij 4 ° C gedurende enkele dagen voor stroomanalyse.
6. Flowcytometrie Analyse van Hoechst Stained Fucci Sferoïden
- Zorgen cellen niet samen samengeklonterd door ze door een cel zeef. Resuspendeer de Hoechst gekleurd Fucci sferoïden in ijskoude FACS wassen (PBS met 5% foetaal kalfsserum) bij een concentratie van 1-5 x 10 6 cellen / ml. Breng 200 pi monster 5 ml ronde bodem buizen.
- Bereid de volgende enkele kleur controlemonsters zoals beschreven in 6.1:-un gekleurde melanoomcellen; hechtende melanoom cellen gekleurd met Hoechst 10 pM gedurende 1 uur; Azami Green Alleen expressie melanoomcellen; en Kusabira Orange enige expressie melanoomcellen.
Opmerking: Single kleur controles kunnen in formaline worden vastgesteld en opgeslagen in FACS wassen met 0,1% natriumazide bij 4 ° C gedurende weken of zelfs maanden. - Run single celsuspensies ona flowcytometrie analyser met de juiste lasers en enkele kleur / unstained controles zoals eerder beschreven 7,16.
- Gebruik cytometrie commerciële software zoals FlowJo analyseren de binnenste vs. buitenste bolvormige cellen als volgt:
- Verwijder puin door gating op de belangrijkste cel populatie in Forward Verspreid Licht (FSC) versus Side Verspreid Licht (SSC).
- Verwijder doubletten door gating op enkele cellen met FSC (Area) vs. FSC (Hoogte)
- Gate voor levende cellen door gating op de live / dead lage bevolking.
- Definieer Hoechst hoog cellen, gated basis van de positieve signaal van de hechtende cellen gekleurd met Hoechst, als "buiten" cellen.
- Definieer Hoechst lage of negatieve cellen, gated basis van het signaal van de niet-gekleurde controle, "binnenste" cellen.
- Na gating voor de binnenste en buitenste populaties kunnen cellen verder worden omheind voor Fucci rood (G1), geel (vroege S), groen (S / G2 / M) of negatief (vroege G1).
Opmerking: Compensation met behulp van de enkele kleur controles kunnen worden verplicht om de Fucci rood, geel, groen en negatieve populatie goed te definiëren.
- Nadat de test is geoptimaliseerd en Hoechst penetratie gevalideerd via confocale microscopie, werking cellen zonder bevestigen op een flow cel sorteerder zoals eerder beschreven 7,16 voor verdere analyse van levende cellen subpopulaties.
7. Image Analysis van Fucci Sferoïde Secties
- Open software bijvoorbeeld. Volocity, kies de kwantificering enige configuratie.
- Maak een nieuwe bibliotheek. Importeer de Fucci spheroïde confocale image-bestand in de software door de ruwe data bestand te slepen uit de confocale in de bibliotheek. U kunt ook de opdracht Bestand> Importeren.
- Ga naar het tabblad metingen om een beeldanalyse-protocol op te bouwen. Het protocol is gebouwd door het slepen en neerzetten van de juiste commando's in de juiste volgorde als volgt in het protocol venster.
- Vinden objstudiepunten in het groene kanaal: Sleep de voorwerpen te vinden commando (in 'Finding') in het protocol venster selecteert u de juiste kanaal in de vondst objecten protocol.Add een open opdracht (te vinden in de 'Processing'), dan moet een aparte ontroerende voorwerpen commando (gevonden in 'Processing' - dit zal cellen scheiden). Objecten op grootte <50 micrometer te sluiten (te vinden in 'filteren' - dit kleine, niet-mobiele objecten uit te sluiten).
Opmerking: Variabelen zoals de vondst voorwerpen drempel aantal open iteraties, de grootte van de voorwerpen te scheiden en de grootte van voorwerpen uit te sluiten moeten handmatig worden geoptimaliseerd tot het object maskers overeen met de afbeelding. - Vind objecten in het rode kanaal: Herhaal vinden voorwerpen zoals hierboven voor het rode kanaal. Groene en rode protocollen mogelijk moeten apart worden ingesteld.
Let op: Als gevolg van kernen zijn in G2, groene kernen zijn vaak iets groter. - Bevestigen objecten gevonden zijn accuraat: Bevestig de rode en groene objecten overeenkomen met derood en groen kernen in het beeld door het uitschakelen en op de groene en rode kanalen (met behulp van de huid tonen of kanaal commando) tijdens de weergave van de rode en groene maskers gevonden door het protocol. Feedbackopties (metingen> feedbackopties) worden gebruikt om het uiterlijk van het object maskers wijzigen.
- Vind gele objecten (vroege S-fase cellen): Voor gele cellen vinden, voeg een kruisen rood met groene cellen commando (te vinden in 'De combinatie van'). Uitsluiten objecten op grootte (<50 pm, gevonden in 'Filtering') naar een kleine, niet-mobiele objecten te sluiten.
- Vinden uitsluitend rode voorwerpen (G1 fase cellen): Uitsluitend rode kernen vinden, trek de gele cellen van de rode bloedcellen (te vinden in 'De combinatie van'). Objecten uit te sluiten door de grootte <50 micrometer, (te vinden in 'Filtering') naar een kleine, niet-cellulaire voorwerpen gemaakt te verwijderen.
- Vinden uitsluitend groene objecten (S / G2 / M-fase cellen): Herhaal dit voor het groene kanaal uitsluitend groene vinden.
Neete: Als er nog niet-cellulaire voorwerpen blijven een commando filter populatie kan worden toegevoegd aan de exclusieve groene of rode Exclusief protocollen (in 'Filtering) alleen behouden objecten met een vormfactor groter dan 0,25. Dit zal niet-cirkelvormige objecten te verwijderen. - Vind de sferoïde overzicht: Vind de spheroïde omtrek met een vondst objecten commando (in 'Finding') met de groene of rode kanaal (wat meer cellen heeft rond de rand van de sferoïde). Een veel lagere (in de vondst objecten variabelen) moeten worden gebruikt om de omtrek te sferoïde vergelijking met individuele cellen.
- Gebruik een goede opdracht om objecten (te vinden in de 'Processing') mee, vul dan gaten in objecten (te vinden in 'Processing'), gebruik dan een fijne zeef (te vinden in 'Filtering') aan het geluid van objecten te verwijderen. Tenslotte sluiten objecten grootteklasse kleinere objecten <30.000 urn (afhankelijk van de sferoïde grootte) te verwijderen.
Aantekening: Dit protocol moet handmatig worden geoptimaliseerd tot de bolvormige omtrek nauwkeurig is. Een afbeelding brightfield kan eveneens worden gebruikt - dit is echter gewoonlijk minder nauwkeurig met een sferoïde gedeelte en invert commando (in het "combineren") moet worden gebruikt.
- Gebruik een goede opdracht om objecten (te vinden in de 'Processing') mee, vul dan gaten in objecten (te vinden in 'Processing'), gebruik dan een fijne zeef (te vinden in 'Filtering') aan het geluid van objecten te verwijderen. Tenslotte sluiten objecten grootteklasse kleinere objecten <30.000 urn (afhankelijk van de sferoïde grootte) te verwijderen.
- Meet afstanden kernen sferoïde overzicht: Meten van afstanden (in betrekking ') vanaf het geel, uitsluitend groene en rode populaties uitsluitend uit de cel zwaartepunt aan de rand van de bolvormige outline.To de minimum afstanden visualiseren, die moet worden uit de cel naar de dichtstbijzijnde spheroïde rand, zet tonen afstanden in het tabblad relaties in feedback opties (Metingen> Beoordeling opties> Relaties).
- Sla het protocol. Dit protocol kan opnieuw worden toegepast op andere foto's met behulp van de metingen> Herstel protocol commando.
- Maak een metingen artikel (Metingen> Zorg Measurement Item). De gegevens kunnen worden geanalyseerd met de analysefuncties.
- Ga naar het tabblad analyse van de metingen punt. Ga naar het menu Analysis (Analyse> Analyseren) en het analyseren van de minimale afstand van de cel zwaartepunt (rood, groen of geel) aan de rand sferoïde, samengevat door de graaf en georganiseerd door de bevolking.
- Om het aantal cellen die op een bepaalde afstand van de rand tellen maakt een filter (Analyse> Filter). De filter minimumafstand in figuur 2 is gebaseerd op Hoechst penetratie (bijvoorbeeld minimale afstand kleiner is dan 80 geeft het "buitenste" populatie). Als alternatief, exporteren ruwe data naar een spreadsheet voor verdere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn verschillende methoden voor het produceren van bolvormige tumoren, dit protocol gebruikt de niet-hechtende groei methode, waarbij cellen gekweekt op agar of agarose 3,7,9. Figuur 1 toont een voorbeeld van een melanoom C8161 sferoïde na 3 dagen op agar. C8161 sferoïden vormen normaal formaat bolvormige deeltjes met een diameter van 500 - 600 urn (gemiddelde = 565, SD = 19, n = 3) na 3 dagen. Andere melanoom cellijnen die sferoïden zullen vormen, omvatten: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (sferoïden gevormd met deze cellijn zijn onregelmatig en minder dicht 19).
Om de celcyclus van individuele cellen te visualiseren in de 3D sferoïde model werden C8161 melanoomcellen getransduceerd met het systeem Fucci 7,15. Vanwege de grote omvang van de sferoïden (tot 1 mm in diameter na 3 dagen agarose en 24 uur groei van collageen voor C8161), snijden de beste optie voor het visualiseren van cellen in het midden van de sferoïde. Geheelsferoïden (live of vast) kan worden afgebeeld door confocale microscopie, maar de confocale beeldvorming alleen kunnen doordringen tot ongeveer 150 urn, dus een lage optische deel van de sferoïde kan alleen worden verkregen bolvormige deeltjes met een diameter kleiner dan 300 urn. Figuur 2A, B en C toont een voorbeeld van een doorsnede door een C8161 Fucci sferoïde. Een necrotische kern, omgeven door G1 gearresteerde cellen met een gradiënt van prolifererende cellen in de buitenste lagen is evident. Om cellen op basis van hun positie in de bolvormige en celcyclus status van identificatie en kwantificering werd semi-automatische beeldanalyse uitgevoerd. Figuur 2D toont het Fucci cel maskers en sferoïde lijnen en figuur 2E toont de kwantificering van het aantal rode (G1) en groen of geel (S / G2 / M-cellen) ofwel minder dan 80 um van de rand van de sferoïde (buitenste cellen) of groter dan 80 urn van de sferoïde rand (binnenste cellen). Dit quantification laat zien dat rode cellen in G1 sterk zijn verrijkt in het binnengebied van de sferoïde, zoals verwacht.
Om cellen op basis van hun celcyclus status en positie in de bolvormige identificeren en potentieel sorteren, een Hoechst kleurstof diffusie assay in combinatie met Fucci werd gebruikt. Incubatie van hele sferoïden met Hoechst kleurstof leidt tot een beperkte diffusie van de kleurstof in de buitenste lagen van de sferoïde kan deze worden gebruikt voor Hoechst positieve buitenlaag cellen te scheiden van Hoechst negatieve binnenste bolvormige cellen via stroomcytometrie. Figuur 2F toont de penetratie van Hoechst tot ongeveer 80 pm vanaf de bolvormige rand. De Hoechst positiviteit afstand van 80 um van de rand werd verkregen door beeldanalyse van bolvormige gedeelten en optimalisatie van de kleurstof concentratie en incubatietijd zodat Hoechst penetratie nauw was het prolifererende cellen in de buitenste lagen (die grotendeels worden gevonden minderdan 80 urn van de rand) en niet doordringen in de G1 aangehouden area.The incubatietijd met Hoechst worden gevarieerd om diepere of ondiepere penetratie te verkrijgen. Een voorbeeld van variërende Hoechst penetratie in de tijd getoond in figuur 3. Figuur 4A toont een voorbeeld van de gating voor Hoechst hoge en lage populaties, terwijl figuur 4C en D toont de gating voor Fucci rode, gele en groene cellen. Figuur 4B toont de kwantificering van het aantal rode (G1) en groen of geel (S / G2 / M) cellen hetzij in de Hoechst hoge (buitenste cellen) of Hoechst laag (binnenste cellen). Ook deze techniek blijkt dat rode cellen in G1 sterk zijn verrijkt in het binnengebied van de sferoïde (vgl. Gelijkenis met de beeldanalyse figuur 2E).
Figuur1:. C8161 Spheroid image vertegenwoordiger fase contrast genomen op 10x vergroting van een C8161 sferoïde na 3 dagen cultuur op de agar. Schaal bar is gelijk aan 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. C8161 Fucci Sferoïde representatief beeld van een C8161 Fucci Image Analysis spheroïde vibratome doorsnede bij een vergroting van 20x. Sferoïde werd gekweekt gedurende drie dagen op agarose en vervolgens een verdere 24 uur in collageen matrix. Confocale z-schijfje (A) Azami Green, (B) Kusabira Orange2 en (C) Fucci overlay. Schaal bar = 100 micrometer. (D), Rood en Groen object maskers gemaakt in Volocity, met de sferoïde schets in grijs. Arrij geeft 80 micrometer afstand van de bolvormige rand. (E) Kwantificatie van het aantal rode (G1) en groen / geel (S / G2 / M) cellen in de binnenste (> 80 urn van de sferoïde rand) en buitenste (<80 um uit de sferoïde rand) gebieden. Foutbalken vertegenwoordigen de SD van 4 bolvormige gedeelten van 2 onafhankelijke experimenten. (F) Penetratie van 10 uM Hoechst kleurstof na 1,5 uur incubatie. Schaal bar = 100 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3:. C8161 Spheroid Hoechst Dye Diffusion Tijdcurve Representatieve confocale z-slice beelden van midden gehele C8161 sferoïden gekweekt op agarose gedurende 4 dagen en geïncubeerd met 10 pM Hoechst gedurende de aangegeven tijden. Genomen op 10x vergroting. Witte balken geven de geschatte Hoechst penetratie diepte. Merk op dat C8161 agarose bolletjes zijn dichter dan de C8161 sferoïden die zijn geïmplanteerd in collageen voor 24 uur in figuur 2, wat resulteert in minder kleurstof penetratie op hetzelfde tijdstip. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. C8161 Fucci Sferoïde Flow Analysis (A) Voorbeeld van Hoechst hoge en lage gating na incubatie van 20 bolletjes met 10 uM Hoechst. Blauwe lijn geeft de ongekleurde controle, groene lijn geeft een volledig gekleurd Hoechst controle. (B) Kwantificering van het aantal rode en groen / geel cellen in de binnenste (Hoechst laag) en buitenste (Hoechst hoog) populations. Foutbalken vertegenwoordigen de SD van 8 onafhankelijke experimenten (zowel levende sorteer- en vaste celanalyse). Voorbeeld van Fucci venstertijd voor de binnenste (C) en buitenste (D) spheroïde populatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Semi-automatische beeldanalyse geïdentificeerd de bolvormige innerlijke G1 gearresteerd regio en uitdijende buitenste lagen. Deze werkwijze kan worden toegepast voor levende sferoïden behulp van een optische sectie of in vaste bolvormige gedeelten, veranderingen in niet alleen de celcyclus maar merkerexpressie (via immunofluorescentie), celdood of celmorfologie in de verschillende regio's te identificeren. Cel beweeglijkheid binnen de verschillende bolvormige regio kan ook worden gekwantificeerd - als live-confocale time lapse imaging samen met een cell tracking beeldanalyse stap wordt toegevoegd. Cruciaal voor beeldanalyse is dat stukje confocale beelden van uitstekende kwaliteit z- worden verkregen, hogere resolutie beelden laten een betere identificatie van de cellen. Een beperking met beeldanalyse is dat het niet mogelijk is om elke cel kunnen vinden als kernen te dicht, of als er teveel variatie in de rode en groene sterkte. Fucci negatieve cellen (begin G1) niet kunnen worden gevonden met dit beeldanalyse methode, alleen rood (G1),geel (vroege S-fase) en groen (S / G2 / M). Een ander nadeel van de beeldgebaseerde analyse hier beschreven methode is dat er geen rekening gehouden met de volledige 3D aard van de sferoïden. Hoewel de Volocity software 3D-metingen met z-stack afbeeldingen kunnen uitvoeren, confocale microscopie niet kan penetreren en beeld de hele bolvormige vanwege de grote omvang. Multi-foton beeldvorming kan worden gebruikt om een z-stapel geheel sferoïde krijgen voor 3D-metingen 7 omdat deze technologie kunnen doordringen tot 500 urn, hoewel sommige Steroiden nog te groot om het gehele sferoïden via deze methode zijn. Een andere optie voor het afbeelden van de hele bolvormige licht-vel-gebaseerde microscopie, waarbij visualisatie van de bolvormige vanuit verschillende hoeken maakt en doordringt tot 200 urn binnen grote sferoïden 20,21. Keuze van beeldvorming strategie kan worden beïnvloed door de grootte sferoïde, mobiele pakkingsdichtheid en celtype.
De Hoechst kleurstof diffusion werkwijze voor het scheiden binnenste en buitenste cellen in een multicellulair sferoïde via stroomcytometrie werd eerst beschreven in 1982 22. Deze methode gebaseerd op het feit dat de Hoechst kleurstof diffundeert langzaam in de sferoïde, de buitenste cellen eerst worden gekleurd. De hier beschreven protocol combineert Hoechst methode met de Fucci systeem 15, dat niet alleen de scheiding van binnenste en buitenste bolvormige cellen, maar ook visualisatie van Hoechst penetratie mogelijk maakt ten opzichte van de binnenring van G1 aangehouden cellen. Dit maakt nauwkeurige scheiding van de G1 gearresteerde gebied van de sferoïde. Het gebruik Fucci alleen niet de scheiding van de binnenste G1 aangehouden cellen van een sferoïde, aangezien de buitenste prolifererende cellen bevatten ook cellen in G1 toestaan. Een beperking is dat deze methode kan slechts een ruwe scheiding van de bolvormige in twee regio's ("buiten" Hoechst positieve en 'innerlijke' Hoechst negatief). Het voordeel van deze methode boven beeldanalyse, is dat flage cytometry kunnen meerdere merkers worden getest tegelijkertijd en fysieke scheiding van levende cellen voor verder stroomafwaarts analyse zoals gentherapie of eiwitexpressie opnieuw kweken in verschillende omgevingsomstandigheden, drugs of andere analyse.
Het Fucci sferoïde in combinatie met flowcytometrie en beeldanalyse maakt de identificatie van een binnenring van G1 aangehouden cellen rondom de necrotische kern en een buitenlaag van prolifererende cellen. De necrose en G1 arrestatie in het midden van het bolvormige is door gebrek aan zuurstof en voedingsstoffen, en ontwikkelt als sferoïde groeit in omvang. Eerder, wij en anderen hebben aangetoond dat co-lokalisatie van het pimonidazole hypoxie marker met de G1 gearresteerd spheroïde centrum 7,23. We tonen ook aan dat de proliferatie grotendeels plaatsvindt binnen ongeveer 100 um van de rand van de sferoïde. Dit komt overeen met eerdere studies in sferoïden 12,23,24, en ook correleert met de distance van prolifererende cellen uit de dichtstbijzijnde bloedvaten in vivo 25,26.
Een alternatieve werkwijze die kan worden gebruikt om cellen op basis van hun positie in de bolvormige voor flowcytometrie of andere afzonderlijke analyse is sequentiële trypsine 24,27. Bij deze werkwijze opeenvolgend "shells" van de sferoïde worden verwijderd door korte, opeenvolgende perioden incubatie met trypsine bij lage temperaturen. Maar deze methode is het moeilijk de exacte omvang van de buitenmantel (in urn dikte) vergewissen dat verwijderd wordt vergeleken met de Hoechst kleurstof diffusie werkwijze, waarbij de Hoechst penetratie direct kan worden gevisualiseerd en gemeten.
Het scheiden van de "binnenste" en "buitenste" cellen door kleurstofdiffusie en / of beeldanalyse kan worden uitgebreid tot studies van Fucci tumor xenografts in muizen. Voor analyse van de celcyclus in vivo bij aanwezigheid van vaatstelsel moet ook taken in aanmerking, zoals cellen in een tumor kan in staat zijn om zuurstof en voedingsstoffen uit vasculatuur in de centrale gebieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
