Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, *1,4,5, *1,3,5
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney
* These authors contributed equally

Introduction

spheroids תאיים 3D כבר ידוע כמודל גידול במשך עשרות שנים, אולם זה רק לאחרונה כי הם באים בשימוש נפוץ יותר כמודל במבחנה עבור רבים סרטן מוצק. הם משמשים יותר ויותר במסכי גילוי תרופות תפוקה גבוהה כביניים בין מורכב, יקר ובמודלי vivo זמן רב ופשוט, מודל monolayer 2D העלות הנמוך 1-6. מחקרים בתרבות 2D לעתים קרובות אינם יכולים להיות משוכפל in vivo. מודלים אליפטית של סוגים רבים של הסרטן יכולים לחקות את מאפייני הצמיחה, רגישות לסמים, חדירת תרופה, אינטראקציות תא-תא, זמינות מוגבלת של חמצן וחומרים מזינים ופיתוח של נמק שראה in vivo בגידולים מוצקים 6-11. Spheroids לפתח ליבת נמקים, אזור שקט או G1 נעצר מקיף את הליבה, ותאים מתרבים בפריפריה של אליפטית 7. הפיתוח של אזורים אלהעשוי להשתנות בהתאם לצפיפות התא, שיעור ריבוי והגודל של 12 אליפטית. זה כבר שיערו כי ההטרוגניות הסלולרית ראתה בתת-אזורים השונים אלה עשויה לתרום לטיפול בסרטן ההתנגדות 13,14. לכן היכולת לנתח תאים באזורים אלה בנפרד היא קריטית לתגובות סמים גידול הבנה.

מחוון מחזור תא ubiquitination הקרינה המערכת (FUCCI) מבוססת על אדום (Kusabira אורנג '- KO) וירוק (Azami הירוקה - AG) תיוג ניאון של Cdt1 וgeminin, אשר מפורקים בשלבים שונים של מחזור התא 15. כך גרעין תא מופיע אדום בG1, צהוב בתחילת S וירוק ב/ G2 / M שלב S. אנו מתארים כאן שתי שיטות משלימות הן באמצעות FUCCI לזהות מחזור התא, יחד עם השימוש בתוכנות הדמיה או זרימת דיפוזיה צבע cytometry assay כדי לקבוע אם תאים מתגוררים במרכז G1 נעצר או proliferatin החיצוניטבעת G, והמרחק של תאים בודדים מקצה אליפטית. שיטות אלו פותחו בפרסום הקודם שלנו, שבו הראו כי תאים מלנומה באזורי חוסר חמצן במרכז אליפטית או / ובנוכחות של טיפולים ממוקדים יכול להישאר במעצר G1 לפרקי זמן ארוכים, ויכול מחדש הזן את מחזור התא כאשר תנאים נוחים יותר להתעורר 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FUCCI התמרה ותרבית תאים

  1. התמרה FUCCI
    1. צור שורות תאי יציבות להביע FUCCI בונה mKO2-hCdt1 (30-120) וMAG-hGem (1-100) 15 באמצעות שיתוף התמרה lentivirus כפי שתואר בעבר 7.
      הערה: מערכת FUCCI זמינה כעת מסחרי.
    2. צור תת-שיבוטים עם הקרינה בהירה על ידי מיון תא בודד. תאים מיין אחת חיובי עבור שתי AG וKO (צהוב) על ידי תאים מופעלים הקרינה מיון לתוך צלחת 96-היטב כפי שתוארו קודם לכן 7,16.
  2. תרבית תאים מלנומה
    1. תאים מלנומה אנושי תרבות C8161 כפי שתוארו קודם לכן 7,17.

2. גיבוש 3D ספרואיד (כפי שתואר קודם לכן 3,9)

  1. הכנת צלחת agarose
    1. לפזר agarose 1.5% (או אגר אצילי) בפתרון של האנק מלח מאוזן (HBSS) או buffere פוספט 100 מיליליטרמלוח ד (PBS) על ידי רתחה במיקרוגל במשך 3-5 דקות עם מתערבל. ודא agarose נמס לגמרי.
    2. מייד לוותר על פתרון agarose לכל גם 100 μl לצלחת תרבית רקמת 96-גם-תחתית שטוחה בעזרת פיפטה רבת-ערוצית.
      הערה: Agarose עשוי לחזק בטיפים לאחר תקופה קצרה של זמן, כדי להתגבר על בעיה זו טיפים יש לשנות בין לוחות אם עושה צלחת יותר מאחד agarose.
    3. השאר צלחת 96-היטב על משטח שטוח להקשיח agarose במשך שעה לפחות 1.
  2. הכנת תא ושכבה על גבי agarose
    1. לגדל תאים לconfluency כ -80% בבקבוק T75. לשטוף עם 10 מיליליטר של HBSS.
    2. לנתק את התאים באמצעות 1.5 מיליליטר של 0.05% טריפסין / חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) וגלול ב 10 מיליליטר של מדיום רגיל.
    3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer 18 או שיטת ספירה אוטומטית אחרת.
    4. Resuspend תאים לריכוז סופי של 25,000 תאים / מיליליטר בנורמהבינוני אל.
    5. כיסוי בארות agarose עם 200 μl של ההשעיה התא למספר סופי של 5,000 תאים לכל טוב.
    6. צלחות חזור לתרבית תאי החממה (5% CO 2 ו -37 ג) כדי ליצור spheroids על כ 3 ימים.
      הערה: הזמן שלוקח כדי ליצור אליפטית משתנה בין שורות תאים שונות. שורות תאים מסוימים לא יוצרות spheroids שימוש בשיטה זו בכל.
    7. מורפולוגיה אליפטית תמונה עם מיקרוסקופ הפוך באמצעות מטרת 4X וסינון לעומת שלב. שורת תאים שיוצרת הצלחה spheroids יפיק אגרגטים קומפקטיים, בערך כדוריים תא, ולא צריך להיות רק אחד אליפטית בכל טוב.
      הערה: אופציונאלי: ברגע שspheroids יצר, הם יכולים להיות מושתלים לקולגן או מטריצה ​​אחרת לניתוח נוסף של צמיחה ופלישה 3,7,17. כדי להסיר spheroids מקולגן, טיפול עם 500 μl של 2 מ"ג / מיליליטר collagenase על 37 מעלות צלזיוס עד קולגן הוא מומס מספיק לspherOIDs לבוא בחינם לתקשורת (כ -30 דקות). להסיר בעדינות spheroids בעזרת פיפטה 1 מיליליטר.
    8. עבור חתך / הדמיה spheroids התיקון (או מבודד מקולגן או גדל במשך 3-5 ימים בagarose) ב 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין (זהירות: יש להשתמש בפורמלין במנדף) לפחות 2 שעות בטמפרטורת חדר (RT) , או הלילה (O / N) ב 4 מעלות צלזיוס. Spheroids עשוי להיות מאוחסן בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3. ספרואיד חתך vibratome

  1. לפזר 5 גרם של נקודת התכה הנמוכה agarose בשל HBSS 100 מיליליטר בבקבוק זכוכית 500 מיליליטר במיקרוגל. השתמש בהגדרת חום בינונית עם מסתחרר. זהירות: שמור את המכסה רופפת כשרותחים הפתרון כך שניתן לשחרר את הלחץ. השתמש בכפפות חסינות חומות מגן כדי להגן על ידיים מכוויות בעת הטיפול בבקבוק הזכוכית החמה.
  2. חכה עד agarose מתקרר מעט - כך את הבקבוק ניתן נגע בלי לשרוף את הידיים.
  3. יוצקים approximately 2 מיליליטר של agarose לתחתית כוס דלפק קולטר או תבנית פלסטיק דומה. מייד לשאוב אליפטית קבועה (ראה סעיף 2.2.8) בעזרת פיפטה 1 מיליליטר בנפח הקטן ביותר של נוזל אפשרי. להוסיף אליפטית לagarose. כמה spheroids (עד 10) ניתן להוסיף לכל כוס.
  4. מכסה את spheroids עם 2 מיליליטר יותר של agarose. לעשות את זה מהר, כדי למנוע את התקשות agarose לפני השכבה השנייה הוא הוסיפה.
  5. אפשר agarose להקשיח ב RT בחושך במשך לפחות 3 שעות. בכוסות שלב זה עשויה להיות מאוחסן לזמן קצר על 4 מעלות צלזיוס עם 2-3 מיליליטר של HBSS מעולף על מנת למנוע התייבשות.
  6. הסר agarose מהכוס. חתוך את agarose המכיל את spheroids כך שיתאים אל גוש מתכת vibratome, וspheroids קרוב לחלק העליון של agarose. ניתן לראות spheroids כאובייקטים לבנים קטנים בתוך agarose. סופר דבק agarose לבלוק.
  7. מלא את vibratome עם מים מזוקקים והר הבלוק בvibratome. הגדר אתvibratome לחתוך 100 מיקרומטר סעיפים באמצעות מהירות נמוכה (הגדרה 2) ורטט גבוה (הגדרה 8). הגדר את זווית להב חיתוך עד 16 מעלות. הפעל vibratome ב, להדליק את אור vibratome ולחתוך חלקים מהחלק העליון של agarose עד 100 מיקרומטר סעיפי אליפטית נחתכים. הנח סעיפי אליפטית לחתוך לHBSS בצלחת 24 גם.
  8. בחר סעיפי אמצע לניתוח תמונה. חלקי הר בשקופיות על ידי העברה השטוחה סעיף לשקופית באמצעות פינצטה. מלא חבית מזרק 10 מיליליטר עם גריז ואקום; להוסיף קו דק של שומן ואקום מסביב לקצוות של הסעיף כדי למנוע תקשורת ההרכבה מהריצה את הקצוות של השקופית ולעזור לאטום את הסעיף תחת coverslip. מכסה את החלק עם הרכבה בינונית וcoverslip. לאטום קצוות של coverslip עם לק. חנות מחליקה על 4 מעלות צלזיוס לפני ההדמיה.

תמונת Confocal 4. רכישה

  1. קח תמונת Z-פרוסת סעיף אליפטית FUCCI אמצע באמצעות 10Xאו אובייקטיבי 20X כפי שתואר בעבר 7. ודא שאין חפיפה או crosstalk מתרחש בין כתום 2 color Kusabira וAzami הירוק. אם משווה ניתוח תמונה בין חלקי אליפטית מרובים, לשמור על כוח הלייזר והגדרות אחרות באותו בין דגימות.

Assay דיפוזיה Hoechst צבע 5. לזרימת מיון

  1. העבר את spheroids החי (3-5 ימים לאחר זריעת agarose) לצינור 15 מיליליטר. בואו הכבידה spheroids ליישב לתחתית של התחתית. כמה spheroids עלול להיות מוכתם לכל צינור. יש צורך בכ 20 spheroids כדי לקבל מספרים סלולריים מספיקים לcytometry זרימה.
  2. הסר בינוני עודף ולהוסיף 1 מיליליטר של 10 מיקרומטר Hoechst מדוללים במדיום רגיל. דגירה spheroids על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 1 שעה. השתמש מצליף עדין לresuspend spheroids פעם או פעמיים במהלך דגירה.
    הערה: זמן הדגירה יכול להיות מגוון לשנות כמה רחוק צבע Hoechst חודר לתוך spheroids. זה ישתנה בהתאם לגודל אליפטית, צפיפות וקו סלולארי. עבור חלק גדול spheroids / צפוף ייתכנו חדירת צבע מרבי שהיא פחות מ -100%.
  3. שטוף את spheroids בעדינות עם 5 מיליליטר של HBSS באמצעות שיקוע כובד.
    1. אופציונאלי: עבור הדמיה של חדירת צבע: תקן spheroids עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לפחות שעה 2 ב RT או O / N ב 4 ° C. הכן חלקי vibratome, הר בשקופיות ותמונה על confocal כפי שתואר בשלבים 3 ו -4 לעיל.
  4. כדי להכין תאים לcytometry זרימה, trypsinize spheroids עם 1 מיליליטר של 0.05% טריפסין / EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך כ 30 דקות עם מצליף כל 10 דקות כדי לשבור את spheroids בנפרד.
    הערה: Spheroids קשה להיכנס להשעית תא בודדת, תנאים עשויים צריכים להיות מותאמים. כדאיות של C8161 הישן spheroids 4 יום לאחר תהליך זה היא כ -95%.
  5. תאי כתם עם חיות קרובה אינפרא אדום / כתם מת על פי פרוטוקול היצרנים. לשטוף עם HBSS לאחר מכן לתקן עם 1מיליליטר של 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין לכ 30 דקות. תאים עשויים להיות מאוחסנים בHBSS על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים לפני ניתוח תזרים.

6. ניתוח תזרים Cytometry של Hoechst Spheroids FUCCI יטראז

  1. תאים להבטיח לא בכבדות יחד על ידי עובר אותם דרך מסננת תא. Resuspend Hoechst המוכתם spheroids FUCCI בשטיפת קרח קר FACS (PBS עם 5% עגל סרום עוברי) בריכוז של 1-5 x 10 6 תאים / מיליליטר. העבר את 200 μl של מדגם 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון.
  2. הכן את דגימות בקרת צבע אחד הבאה כמתואר ב6.1: תאים מלנומה מוכתם האו"ם; תאים מלנומה חסיד מוכתמים עם מיקרומטר Hoechst 10 עבור שעה 1; Azami הירוק מביע רק תאים מלנומה; וKusabira אורנג להביע רק תאים מלנומה.
    הערה: בקרות צבע יחידה עשויות להיות קבועות בפורמלין ומאוחסנות בFACS לשטוף עם 0.1% נתרן יזיד ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבועות או אפילו חודשים.
  3. השעיות תא בודדות לרוץ oזרימת na cytometry מנתח עם לייזרים מתאימים וצבע אחד / בקרה בלא כתם כמו בעבר תיארה 7,16.
  4. השתמש בתוכנת cytometry מסחרית כגון FlowJo לנתח הפנימי לעומת תאי אליפטית חיצוניים כדלקמן:
    1. להסיר פסולת על ידי gating על אוכלוסיית התאים העיקרית באור קדימה פזורים (FSC) לעומת אור צד פזורים (SSC).
    2. הסר כפילויות על ידי gating על תאים בודדים באמצעות FSC (אזור) לעומת FSC (גובה)
    3. שער לתאי חיים על ידי gating על האוכלוסייה החי / המתה הנמוכה.
    4. הגדר Hoechst תאים גבוהים, מגודר המבוסס על האיתות החיובית מהתאים חסיד מוכתמים בHoechst, כמו תאים "חיצוניים".
    5. להגדיר תאים נמוכים או שליליים Hoechst, מגודר המבוסס על האות מהשליטה מוכתמת האו"ם, כמו תאים "פנימיים".
    6. לאחר gating לאוכלוסיות הפנימיות וחיצוניות, תאים עשויים להיות מגודר נוסף לאדום FUCCI (G1), (S המוקדם) הצהוב, ירוק (S / G2 / M) או (G1 המוקדם) השלילי.
      הערה: Compensation באמצעות פקדי צבע אחד עשוי להידרש להגדיר כראוי האוכלוסיות אדומות, צהובות, ירוקות ושליליות FUCCI.
  5. ברגע שassay כבר מותאם וחדירת Hoechst תוקף באמצעות מיקרוסקופיה confocal, לרוץ תאים ללא תיקון על סדרן תא זרימה כפי שתואר לעיל 7,16 לניתוח נוסף של תת-אוכלוסיות תאים חיים.

ניתוח 7. תמונה של סעיפים FUCCI ספרואיד

  1. למשל תוכנה פתוחה. Volocity, לבחור את התצורה רק Quantitation.
  2. יצירת ספרייה חדשה. לייבא את קובץ תמונת confocal אליפטית FUCCI לתוך התוכנה על ידי גרירת קובץ נתונים הגולמי מconfocal לספרייה. לחלופין, השתמש בפקודת File> Import.
  3. עבור לכרטיסיית המדידות לבנות פרוטוקול ניתוח תמונה. הפרוטוקול נבנה על ידי גרירה ושחרור את הפקודות המתאימות בסדר הנכון כדלקמן בחלון הפרוטוקול.
  4. מצא objרישומם בערוץ הירוק: גרור את הפקודה למצוא החפצים (שנמצאה ב'מציאת ') לתוך חלון הפרוטוקול, בחר את הערוץ הנכון באובייקטים למצוא protocol.Add הפקודה פתוחה (שנמצאה ב'עיבוד'), ואז אובייקטים נוגעים ללב נפרד הפקודה (נמצאה ב'עיבוד '- זה יהיה להפריד תאים). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר (נמצא ב'סינון '- זו לא תכלול אובייקטים בלתי תאיים קטנים).
    הערה: משתנה כמו למצוא חפצי סף, מספר החזרות פתוחות, בגודל של אובייקטים להיות מופרד והגודל של אובייקטים שלא לכלול חייב להיות מותאם באופן ידני עד מסכות האובייקט להתאים את התמונה.
  5. מצא את האובייקטים במסלול האדום: חזור למצוא חפצים כאמור לעיל למסלול האדום. פרוטוקולים ירוקים ואדומים ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בנפרד.
    הערה: בשל גרעינים להיות בG2, גרעינים ירוקים הם לעתים קרובות מעט גדולים יותר.
  6. לאשר אובייקטים מצאו מדויקים: לאשר אדום ואובייקטים ירוקים להתאיםגרעינים אדומים וירוקים בתמונה על-ידי כיבוי ועל הערוצים הירוקים ואדום (באמצעות להסתיר או להציג פקודת הערוץ) תוך הצגת המסכות האדומות וירוקות שנמצאו על ידי הפרוטוקול. אפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב) ניתן להשתמש כדי לשנות את המראה של מסכות האובייקט.
  7. מצא את האובייקטים צהובים (תאי שלב S המוקדם): כדי למצוא תאים צהובים, להוסיף מצטלבים אדום עם התאים ירוקים פקודה (נמצא ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל (<50 מיקרומטר, שנמצאו ב'סינון ') שלא לכלול את כל אובייקטים בלתי תאיים קטנים.
  8. מצא את האובייקטים באופן בלעדי אדומים (תאי שלב G1): כדי למצוא גרעינים באופן בלעדי אדומים, להפחית את התאים הצהובים מהתאים האדומים (שנמצאו ב'שילוב '). תכלול אובייקטים לפי גודל <50 מיקרומטר, (נמצא ב'סינון ') כדי להסיר כל חפצים בלתי תאיים קטנים שנוצרו.
  9. מצא את האובייקטים באופן בלעדי ירוקים (תאי שלב S / G2 / M): חזור למסלול הירוק למצוא באופן בלעדי ירוק.
    לאטה: אם יש עדיין אובייקטים בלתי תאיים שנותרו, פקודת אוכלוסיית מסנן ניתן להוסיף לפרוטוקולים בלעדיים הירוקים או האדומים בלעדיים (שנמצאו ב'סינון ') כדי לשמור רק אובייקטים עם גורם צורה גדול יותר מאשר 0.25. הפעולה זו תסיר את האובייקטים שאינם מעגליים.
  10. מצא את המתווה אליפטית: מצא את המתווה אליפטית באמצעות למצוא חפצי הפקודה (נמצאה ב'מציאת ') עם המסלול הירוק או אדום (לפיה יש יותר תאים מסביב לקצה של אליפטית). סף נמוך בהרבה (שנמצא בלמצוא חפצים משתנה) יצטרך להשתמש בהם כדי למצוא את המתווה אליפטית בהשוואה לתאים בודדים.
    1. השתמש בפקודה קרובה להצטרף לאובייקטים (שנמצאו ב'עיבוד '), ולאחר מכן למלא חורים בחפצים (שנמצאו ב'עיבוד'), ולאחר מכן להשתמש במסנן עדין (שנמצא ב'סינון ') להסיר רעש מאובייקטים. לבסוף, להוציא חפצים לפי גודל כדי להסיר אובייקטים קטנים <30,000 מיקרומטר (תלוי בגודל אליפטית).
      הערה: פרוטוקול זה צריך להיות מותאם באופן ידני עד המתווה אליפטית היא מדויקת. ניתן להשתמש גם בתמונה brightfield - אולם זה הוא בדרך כלל פחות מדויק עם סעיף אליפטית, ופקודת היפוך (שנמצאה ב'שילוב ') צריך להיות בשימוש.
  11. למדוד מרחקים של גרעינים למתווית אליפטית: מרחקים מדוד (שנמצאו ב'בדבר ') מהאוכלוסיות הצהובות, באופן בלעדי ירוקות ואדומות באופן בלעדי מcentroid התא לקצה אליפטית outline.To לדמיין את המרחקים המינימליים, שאמורה להיות מ תא לקצה אליפטית הקרוב, להפעיל מרחקי מופע בכרטיסיית מערכות יחסים באפשרויות משוב (מדידות> אפשרויות משוב> יחסים).
  12. שמור את הפרוטוקול. פרוטוקול זה עשוי להיות מחדש מיושם לתמונות אחרות באמצעות המדידות> שחזור פקודת הפרוטוקול.
  13. ליצור פריט מדידות (מדידות> הפוך פריט מדידה). הנתונים ניתן לנתח באמצעות הניתוחפונקציות.
    1. עבור לכרטיסיית הניתוח בפריט המדידות. לכו לתפריט ניתוח (ניתוח> ניתוח) ולנתח את המרחק המינימאלי מcentroid התא (האדום, ירוק או צהוב) עד לקצה אליפטית, סיכם על ידי ספירה ומאורגנת על ידי אוכלוסייה.
    2. לספור את מספר התאים הנמצאים במרחק מסוים מהקצה ליצור מסנן (ניתוח> סינון). המסנן למרחק מינימאלי באיור 2 מבוסס על חדירת Hoechst (למשל מרחק מינימאלי הוא פחות מ -80 נותן אוכלוסייה "החיצונית"). לחלופין, יצוא נתונים גולמיים לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ישנן מספר שיטות של ייצור spheroids גידול, פרוטוקול זה משתמש בשיטת הגידול שאינו חסיד, שבו תאים בתרבית על אגר או 3,7,9 agarose. איור 1 מציג דוגמא של מלנומה אליפטית C8161 לאחר 3 ימים על אגר. spheroids C8161 יוצר spheroids בגודל רגיל בקוטר של 500-600 מיקרומטר (ממוצע = 565, SD = 19, n = 3) לאחר 3 ימים. שורות תאים מלנומה אחרות שיהוו spheroids כוללות: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (spheroids נוצר עם קו תא זה הוא לא סדיר ופחות צפוף 19).

על מנת להמחיש את מחזור התא של תאים בודדים בתוך מודל אליפטית 3D, תאים מלנומה C8161 היו transduced עם מערכת FUCCI 7,15. בשל גודלו הגדול של spheroids (עד 1 מ"מ בקוטר לאחר 3 ימים על agarose וגידול של 24 שעות בקולגן לC8161), חתך הוא האפשרות הטובה ביותר המאפשר הדמיה תאים במרכז אליפטית. כֹּלspheroids (חי או קבוע) יכול להיות צילם על ידי מיקרוסקופ confocal, לעומת זאת ההדמיה confocal היא רק מסוגל לחדור עד כ 150 מיקרומטר, ולכן ניתן להשיג פרוסת אופטית אמצע אליפטית רק בspheroids עם קוטר קטן יותר מ -300 מיקרומטר. איור 2 א, B ו- C מראה דוגמא של קטע דרך אליפטית C8161 FUCCI. ליבת נמקים, מוקפת בתאי G1 נעצר, עם שיפוע של תאים מתרבים בשכבות החיצוניות ניכרה. כדי לזהות ולכמת תאים המבוססים על מיקומם במעמד אליפטית ומחזור התא, ניתוח תמונה אוטומטי למחצה בוצע. איור 2 ד מציג את המתווה מסכות תא ואליפטית FUCCI, ואיור 2E מראה את כימות של המספרים של אדום (G1) ותאים ירוקים או צהובים (S / G2 / M) או פחות מ -80 מיקרומטר מקצה אליפטית (תאים חיצוניים) או גדול יותר מ -80 מיקרומטר מקצה אליפטית (תאים פנימיים). quantificati זהבתוכניות שתאים אדומים בG1 מועשרים מאוד באזור הפנימי של אליפטית, כצפוי.

על מנת לזהות ולמיין את פוטנציאל תאים המבוססים על מעמדם מחזור התא והעמדה באליפטית, assay דיפוזיה צבע Hoechst בשילוב עם מערכת FUCCI היה בשימוש. דגירה של spheroids השלם עם תוצאות צבע Hoechst בדיפוזיה מוגבלת של הצבע ל השכבות החיצוניות של אליפטית, זה יכול לשמש כדי להפריד תאים חיצוניים חיוביים Hoechst שכבה מHoechst תאי אליפטית פנימיים שליליים באמצעות cytometry זרימה. איור 2F מראה את החדירה של Hoechst עד כ 80 מיקרומטר מקצה אליפטית. מרחק חיוביות Hoechst של 80 מיקרומטר מהקצה היה מתקבל על ידי ניתוח חזותי של חלקים ואופטימיזציה של זמן ריכוז הצבע ודגירת אליפטית כך שחדירת Hoechst מסומנת באופן הדוק תאים מתרבים בשכבות החיצוניות (אשר במידה רבה נמצאים פחותמ -80 מיקרומטר מהקצה), ולא לחדור לG1 נעצר זמן דגירה area.The עם Hoechst עשוי להיות מגוון להשיג חדירה עמוקה יותר או רדודה. דוגמא לחדירה משתנה Hoechst לאורך זמן בהפגין באיור 3. איור 4 א מציג דוגמא של gating לאוכלוסיות גבוהות ונמוכות Hoechst, בעוד איור 4C וD מדגים gating לתאים אדומים, צהובים וירוקים FUCCI. איור 4 מציגה את כימות למספר האדום (G1) ו- (S / G2 / M) תאים ירוקים או צהובים או ב( התאים החיצוניים) הגבוהים Hoechst או (תאים פנימיים) נמוכים Hoechst. שוב טכניקה זו מראה כי תאים אדומים בG1 מועשרים מאוד באזור הפנימי של אליפטית (CF. דמיון לניתוח התמונה באיור 2E).

איור 1
דְמוּת1:. C8161 ספרואיד תמונה לעומת שלב הנציג צולמה בהגדלה 10x של אליפטית C8161 אחרי תרבות 3 ימים על אגר. בר סולם שווה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. ניתוח תמונת C8161 FUCCI ספרואיד תמונת נציג FUCCI C8161 אליפטית vibratome סעיף צולם בהגדלה 20X. אליפטית הייתה בתרבית במשך שלושה ימים על agarose, אז שעות 24 נוספות במטריצת קולגן. Z-פרוסת confocal של () Azami ירוק, (ב) Kusabira כתום 2 color ו- (ג) FUCCI כיסוי. בר סולם = 100 מיקרומטר. מסכות (ד ') אדומות וירוקה אובייקט שנוצרו בVolocity, עם קווי המתאר אליפטית באפור. Arשורה מציינת 80 מיקרומטר מרחק מקצה אליפטית. (ה) כימות המספרים של אדום (G1) ותאים ירוקים / צהובים (S / G2 / M) בתוך הפנימי (> 80 מיקרומטר מקצה אליפטית) וחיצוני (<80 מיקרומטר מקצה אליפטית) האזורים. ברים שגיאה מייצגים את SD מסעיפי 4 אליפטית מ2 ניסויים בלתי תלויים. (F) חדירה של צבע Hoechst 10 מיקרומטר לאחר דגירה של 1.5 שעות. סרגל = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. C8161 ספרואיד Hoechst צבע דיפוזיה כמובן זמן תמונות Z-פרוסת confocal נציג מאמצע כל C8161 spheroids תרבית על agarose במשך 4 ימים וטופחו עם 10 מיקרומטר Hoechst לזמנים מצויינים. צולם בהגדלה 10x. ברים לבנים מצביעים על עומק חדירת Hoechst המשוער. שים לב שspheroids agarose C8161 צפוף יותר מspheroids C8161 שהושתל בקולגן למשך 24 שעות באיור 2, וכתוצאה מכך פחות לצבוע חדירה באותה נקודת הזמן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: דוגמא C8161 FUCCI ספרואיד ניתוח תזרים () של gating הגבוה והנמוך Hoechst לאחר הדגירה של 20 spheroids עם 10 מיקרומטר Hoechst.. קו כחול מציין את השליטה בלא כתם, קו ירוק מציינת שליטה מוכתמת באופן מלא Hoechst. כימות (ב) למספרים של תאים אדומים וירוקים / צהובים בתוך הפנימי (Hoechst הנמוך) ו- p החיצוני (Hoechst הגבוה)opulations. ברים שגיאה מייצגים את SD מ 8 ניסויים בלתי תלויים (כולל שני מיון חי וניתוח תא קבוע). דוגמא של FUCCI gating לפנימי (C) ואוכלוסיות אליפטית חיצוניות (ד '). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח תמונה חצי-אוטומטי זיהה את אזור G1 נעצר הפנימי אליפטית, ומתרבה שכבות חיצוניות. שיטה זו עשויה לשמש בspheroids החי באמצעות סעיף אופטי, או בסעיפים אליפטית קבועים, לזהות שינויים בלא רק מחזור התא אבל ביטוי סמן (באמצעות immunofluorescence), מוות של תאים, או מורפולוגיה של תאים באזורים השונים הללו. תא תנועתיות בתוך אזורי אליפטית שונים יכולות להיות גם לכמת - אם הדמיה לחיות confocal הזמן לשגות יחד עם צעד ניתוח תמונת מעקב תא הוא הוסיפה. קריטי לניתוח תמונה הוא שתמונות confocal פרוסת Z- איכות גבוהה מתקבלות, תמונות ברזולוציה גבוהות יותר מאפשרות זיהוי טוב יותר של תאים. מגבלה אחת עם ניתוח תמונה היא שזה לא אפשרי למצוא כל תא בצורה נכונה אם גרעינים צפופים מדי, או אם יש יותר מדי שונה בעוצמת האדומה וירוקה. תאי FUCCI שליליים (בG1 המוקדם) לא מסוגלים למצוא בשיטת ניתוח תמונה זו, רק אדום (G1),(שלב מוקדם S) צהוב וירוק (S / G2 / M). חסרון אחד אחר של שיטת ניתוח המבוסס על התמונה שתוארה כאן הוא שזה לא לוקח בחשבון את אופי 3D המלא של spheroids. למרות שתוכנת Volocity יכולה לבצע מדידות 3D באמצעות תמונות Z- מחסנית, מיקרוסקופיה confocal אינה מסוגלת לחדור ותמונה דרך כל אליפטית בשל הגודל הגדול. הדמיה רב-פוטון ניתן להשתמש כדי להשיג Z- מחסנית של כל אליפטית למדידות 3D 7 כטכנולוגיה זו מאפשרת חדירה של עד 500 מיקרומטר, למרות שחלקם spheroids עדיין עשוי להיות גדול מדי לspheroids תמונה כולה באמצעות שיטה זו. אפשרות נוספת להדמית כל אליפטית היא מיקרוסקופיה מבוססת אור גיליון, המאפשרת הדמיה של אליפטית מזוויות מרובות וחודר עד 200 מיקרומטר בתוך spheroids הגדול 20,21. בחירה של אסטרטגית הדמיה עשויה להיות מושפעת על ידי גודל אליפטית, צפיפות אריזת תא וסוג התא.

Diffusio הצבע Hoechstשיטת n להפרדת תאים פנימיים וחיצוניים באליפטית תאיים באמצעות cytometry הזרימה תוארה לראשונה בשנת 1982 22. שיטה זו מבוססת על העובדה שצבע Hoechst מפזר באיטיות לתוך אליפטית, עם התאים החיצוניים שמוכתמים ראשון. הפרוטוקול המתואר כאן משלב את שיטת Hoechst עם מערכת FUCCI 15, אשר לא רק מאפשרת הפרדה של תאי אליפטית פנימיים וחיצוניים, אלא גם להדמיה של חדירת Hoechst ביחס לטבעת הפנימית של תאי G1 נעצר. זה מאפשר הפרדה מדויקת של אזור G1 נעצר של אליפטית. באמצעות FUCCI לבד אינו מאפשר הפרדה של התאים נעצרו G1 הפנימי מאליפטית, בהתחשב בעובדה שהתאים מתרבים החיצוניים מכילים גם תאים בG1. מגבלה היא ששיטה זו מאפשרת הפרדה גסה של אליפטית רק לשני אזורים (שלילי "החיצוני" Hoechst חיובי ו" פנימי "Hoechst). היתרון של שיטה זו על פני ניתוח תמונה, הוא f שcytometry הנמוך מאפשר סמנים מרובים להיבדק בפעם אחת, והפרדה פיזית של תאי חיים לניתוח נוסף במורד הזרם, כגון גן או חלבון ביטוי, מחדש culturing בתנאים שונים סביבתיים, טיפולים תרופתיים או ניתוח אחר.

מערכת אליפטית FUCCI בשילוב עם הזרימה cytometry וניתוח תמונה מאפשרת זיהוי של טבעת פנימית של תאי G1 נעצר מקיפים את ליבת נמקים, ושכבה חיצונית של תאים מתרבים. מעצר הנמק וG1 מצא במרכז אליפטית הוא בשל חוסר החמצן וחומרים מזינים, ומתפתח כאליפטית גדלה בגודל. בעבר, אנחנו ואחרים הראינו שיתוף לוקליזציה של סמן היפוקסיה pimonidazole עם מרכז אליפטית G1 נעצר 7,23. אנחנו גם מדגימים התפשטות שמתרחשת בעיקר בתוך כ 100 מיקרומטר מקצה אליפטית. זה תואם מחקרים קודמים בspheroids 12,23,24, וגם בקורלציה עם דistance של תאים מתרבים מכלי הדם הקרובים ביותר in vivo 25,26.

שיטה חלופית שניתן להשתמש בו כדי להפריד בין תאים המבוססים על מיקומם באליפטית לcytometry זרימה או ניתוח אחר היא trypsinization רציף 24,27. בשיטה זו "פצצות" רצופות של אליפטית יוסרו על ידי תקופות קצרות, רציפות דגירה עם טריפסין בטמפרטורות נמוכות. עם זאת שימוש בשיטה זו קשה יותר לדעת מה היה הגודל של המעטפת החיצונית (בעובי מיקרומטר) המדויק שהוסר בהשוואה לשיטת דיפוזיה צבע Hoechst, שבו חדירת Hoechst ניתן דמיין ישירות ונמדדה.

הפרדת התאים "הפנימיים" ו- "חיצוניים" על ידי דיפוזיה צבע ו / או ניתוח תמונה ניתן להרחיב את המחקרים של xenografts גידול FUCCI בעכברים. עם זאת, לניתוח של מחזור תא in vivo, הנוכחות של כלי דם צריכה להיות גם ת"אקן בחשבון, כמו תאים בגידול ייתכן שיוכלו לגשת לחמצן וחומרים מזינים מכלי דם באזורים המרכזיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
agarose low melting point Life Technologies 16520-050 For sectioning
noble agar  Sigma A5431 For making spheroids
agarose for spheroids Fisher Scientific BP1356-100 For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
HBSS Life Technologies 14175-103
10% formalin Sigma HT5014-1CS CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR Life Technologies L10119
vibratome Technical Products International, Inc
coulture cup Thermo-Fisher Scientific SIE936 Mold for sectioning spheroids
hemocytometer Sigma Z359629
96-well tissue culture plate Invitro FAL353072
collagenase Sigma C5138 
confocal microscope Leica TCS SP5
Flow cytometer analyser Becton Dickinson LSRFortessa
volocity PerkinElmer Imaging software
flowjo Tree Star Flow cytometry software
Vaccuum grease Sigma Z273554
Mounting media Vector Laboratories H1000
FUCCI (commercial constructs) Life Technologies P36238 Transient transfection only
Cell strainer 70 μm In Vitro FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile) In Vitro FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) In Vitro FAL352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
  4. Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
  5. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
  8. Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
  9. Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
  10. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  11. Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
  12. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  13. Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
  14. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
  15. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  17. Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
  18. Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
  19. Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
  20. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
  21. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
  22. Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
  23. Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
  24. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
  25. Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
  26. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  27. Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).

Tags

רפואה גיליון 106 מלנומה אליפטית מחזור תא ניתוח תמונה ניתוח תזרים cytometry 3D טיפול בסרטן ביולוגיה של תא הסרטן היפוקסיה תת-אוכלוסיות גידול חתך vibratome רב-תאי.
ניתוח מבוסס Cytometry Imaging- והזרימה של עמדת תא ומחזור התא בSpheroids מלנומה 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, … More

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. J. Vis. Exp. (106), e53486, doi:10.3791/53486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter