Introduction
Sphéroïdes multicellulaires 3D ont été connu comme un modèle de tumeur pendant des décennies, mais il est seulement récemment qu'ils sont venus dans l'usage plus fréquent comme un modèle in vitro pour de nombreux cancers solides. Ils sont de plus en plus utilisés dans les écrans de découverte de médicaments à haut débit comme un intermédiaire entre complexe, coûteux et chronophage de modèles in vivo et le simple, le modèle monocouche faible coût 2D 1-6. Études en culture 2D sont souvent incapables de répliquer in vivo. Modèles sphéroïde nombreux types de cancer sont capables d'imiter les caractéristiques de croissance, la sensibilité de la drogue, la pénétration du médicament, interactions cellule-cellule, la disponibilité restreinte du oxygène et de nutriments et le développement de la nécrose qui est vu dans vivo dans les tumeurs solides 6-11. Sphéroïdes développent un coeur nécrotique, une région de repos ou G1 arrêté entourant le noyau, et les cellules en prolifération, à la périphérie de la sphéroïde 7. Le développement de ces régionspeut varier en fonction de la densité cellulaire, le taux de prolifération et la taille de l'ellipsoïde 12. Il a été émis l'hypothèse que l'hétérogénéité cellulaire vu dans ces différentes sous-régions peut contribuer au cancer résistance au traitement 13,14. Par conséquent, la capacité d'analyser les cellules dans ces régions est cruciale séparément réponse aux médicaments compréhension tumorales.
Le système d'indicateurs du cycle cellulaire par fluorescence d'ubiquitination (FUCCI) est basé sur le rouge (Kusabira Orange - KO) et vert (Azami Vert - AG) marquage fluorescent de CDT1 et Geminin, qui sont dégradés dans les différentes phases du cycle cellulaire 15. Ainsi les noyaux cellulaires apparaissent en rouge dans le G1, jaune au début de S et vert dans S / phase G2 / M. Nous décrivons ici deux méthodes complémentaires à la fois à l'aide FUCCI pour identifier le cycle cellulaire, de même que l'utilisation d'un logiciel d'imagerie ou d'un flux de diffusion de colorant cytométrie essai pour déterminer si les cellules se trouvent dans le centre de la G1 arrêté ou externe proliferating bague, et la distance des cellules individuelles à partir du bord de la sphéroïde. Ces méthodes ont été développées dans notre publication précédente, où nous avons démontré que les cellules de mélanome dans les régions hypoxiques dans le centre du sphéroïde ou / et en présence de thérapies ciblées sont en mesure de rester dans G1 arrestation pendant de longues périodes de temps, et peut re- entrer dans le cycle cellulaire lorsque des conditions plus favorables proviennent 7.
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Protocol
1. FUCCI transduction et culture cellulaire
- FUCCI transduction
- Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) 15 en utilisant la co-transduction lentivirus 7 comme décrit précédemment.
Remarque: Le système FUCCI est maintenant disponible dans le commerce. - Générer sous-clones avec une vive fluorescence par tri seule cellule. Trier simples cellules positives pour les deux AG et KO (jaune) par fluorescence tri cellulaire activé dans une plaque de 96 puits tel que décrit précédemment 7,16.
- Créer des lignées cellulaires exprimant de manière stable le FUCCI construit mKO2-hCdt1 (30-120) et GAM-hGem (1-100) 15 en utilisant la co-transduction lentivirus 7 comme décrit précédemment.
- Culture de cellules de mélanome
- C8161 Culture des cellules de mélanome humain tels que décrits précédemment 7,17.
2. Formation 3D Spheroid (comme décrit précédemment 3,9)
- La préparation des plaques d'agarose
- Dissoudre 1,5% d'agarose (gélose noble ou) dans 100 ml de sel équilibré la solution de Hank (HBSS) ou phosphate Buffèred saline (PBS) par ebullition dans le micro-ondes pendant 3 à 5 min en agitant. Assurez-vous que l'agarose est complètement dissous.
- Répartir immédiatement 100 pi de la solution d'agarose par puits à une plaque de 96 puits de culture de tissu à fond plat avec une pipette multi-canal.
Remarque: Agarose peut se solidifier dans les conseils après une courte période de temps, pour surmonter ce problème conseils doivent être changés entre les plaques se faisant plus d'une plaque d'agarose. - Laissez plaque de 96 puits sur une surface plane à durcir agarose pendant au moins 1 h.
- La préparation des cellules et la superposition sur agarose
- Cultiver les cellules à environ 80% de confluence dans un flacon T75. Laver avec 10 ml de HBSS.
- Détacher les cellules en utilisant 1,5 ml de trypsine à 0,05% d'acide / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et remettre en suspension dans 10 ml de milieu normal.
- Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre 18 ou une autre méthode de comptage automatisé.
- Remettre en suspension les cellules à une concentration finale de 25.000 cellules / ml dans la normemoyen al.
- Superposez puits agarose avec 200 pi de la suspension de cellules pour un nombre final de 5000 cellules par puits.
- Plaques de retour à l'incubateur de culture cellulaire (5% de CO 2 et 37 ° C) pour former des sphéroïdes plus environ 3 jours.
Remarque: Le temps nécessaire pour former un sphéroïde varie entre différentes lignées cellulaires. Certaines lignées cellulaires ne forment pas des sphéroïdes en utilisant cette méthode à tous. - Image en morphologie sphéroïde avec un microscope inversé en utilisant un objectif de 4X et un filtre à contraste de phase. Une lignée de cellules qui forme avec succès sphéroïdes produiront agrégats cellulaires compacts, plus ou moins sphériques, et il devrait y avoir qu'un seul sphéroïde par puits.
Note: Facultatif: Une fois sphéroïdes ont formé, ils peuvent être transplantées dans du collagène ou une autre matrice pour une analyse approfondie de la croissance et de l'invasion 3,7,17. Pour supprimer sphéroïdes à partir de collagène, traiter avec 500 pi de 2 mg / ml de collagénase à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est dissous assez pour le SpherOID à venir librement dans les médias (environ 30 min). Retirez délicatement sphéroïdes utilisant une pipette de 1 ml. - Pour sectionnement / imagerie sphéroïdes fixes (soit isolés à partir de collagène ou cultivées pendant 3-5 jours sur agarose) à 10% du formol tamponné neutre (ATTENTION: formol doit être utilisé dans une sorbonne) pendant au moins 2 heures à la température ambiante (RT) , ou toute la nuit (O / N) à 4 ° C. Sphéroïdes peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours.
3. Spheroid Vibratome sectionnement
- Dissoudre 5 g d'agarose à faible point de fusion dans 100 ml de HBSS dans un flacon en verre de 500 ml dans un four micro-ondes. Utilisez un réglage de feu moyen en remuant. ATTENTION: Gardez le couvercle lâche lors de l'ébullition de la solution ainsi que la pression peut être libérée. Utilisez des gants de protection résistant à la chaleur pour protéger les mains contre les brûlures lors de la manipulation de la bouteille de verre chaud.
- Attendez jusqu'à ce que l'agarose refroidit légèrement - de sorte que la bouteille peut être touché sans brûler les mains.
- Verser approximationron 2 ml d'agarose dans le fond d'un compteur Coulter tasse ou un moule plastique analogue. Aspirer immédiatement un sphéroïde fixe (voir section 2.2.8) en utilisant une pipette de 1 ml dans le plus petit volume de liquide possible. Ajouter à la sphéroïde agarose. Quelques sphéroïdes (jusqu'à 10) peuvent être ajoutés par tasse.
- Couvrir les sphéroïdes avec 2 ml plus d'agarose. Pour ce faire rapidement pour éviter le durcissement agarose avant la deuxième couche est ajouté.
- Laisser la gélose à durcir à température ambiante dans l'obscurité pendant au moins 3 h. A ce point les tasses peuvent être stockés pendant une courte période à 4 ° C avec 2-3 ml de HBSS superposées pour éviter la déshydratation.
- Retirer agarose de la tasse. Coupez le agarose contenant les sphéroïdes afin qu'il tienne sur le bloc de métal vibratome et sphéroïdes sont à proximité du sommet de la gélose. Sphéroïdes peuvent être considérés comme de petits objets blancs à l'intérieur de l'agarose. Super Glue l'agarose au bloc.
- Remplissez le vibratome avec de l'eau distillée et monter le bloc dans la vibratome. Met levibratome pour couper 100 um sections à vitesse lente (réglage 2) et de fortes vibrations (réglage 8). Réglez l'angle de lame de coupe à 16 °. Tournez sur vibratome, allumer la lumière vibratome et couper des sections du haut de l'agarose jusqu'à 100 um sections sphéroïde sont coupés. Placez sections sphéroïde couper en HBSS dans une plaque de 24 puits.
- Choisissez sections intermédiaires pour l'analyse d'image. Sections de montage sur diapositives en transférant la section à plat sur la diapositive à l'aide des pinces. Remplir une seringue de 10 ml baril avec de la graisse à vide; ajoutez une fine ligne de graisse à vide sur les bords de la section afin d'empêcher les médias de montage de courir sur les bords de la diapositive et aider à sceller la section sous la lamelle. Couvrir la section avec un milieu de montage et une lamelle. Sceller les bords de la lamelle avec du vernis à ongles. Magasin glisse à 4 ° C avant l'imagerie.
4. confocale Image Acquisition
- Prenez une image z-tranche d'une section de sphéroïde milieu de FUCCI utilisant un 10Xou un objectif 20X comme décrit précédemment 7. Assurez-vous pas de chevauchement ou de la diaphonie se produit entre les Kusabira Orange2 et Azami vert. Si l'on compare l'analyse d'image entre les sections de sphéroïde multiples, maintenir la puissance du laser et d'autres paramètres de la même entre les échantillons.
5. Hoechst Dye Diffusion Essai de débit Tri
- Transfert sphéroïdes vivants (3-5 jours après l'ensemencement) d'agarose dans un tube de 15 ml. Soit sphéroïdes gravité se déposent au fond du tube. Plusieurs sphéroïdes peuvent être colorées par tube. Environ 20 sphéroïdes sont nécessaires pour obtenir le nombre de cellules suffisant pour cytométrie de flux.
- Retirer moyen excès et ajouter 1 ml de 10 um Hoechst diluées dans le milieu normal. Incuber sphéroïdes à 37 ° C pendant environ 1 heure. Utilisez pichenette douce pour remettre en suspension les sphéroïdes une ou deux fois pendant l'incubation.
Remarque: Le temps d'incubation peut être modifiée pour modifier la façon dont loin le colorant Hoechst pénètre dans les sphéroïdes. Cela varie en fonction dela taille de l'ellipsoïde, de la densité et de la lignée cellulaire. Pour certains grands sphéroïdes denses / il peut y avoir une pénétration de colorant maximale qui est inférieure à 100%. - Laver les sphéroïdes doucement avec 5 ml de HBSS utilisant gravité décantation.
- Facultatif: Pour l'imagerie de la pénétration de colorant: Fix sphéroïdes avec 10% du formol tamponné neutre pendant au moins 2 heures à température ambiante ou O / N à 4 ° C. Préparer vibratome sections, monter sur des lames et de l'image sur le confocale comme décrit dans les étapes 3 et 4 ci-dessus.
- Pour préparer les cellules pour cytométrie de flux, Trypsiniser sphéroïdes avec 1 ml de trypsine à 0,05% / EDTA à 37 ° C pendant environ 30 min avec effleurant toutes les 10 min pour briser les sphéroïdes de l'autre.
Remarque: Sphéroïdes sont difficiles à obtenir en suspension de cellule unique, les conditions peuvent avoir besoin d'être optimisé. Viabilité de C8161 4 jours anciens sphéroïdes après ce processus est d'environ 95%. - Cellules tache avec une tache de vivre proche infrarouge / morts selon le protocole des fabricants. Laver avec de l'HBSS puis fixer avec 1ml de 10% de formaline tamponnée neutre pendant environ 30 min. Les cellules peuvent être stockées dans du HBSS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant l'analyse de flux.
6. cytométrie de flux de Hoechst Stained FUCCI Sphéroïdes
- Assurer cellules ne sont pas agglutinés en les faisant passer à travers un tamis cellulaire. Reprendre le Hoechst tachée sphéroïdes FUCCI dans la glace froide lavage de FACS (PBS avec 5% de sérum de veau foetal) à une concentration de 1-5 x 10 6 cellules / ml. Transférer 200 ul d'échantillon de 5 ml rondes tubes inférieurs.
- Préparer les échantillons uniques de contrôle des couleurs suivantes comme décrit dans 6.1: cellules de mélanome de l'ONU teinté; les cellules de mélanome adhérentes colorées avec 10 uM Hoechst pendant 1 h; Azami Vert exprimant seulement des cellules de mélanome; Kusabira orange et exprimant uniquement des cellules de mélanome.
Remarque: simples contrôles de couleur peuvent être fixés dans du formol et entreposés dans FACS laver avec 0,1% d'azoture de sodium à 4 ° C pendant des semaines, voire des mois. - Suspensions cellulaires seul passage ona cytométrie en flux analyseur avec des lasers appropriés et couleur unique / contrôles non colorées comme décrit précédemment 7,16.
- Utilisez un logiciel de cytométrie commercial comme FlowJo d'analyser l'intérieure vs cellules sphéroïdes extérieures comme suit:
- Enlever les débris gating sur la principale population de cellules dans l'avenir lumière diffusée (FSC) vs. Side lumière diffusée (SSC).
- Retirer doublets par gating des cellules uniques en utilisant FSC (Région) vs. FSC (Hauteur)
- Porte pour les cellules vivantes par fenêtrage morts la population en direct / faible.
- Définir Hoechst cellules élevés, gated sur la base du signal positif à partir des cellules adhérentes colorés avec Hoechst, que les cellules «extérieur».
- Définir Hoechst cellules faibles ou négatifs, gated basé sur le signal de la commande de non souillé, que les cellules «internes».
- Après déclenchement pour les populations intérieures et extérieures, les cellules peuvent en outre être déclenchés pour FUCCI rouge (G1), jaune (début S), vert (S / G2 / M) ou négative (G1 début).
Remarque: CÉMUNÉRATION en utilisant les commandes d'une seule couleur peut être nécessaire de bien définir les populations rouges, jaunes, verts et négatifs FUCCI.
- Une fois que le test a été optimisé et la pénétration Hoechst validé par microscopie confocale, les cellules de fonctionner sans fixer sur un trieur de cellules de flux comme décrit précédemment 7,16 pour une analyse approfondie des sous-populations de cellules vivantes.
Analyse 7. Image FUCCI sphéroïdes Sections
- Ouvrir le logiciel, par exemple. Volocity, choisir la configuration SEULEMENT quantification.
- Créer une nouvelle bibliothèque. Importez le FUCCI sphéroïde fichier image confocale dans le logiciel en faisant glisser le fichier de données brutes du confocale dans la bibliothèque. Sinon, utilisez la commande Fichier> Importer.
- Allez à l'onglet des mesures pour construire un protocole d'analyse d'image. Le Protocole est construit en faisant glisser les commandes appropriées dans le bon ordre comme suit dans la fenêtre de protocole.
- Trouver objECTS dans le canal vert: Faites glisser le trouver des objets commande (trouvé dans "constatation") dans la fenêtre de protocole, sélectionner le canal correct dans les objets de trouvaille protocol.Add une commande d'ouverture (qui se trouve dans le «traitement»), puis un toucher les objets séparés commande (trouvé dans "transformation" - cela va séparer les cellules). Exclure les objets de taille <50 pm (trouvé dans «filtrage» - cela va exclure les petits objets non-cellulaires).
Remarque: Les variables telles que le seuil trouver des objets, ouvertes nombre d'itérations, la taille des objets à séparer et la taille des objets à exclure doit être optimisé manuellement jusqu'à ce que les masques d'objet correspondant à l'image. - Trouvez des objets dans le canal rouge: Répétez trouver des objets comme ci-dessus pour le canal rouge. Peuvent avoir besoin d'être ajustée séparément protocoles verts et rouges.
Remarque: En raison de noyaux étant en G2, noyaux verts sont souvent légèrement plus grande. - Confirmez objets trouvés sont exacts: Confirmation du rouge et objets verts correspondent à lanoyaux rouges et verts dans l'image en éteignant et sur les canaux vert et rouge (en utilisant le masquer ou afficher la commande de canal) tout en affichant les masques rouges et verts trouvés par le protocole. Options de rétroaction (Mesures> options de retour) peuvent être utilisés pour modifier l'apparence des masques d'objets.
- Trouvez des objets jaunes (cellules en phase S précoce): Pour trouver des cellules jaunes, ajouter une intersection rouge avec cellules vertes commande (dans «La combinaison '). Exclure les objets par taille (<50 um, trouvés dans «filtrage») d'exclure les petits objets non-cellulaires.
- Trouvez des objets exclusivement rouges (cellules en phase G1): Pour trouver noyaux exclusivement rouges, soustraire les cellules jaunes de globules rouges (trouvés dans 'La combinaison'). Exclure les objets par taille <50 um, (qui se trouve dans «filtrage») pour enlever tous les petits objets non-cellulaires créées.
- Trouvez des objets exclusivement vertes (cellules en phase S / G2 / M): Répétez l'opération pour le canal vert pour trouver exclusivement verte.
Nonte: Si il ya encore des objets non-cellulaires restants, une commande de la population de filtre peut être ajouté à des protocoles rouges ou verts Exclusif (trouvés dans «filtrage») pour ne retenir que les objets avec un facteur de forme supérieur à 0,25. Cela permettra d'éliminer les objets non-circulaires. - Trouver le contour sphéroïde: Trouver le contour de l'aide d'un sphéroïde trouver des objets commande (trouvé dans "constatation") avec le canal vert ou rouge (selon celui qui a plus de cellules sur le bord du sphéroïde). Un seuil beaucoup plus bas (qui se trouve dans le Trouvez des objets de variables) devra être utilisé pour trouver le contour sphéroïde par rapport à des cellules individuelles.
- Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans ('Traitement'), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans ('Traitement'), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d'objets. Enfin, exclure des objets de la taille d'enlever des objets plus petits <30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde).
Note: Ce protocole devra être optimisée manuellement jusqu'à ce que le contour sphéroïde est exacte. Une image en fond clair peut également être utilisé - mais cela est généralement moins précis avec une section sphéroïde, et une commande Inverser (trouvé dans 'La combinaison') devra être utilisé.
- Utilisez une commande proche de rejoindre objets trouvés dans ('Traitement'), puis remplir les trous dans les objets trouvés dans ('Traitement'), puis utiliser un filtre fin (trouvé dans «filtrage») pour supprimer le bruit à partir d'objets. Enfin, exclure des objets de la taille d'enlever des objets plus petits <30 000 um (en fonction de la taille de sphéroïde).
- Mesurer les distances de noyaux d'esquisser sphéroïde: Mesurer les distances (trouvés dans «relative») des populations jaunes, exclusivement vertes et exclusivement rouges du centre de gravité de la cellule au bord du sphéroïde outline.To visualiser les distances minimales, qui devrait être de la cellule au bord sphéroïde plus proche, activer l'option Afficher les distances dans l'onglet relations dans les options de rétroaction (Mesures> Options> Rapports de rétroaction).
- Enregistrez le protocole. Ce protocole peut être ré-appliquer à d'autres images en utilisant les mesures> Restaurer commande de protocole.
- Créer un élément de mesure (Mesures> Faire Mesure Point). Les données peuvent être analysées en utilisant l'analysefonctions.
- Allez à l'onglet d'analyse par le produit des mesures. Allez dans le menu Analyse (Analyse> Analyser) et d'analyser la distance minimale entre le centre de gravité de la cellule (rouge, vert ou jaune) au bord sphéroïde, résumée par le comte et organisée par la population.
- Pour compter le nombre de cellules qui se trouvent à une certaine distance du bord créer un filtre (Analyse> Filtre). Le filtre de distance minimale à la figure 2 est basé sur la pénétration Hoechst (par exemple, la distance minimale est inférieure à 80 donne la population «externe»). Alternativement, l'exportation des données brutes vers un tableur pour une analyse ultérieure.
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Representative Results
Il existe plusieurs procédés de production de sphéroïdes de tumeur, ce protocole utilise la méthode de croissance non-adhérente, où les cellules sont mises en culture sur de la gélose ou agarose 3,7,9. La figure 1 montre un exemple d'un sphéroïde C8161 de mélanome dans les 3 jours sur de la gélose. Sphéroïdes C8161 forment sphéroïdes de taille régulière avec un diamètre de 500 - 600 um (moyenne = 565, SD = 19, n = 3) après 3 jours. D'autres lignées cellulaires de mélanome qui formeront sphéroïdes comprennent: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205Lu (sphéroïdes formés avec cette lignée cellulaire sont irréguliers et moins dense 19).
Afin de visualiser le cycle cellulaire des cellules individuelles dans le modèle 3D de sphéroïde, des cellules de mélanome ont été transduites C8161 avec le système FUCCI 7,15. En raison de la grande taille des sphéroïdes (jusqu'à 1 mm de diamètre au bout de 3 jours de croissance 24 d'agarose et de collagène dans heures pour C8161), le sectionnement est la meilleure option pour visualiser les cellules dans le centre de l'ellipsoïde. Entiersphéroïdes (vivantes ou fixées) peuvent être imagées par microscopie à foyer commun, cependant le imagerie confocale est seulement capable de pénétrer jusqu'à environ 150 pm, par conséquent, une tranche optique du milieu de la sphéroïde ne peut être obtenue dans des sphéroïdes ayant un diamètre inférieur à 300 um. la figure 2A, B et C représente un exemple d'une coupe d'un sphéroïde FUCCI C8161. Un noyau nécrotique, entouré par les cellules G1 arrêté, avec un gradient de la prolifération des cellules dans les couches externes est évidente. Pour identifier et quantifier les cellules en fonction de leur position dans l'état de la sphéroïde et cycle cellulaire, l'analyse semi-automatique d'image a été réalisée. La figure 2D représente la FUCCI masques cellulaires et sphéroïde contour, et la figure 2E représente la quantification du nombre de rouge (G1) et (S / G2 / M) cellules vertes ou jaunes soit inférieure à 80 um à partir du bord de l'ellipsoïde (cellules extérieures) ou supérieure à 80 um à partir du bord sphéroïde (cellules internes). Cette quantificatimontre que sur les globules rouges dans G1 sont considérablement enrichi dans la région interne de l'ellipsoïde, comme prévu.
Afin d'identifier et potentiellement trier les cellules en fonction de leur statut du cycle cellulaire et de la position dans le sphéroïde, un Hoechst analyse par diffusion de colorant en combinaison avec le système FUCCI a été utilisée. L'incubation des sphéroïdes ensemble avec les résultats de colorant Hoechst dans une diffusion limitée du colorant dans les couches externes de la sphéroïde, ce peuvent être utilisées pour séparer les cellules de la couche externe de Hoechst Hoechst positives cellules sphéroïdes intérieures négatives par cytométrie en flux. La Figure 2F montre la pénétration de Hoechst jusqu'à environ 80 um à partir du bord sphéroïde. La distance de positivité Hoechst de 80 um à partir du bord a été obtenu par l'analyse visuelle de sections sphéroïdes et l'optimisation de la concentration de colorant et le temps d'incubation de sorte que la pénétration Hoechst marqué étroitement les cellules en prolifération dans les couches extérieures (qui sont largement moins trouvéde 80 pm à partir du bord), et ne pas pénétrer dans le G1 arrêtés domaine.Le temps d'incubation avec Hoechst peut être modifiée pour obtenir une pénétration plus ou moins profonde. Un exemple de faire varier la pénétration Hoechst au fil du temps dans le montre la figure 3. La figure 4A montre un exemple de l'ouverture de porte pour Hoechst populations haute et basse, tandis que la figure 4C et D montre le déclenchement de globules rouges, jaunes et vertes FUCCI. La figure 4B montre la quantification pour le nombre de globules rouges (G1) et (S / M / G2) cellules vertes ou jaunes (soit dans les cellules externes) Hoechst élevées ou (cellules internes) faibles Hoechst. Encore une fois cette technique montre que les cellules rouges dans G1 sont fortement enrichis dans la région intérieure du sphéroïde (cf. L'analyse de similarité de l'image de la figure 2E).
Figure1:. C8161 Spheroid image de contraste de phase Représentant prise à un grossissement de 10X d'un sphéroïde C8161 après 3 jours de culture sur gélose. La barre d'échelle est égal à 100 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. C8161 FUCCI Spheroid Analyse d'image de l'image d'un Représentant C8161 FUCCI sphéroïde vibratome section prise à un grossissement de 20x. Sphéroïde a été cultivé pendant trois jours sur agarose, puis un autre 24 heures dans la matrice de collagène. Confocale z-tranche de (A) Vert Azami, (B) Kusabira Orange2 et (C) FUCCI superposition. Barre d'échelle = 100 um. (D) des masques d'objet rouge et vert créés dans Volocity, avec le contour sphéroïde en gris. Arligne indique 80 um distance du bord sphéroïde. (E) La quantification du nombre de rouge (G1) et les cellules vertes / jaunes (S / G2 / M) dans l'intérieur (> 80 um à partir du bord sphéroïde) et externe (<80 pm à partir du bord sphéroïde) régions. Les barres d'erreur représentent la SD de 4 sections sphéroïde de 2 expériences indépendantes. (F) Pénétration de 10 uM colorant Hoechst après 1,5 heures d'incubation. Barre d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Temps Course C8161 Spheroid Hoechst Dye Diffusion confocale Représentant z-tranche images à partir du milieu de l'ensemble C8161 Sphéroïdes cultivées sur agarose pour 4 jours et incubées avec 10 uM Hoechst pendant les temps indiqués. Pris à un grossissement de 10X. Les barres blanches indiquent la profondeur de pénétration d'environ Hoechst. Notez que les sphéroïdes C8161 d'agarose sont plus denses que les sphéroïdes C8161 qui ont été implantés dans le collagène pendant 24 heures à la figure 2, ce qui entraîne moins de colorant pénétration au même point de temps. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4:. C8161 FUCCI Spheroid Analyse des flux (A) Exemple de Hoechst haute et basse de déclenchement après une incubation de 20 sphéroïdes avec 10 uM Hoechst. La ligne bleue indique le témoin non coloré, ligne verte indique un contrôle Hoechst entièrement teinté. (B) Quantification du nombre de globules rouges et vert / jaune à l'intérieur de l'intérieur (Hoechst bas) et extérieure (Hoechst élevé) populations. Les barres d'erreur représentent la SD de 8 expériences indépendantes (y compris à la fois le tri en direct et l'analyse cellulaire fixe). Exemple de FUCCI gating pour l'intérieur (C) et (D) les populations de sphéroïde extérieures. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Semi-automatisé d'analyse d'image identifié la région intérieure sphéroïde G1 arrêté, et la prolifération des couches externes. Ce procédé peut être utilisé sur des sphéroïdes sous tension au moyen d'un article optique, ou dans des sections de sphéroïdes fixes, afin d'identifier des changements dans non seulement du cycle cellulaire, mais l'expression du marqueur (par immunofluorescence), la mort cellulaire, ou la morphologie des cellules dans les différentes régions. Motilité cellulaire dans les différentes régions de la sphéroïde peut également être quantifiée - si confocale time lapse imagerie en temps réel avec un suivi de la cellule d'analyse d'image étape est ajoutée. Critique à l'analyse d'image est cette tranche images confocales de haute qualité sont obtenus, des images haute résolution permettent une meilleure identification des cellules. Une limitation de l'analyse d'image est qu'il ne soit pas possible de trouver toutes les cellules correctement si les noyaux sont trop denses, ou si il ya trop de variation de l'intensité rouge et vert. Cellules négatives FUCCI (en début G1) ne sont pas en mesure d'être trouvé avec cette image méthode d'analyse, seul le rouge (G1),jaune (phase S précoce) et vert (S / G2 / M). Un autre inconvénient de la méthode d'analyse basée sur l'image décrit ici est qu'il ne tient pas compte de la nature 3D complète des sphéroïdes. Bien que le logiciel de Volocity peut effectuer des mesures en utilisant des images 3D z-stack, microscopie confocale est incapable de pénétrer à travers l'image et l'ensemble du sphéroïde en raison de la grande taille. L'imagerie multi-photons peut être utilisée pour obtenir un empilement de z-ensemble pour un sphéroïde mesures 3D 7 comme cette technologie permet une pénétration allant jusqu'à 500 um, bien que des sphéroïdes peuvent être encore trop importante pour toute l'image sphéroïdes par cette méthode. Une autre option pour l'imagerie de l'ensemble sphéroïde est la microscopie base de lumière-feuille, qui permet la visualisation du sphéroïde des angles multiples et pénètre jusqu'à 200 um intérieur de grands sphéroïdes 20,21. Choix de la stratégie de formation d'image peut être influencée par la taille de l'ellipsoïde, densité de tassement de la cellule et du type de cellule.
Le colorant Hoechst diffusion procédé pour séparer des cellules intérieures et extérieures en un sphéroïde multicellulaire par cytométrie de flux a été décrite la première fois en 1982 22. Cette méthode est basée sur le fait que le colorant Hoechst diffuse lentement dans le sphéroïde, avec les cellules extérieures étant colorées premier. Le protocole décrit ici combine le procédé Hoechst FUCCI avec le système 15, ce qui permet non seulement la séparation des cellules sphéroïdes intérieur et extérieur, mais aussi la visualisation de Hoechst pénétration par rapport à l'anneau intérieur de cellules G1 arrêté. Ceci permet une séparation précise de la région G1 arrêté du sphéroïde. Utilisation FUCCI seule ne permet pas la séparation des cellules G1 intérieure arrêtés d'un sphéroïde, étant donné que les cellules proliférantes externes contiennent aussi des cellules en G1. Une limitation est que cette méthode ne permet qu'une séparation brute du sphéroïde en deux régions (positif et négatif "extérieur" Hoechst "intérieure" Hoechst). L'avantage de cette méthode sur l'analyse d'image, est que ffaible cytométrie permet à plusieurs marqueurs à tester à la fois, et la séparation physique des cellules vivantes pour une analyse plus poussée en aval tels que gène ou expression de la protéine, re-culture dans différentes conditions environnementales, les traitements médicamenteux ou autre analyse.
Le système de sphéroïde FUCCI en combinaison avec la cytométrie en flux et l'analyse de l'image permet l'identification d'un anneau intérieur de cellules G1 arrêté entourant le noyau nécrotique, et une couche externe de cellules proliférantes. La nécrose et G1 arrestation trouve dans le centre du sphéroïde est due au manque d'oxygène et de nutriments, et se développe comme le sphéroïde croît en taille. Auparavant, nous et d'autres avons montré la co-localisation du marqueur de l'hypoxie pimonidazole avec le G1 arrêté du centre du sphéroïde 7,23. Nous démontrons aussi que la prolifération se produit en grande partie dans environ 100 um à partir du bord de la sphéroïde. Cela correspond à des études antérieures dans sphéroïdes 12,23,24, et également en corrélation avec la distance de la prolifération des cellules du système vasculaire plus proche in vivo 25,26.
Un autre procédé qui peut être utilisé pour séparer les cellules en fonction de leur position dans le sphéroïde de cytométrie de flux ou d'un autre traitement à la trypsine est une analyse séquentielle 24,27. Dans ce procédé «coquilles» successifs de l'ellipsoïde sont éliminés par courtes périodes d'incubation séquentielle avec de la trypsine à des températures basses. Cependant, l'utilisation de cette méthode, il est plus difficile de déterminer la taille exacte de l'enveloppe extérieure (épaisseur en pm) qui est enlevée par rapport à la méthode par diffusion de colorant Hoechst, où la pénétration Hoechst peut être directement visualisée et mesurée.
La séparation des cellules «intérieur» et «extérieur» par diffusion de colorant et / ou l'analyse d'image peut être étendue à des études de xénogreffes tumorales chez la souris FUCCI. Cependant, pour l'analyse du cycle cellulaire in vivo, la présence de la vascularisation doit également être taken en compte, comme les cellules d'une tumeur peuvent être en mesure d'accéder à de l'oxygène et les nutriments du système vasculaire dans les régions centrales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
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