Introduction
Flercellet 3D-kuler har vært kjent som et tumormodell i flere tiår, men det er bare nylig at de er kommet inn i mer vanlig bruk som en in vitro modell for mange faste cancere. De blir i økende grad brukt i high-throughput legemiddel skjermer som et mellomledd mellom komplisert, dyrt og tidkrevende in vivo-modeller og enkel, rimelig 2D enkeltlag modell 1-6. Studier i 2D kultur er ofte ikke i stand til å bli replikert in vivo. Sfæroide modeller av mange typer av cancer er i stand til å etterligne vekstegenskaper, medikamentsensitivitet, medikamentpenetrering, celle-celle-interaksjoner, begrenset tilgjengelighet av oksygen og næringsstoffer, og utvikling av nekrose som sees in vivo i faste tumorer 6-11. Sfæroider utvikle en nekrotisk kjerne, en stillestående eller G1 arrestert region som omgir kjernen, og prolifererende celler i periferien av den sfæroide 7. Utviklingen av disse regionenekan variere avhengig av celletetthet, proliferasjon hastighet og størrelsen av den sfæroide 12. Det er blitt antatt at den cellulære heterogenitet sett i disse forskjellige sub-regioner kan bidra til cancerterapi motstand 13,14. Derfor er evnen til å analysere cellene i disse regionene er separat avgjørende for forståelsen tumormedikamentresponser.
Fluorescensen ubiquitinering cellesyklus-indikator (FUCCI) Systemet er basert på den røde (Kusabira Orange - KO) og grønn (Azami Green - AG) fluorescerende merking av Cdt1 og geminin, som er nedbrutt i ulike faser av cellesyklusen 15. Dermed cellekjerner blir røde på G1, gult tidlig i S og grønt i S / G2 / M-fasen. Vi beskriver her to komplementære metoder både ved hjelp FUCCI for å identifisere cellesyklus, sammen med bruk av bilde programvare eller et fargestoff diffusjon strømningscytometri-analyse for å bestemme hvorvidt celler ligge i G1 arrestert senteret eller den ytre proliferating ringen, og avstanden av individuelle celler fra kanten av den sfæroide. Disse fremgangsmåter ble utviklet i vårt tidligere publikasjon, hvor Vi viste at melanomceller i hypoksiske områder i sentrum av den sfæroide eller / og i nærvær av målrettede terapier er i stand til å forbli i G1 arrest i lengre perioder, og kan re- gå inn i cellesyklusen når mer gunstige forhold oppstår 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. FUCCI Transduksjon og Cell Culture
- FUCCI transduksjon
- Lag cellelinjer stabilt uttrykker den FUCCI konstruerer mKO2-hCdt1 (30-120) og MAG-hGem (1-100) 15 bruker lentivirus co-transduksjon som tidligere beskrevet 7.
Merk: FUCCI Systemet er nå kommersielt tilgjengelig. - Generere sub-kloner med lyse fluorescens av encellede sortering. Sort enkle celler som var positive for både AG og KO (gul) ved fluorescensaktivert cellesortering inn i en 96-brønns plate som tidligere beskrevet 7,16.
- Lag cellelinjer stabilt uttrykker den FUCCI konstruerer mKO2-hCdt1 (30-120) og MAG-hGem (1-100) 15 bruker lentivirus co-transduksjon som tidligere beskrevet 7.
- Melanom cellekultur
- Culture C8161 humane melanomceller som tidligere beskrevet 7,17.
2. 3D spheroid Formation (som tidligere beskrevet 3,9)
- Agarose plate forberedelse
- Oppløs 1,5% agarose (eller edel agar) i 100 ml Hanks balanserte saltløsning (HBSS) eller fosfat Buffered saltvann (PBS) ved koking i mikrobølgeovn i 3-5 min under omvirvling. Pass på at agarose er helt oppløst.
- Umiddelbart dispensere 100 ul av den agarose løsning per brønn i en flatbunnet 96-brønns vevskulturplate ved hjelp av en flerkanals pipette.
Merk: Agarose kan størkne i spissene etter en kort periode av tid, for å overvinne dette problemet tips må endres mellom platene hvis tjene mer enn en agarose-plate. - La 96-brønns plate på et flatt underlag for å herde agarose i minst 1 time.
- Cell forberedelse og overlay på agarose
- Dyrke celler til omtrent 80% sammenflytning i en T75-kolbe. Vask med 10 ml HBSS.
- Løsne cellene ved hjelp av 1,5 ml av 0,05% trypsin / etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og resuspendert i 10 ml normal medium.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer 18 eller andre automatiserte tellemetoden.
- Suspender cellene til en endelig konsentrasjon på 25.000 celler / ml i normal medium.
- Overlappe agarose brønner med 200 ul av cellesuspensjonen for et endelig antall på 5000 celler per brønn.
- Retur platene til cellekulturinkubator (5% CO2 og 37 ° C) for å danne kuler i løpet av ca. 3 dager.
Merk: Den tid det tar å danne en sfæroide varierer mellom ulike cellelinjer. Noen cellelinjer som ikke danner kuler ved hjelp av denne fremgangsmåten i det hele tatt. - Bilde sfæroid morfologi med et invertert mikroskop ved hjelp av en 4x objektiv og et fasekontrast-filter. En cellelinje som på en vellykket danner kuler vil produsere kompakte, omtrent kuleformede celleaggregater, og det bør være bare en sfæroide per brønn.
Merk: Valgfritt: Når kulene er dannet, kan de bli transplantert inn kollagen eller annen matrise for videre analyse av vekst og invasjon 3,7,17. For å fjerne kuler fra kollagen, behandles med 500 ul av 2 mg / ml kollagenase ved 37 ° C inntil den er oppløst kollagen nok for spherOIDer som kommer gratis inn i media (ca. 30 min). Fjern forsiktig kuler ved bruk av en 1 ml pipette. - For snitting / avbildning fix kuler (enten isolert fra kollagen og dyrket i 3-5 dager på agarose) i 10% nøytral buffret formalin (FORSIKTIG: Formalin skal brukes i et avtrekksskap) i minst to timer ved romtemperatur (RT) , eller over natten (O / N) ved 4 ° C. Sfæroider kan lagres i HBSS ved 4 ° C i flere dager.
3. spheroid Vibratome Seksjonering
- Oppløs 5 g av lavt smeltepunkt agarose i 100 ml HBSS i en 500 ml glassflaske i en mikrobølgeovn. Bruk middels varme omgivelser med virvlende. FORSIKTIG: Hold lokket løs når kokende løsningen slik at trykket kan frigis. Bruk vernevarmebestandig hansker for å beskytte hendene fra forbrenning når du håndterer varme glassflaske.
- Vent til agarose kjøler litt - så flasken kan bli berørt uten å brenne hendene.
- Hell den tilnærmettely 2 ml agarose inn i bunnen av en Coulter-teller kopp eller lignende plaststøpeformen. Straks aspirere en fast sfæroide (se avsnitt 2.2.8) ved anvendelse av en 1 ml pipette i det minste væskevolum mulig. Legg spheroid til agarose. Et par kuler (opptil 10) kan tilsettes per kopp.
- Dekk kulene med 2 ml mer av agarose. Gjøre dette raskt for å unngå agarose herding før det annet lag tilsettes.
- La agarose for å herde ved romtemperatur i mørket i minst 3 timer. Ved dette punkt kopper kan lagres i en kort tid ved 4 ° C med 2-3 ml HBSS kledde å forhindre dehydrering.
- Fjern agarose fra koppen. Trimme agarose inneholder kuler slik at den passer på vibratome metallblokk, og kuler er nær toppen av agarose. Spheroids kan sees som små hvite objekter inne i agarose. Superlim agarosen til blokken.
- Fyll vibratome med destillert vann og montere blokk i vibratome. Settvibratome å kutte 100 mikrometer delene med lav hastighet (innstilling 2) og høy vibrasjon (innstilling 8). Sett skjærebladet vinkelen til 16 °. Slå vibratome på, slå på vibratome lys og kutte seksjoner fra toppen av agarose inntil 100 mikrometer sfæroide seksjoner er kuttet. Plasser kutt sfæroide seksjoner i HBSS i en 24-brønns plate.
- Velg midtre deler for bildeanalyse. Mount seksjoner på lysbilder ved å overføre den delen flatt på lysbildet bruker pinsett. Fyll en 10 ml sprøyte fat med vakuum fett; legge en tynn linje med vakuumfett rundt kantene av delen for å hindre at festematerialet fra å kjøre av kantene av sleiden og forsegle delen under dekkglass. Dekk seksjon med monteringsmedium og et dekkglass. Forsegle kantene av dekkglass med neglelakk. Oppbevares lysbilder ved 4 ° C før bildebehandling.
4. Confocal Image Acquisition
- Ta en z-slice bilde av en middel FUCCI spheroid seksjonen ved hjelp av en 10Xeller 20X objektiv som tidligere beskrevet 7. Pass på at ingen overlapping eller crosstalk oppstår mellom Kusabira Orange2 og Azami Green. Hvis man sammenligner bildeanalyse mellom flere sfæroide seksjoner, holde laser makt og andre innstillinger samme mellom prøvene.
5. Hoechst Dye Diffusion analyse for Flow Sorting
- Overføre levende kuler (3-5 dager etter agarose seeding) til en 15 ml tube. La kuler tyngdekraften faller til bunnen av røret. Flere kuler kan være farget per rør. Omtrent 20 kuler er nødvendig for å oppnå tilstrekkelig celletallene for strømningscytometri.
- Fjern overflødig medium og tilsett 1 ml 10 mm Hoechst utvannet i normal medium. Inkuber sfæroider ved 37 ° C i ca. 1 time. Bruk milde flicking å resuspendere kulene én eller to ganger i løpet av inkubasjon.
Merk: Inkubasjonstiden kan varieres for å forandre hvor langt Hoechst fargestoff trenger inn i kulene. Dette vil variere basert påden sfæroide størrelse, tetthet og cellelinje. For noen store / tette kuler, kan det være en maksimal penetrering fargestoff som er mindre enn 100%. - Vask kulene forsiktig med 5 ml HBSS bruker gravitasjon settling.
- Valgfritt: For avbildning av fargestoffgjennomtrengning: Fix kuler med 10% nøytral bufret formalin i minst to timer ved romtemperatur eller O / N ved 4 ° C. Forbered vibratome seksjoner, montere på lysbilder og bilde på konfokale som beskrevet i trinn 3 og 4 ovenfor.
- For å fremstille celler for flowcytometri, trypsineres sfæroider med 1 ml av 0,05% trypsin / EDTA ved 37 ° C i ca. 30 minutter med smekke hvert 10 min for å bryte kulene fra hverandre.
Merk: Spheroids er vanskelig å komme inn i én enkelt celle suspensjon kan betingelser må være optimalisert. Levedyktighet C8161 fire dager gamle kuler etter denne prosessen er ca 95%. - Flekk-celler med et nær-infrarødt levende / døde flekk i henhold til produsentens protokoll. Vask med HBSS deretter fikse med enml av 10% nøytral bufret formalin i ca. 30 min. Celler kan lagres i HBSS ved 4 ° C i flere dager før strømningsanalyse.
6. flowcytometrisystemer Analyse av Hoechst Stained FUCCI Spheroids
- Sikrer celler er ikke klumpet seg sammen ved å føre dem gjennom et cellefilter. Resuspender Hoechst farget FUCCI sfæroider i iskald FACS vask (PBS med 5% føtalt kalveserum) i en konsentrasjon på 1-5 x 10 6 celler / ml. Overfør 200 ul av prøven til 5 ml rundbunnede rør.
- Forbered følgende enkle fargekontrollprøver som beskrevet i 6.1: un-farget melanomceller; heftmelanomceller farget med 10 mm Hoechst for 1 time; Azami Grønn bare uttrykke melanomceller; og Kusabira Orange bare uttrykke melanomceller.
Merk: Enkeltfargekontroller kan festes i formalin og lagret i FACS vaske med 0,1% natriumazid ved 4 ° C i flere uker eller måneder. - Kjør enkeltcellesuspensjoner ona flowcytometri analysator med passende lasere og én farge / ufargede kontroller som tidligere beskrevet 7,16.
- Bruk kommersiell cytometry programvare som FlowJo å analysere indre vs. ytre sfæroide celler som følger:
- Fjern rester av gating på hovedcellepopulasjon i Forward spredt lys (FSC) vs. Side spredt lys (SSC).
- Fjern dubletter av gating på enkeltceller ved hjelp av FSC (Area) vs. FSC (Høyde)
- Gate for levende celler ved gating på live / dead lav befolkning.
- Definere Hoechst høye celler, gated basert på den positive signal fra de adherente celler farget med Hoechst, som "ytre" celler.
- Definer Hoechst lave eller negative celler, gated basert på signalet fra den ikke-beiset kontroll, som "indre" celler.
- Etter gating for de indre og ytre populasjoner, kan cellene bli ytterligere gated for FUCCI rødt (G1), gul (tidlig S), grønn (S / G2 / M) eller negativ (tidlig G1).
Merk: Compensation hjelp av enkle fargekontrollene kan være nødvendig å riktig definere FUCCI røde, gule, grønne og negative populasjoner.
- Når analysen er optimalisert og Hoechst penetrasjon validert via konfokalmikroskopi, kjøre celler uten å rette på en flyt celle sorter som tidligere beskrevet 7,16 for videre analyse av levende celle undergrupper.
7. Image Analysis of FUCCI spheroid Seksjoner
- Åpen programvare f.eks. Volocity, velger KUN Kvantitering konfigurasjon.
- Opprette et nytt bibliotek. Importere FUCCI spheroid konfokale bildefil inn i programvaren ved å dra rå datafil fra konfokale inn i biblioteket. Alternativt kan du bruke kommandoen File> Import.
- Gå til kategorien målinger for å bygge en bildeanalyse protokollen. Protokollen er bygget ved å dra og slippe de riktige kommandoene i riktig rekkefølge slik i protokollen vinduet.
- Finn objstp i den grønne kanalen: Dra finne gjenstander kommando (finnes i "Finding ') inn i protokollen vinduet velger riktig kanal i finne gjenstander protocol.Add et åpent kommando (finnes i« jobber »), deretter en separat rørende objekter kommando (finnes i «jobber» - dette vil skille celler). Ekskluder objekter ved størrelse <50 mikrometer (finnes i 'filtrering' - dette vil utelukke små ikke-cellulære objekter).
Merk: Variabler slik som den finner gjenstander terskel, antall åpne iterasjoner, til størrelsen av objekter skal separeres og størrelsen på gjenstandene for å utelukke må manuelt optimaliseres før objektet maskene stemmer overens med bildet. - Finn objekter i den røde kanalen: Gjenta finne gjenstander som ovenfor for den røde kanalen. Grønne og røde protokoller må kanskje justeres separat.
Merk: På grunn kjerner være i G2, grønne kjerner er ofte litt større. - Bekreft funnet gjenstander er nøyaktig Bekreft røde og grønne gjenstander matcherøde og grønne kjerner i bildet ved å slå av og på de grønne og røde kanaler (ved å skjule eller vise kommandokanal) mens du viser de røde og grønne masker funnet av protokollen. Tilbakemelding alternativer (Målinger> Tilbakemelding opsjoner) kan brukes til å endre utseendet på objektet masker.
- Finn gule objekter (tidlig S fase celler): For å finne gule celler, legge til et kryss rød med grønne celler kommando (finnes i "Kombinere '). Ekskluder objekter ved størrelse (<50 mikrometer, som finnes i 'filtrering') for å utelukke eventuelle små ikke-cellulære stedene.
- Finn utelukkende røde objekter (G1 fase celler): For å finne utelukkende røde kjerner, trekke den gule celler fra de røde blodcellene (som finnes i 'Kombinere'). Ekskluder objekter etter størrelse <50 um, (finnes i 'filtrering') for å fjerne små ikke-cellulære objekter som er opprettet.
- Finn utelukkende grønne objekter (S / G2 / M-fase celler): Gjenta for den grønne kanalen å finne utelukkende grønt.
Neite: Hvis det fremdeles ikke-cellulære gjenstander gjenværende, en kommando filter befolkning kan legges til den eksklusive grønne eller Eksklusive røde protokoller (som finnes i 'filtrering') for å beholde bare objekter med en formfaktor som er større enn 0,25. Dette vil fjerne ikke-sirkulære stedene. - Finn den spheroid disposisjon: Finn spheroid omrisset ved hjelp av en finne gjenstander kommando (finnes i "Finding ') med den grønne eller røde kanalen (det som har flere celler rundt kanten av spheroid). En mye lavere terskel (finnes i finne gjenstander variabler) må brukes til å finne den spheroid disposisjon i forhold til individuelle celler.
- Bruk en nær kommando for å bli med objekter (som finnes i «jobber»), deretter fylle hullene i objekter (som finnes i «jobber»), deretter bruke en fin filter (finnes i 'filtrering') for å fjerne støy fra stedene. Til slutt utelukker gjenstander etter størrelse for å fjerne mindre objekter <30 000 mikrometer (avhengig av den sfæroide størrelse).
Notat: Denne protokollen må være optimalisert manuelt till spheroid omrisset er korrekt. En lysfelt bilde kan også anvendes - men dette er vanligvis mindre nøyaktig med en sfæroide seksjon, og en invertert kommando (funnet i "kombinere") trenger å bli brukt.
- Bruk en nær kommando for å bli med objekter (som finnes i «jobber»), deretter fylle hullene i objekter (som finnes i «jobber»), deretter bruke en fin filter (finnes i 'filtrering') for å fjerne støy fra stedene. Til slutt utelukker gjenstander etter størrelse for å fjerne mindre objekter <30 000 mikrometer (avhengig av den sfæroide størrelse).
- Måle avstander av atomkjerner til spheroid disposisjon: Mål avstander (som finnes i 'tilknytning') fra de gule, utelukkende grønne og utelukkende røde populasjoner fra cellen Tyngdepunktet til kanten av spheroid outline.To visualminsteavstander, som skal være fra celle til nærmeste spheroid kanten, slå på viser avstander i forhold fanen i tilbakemeldings alternativer (Målinger> Tilbakemelding valg> Relasjoner).
- Lagre protokollen. Denne protokollen kan bli brukt igjen til andre bilder ved hjelp av målinger> Gjenopprett protokollen kommando.
- Lag en målinger element (Målinger> Gjør Måling Element). Data kan bli analysert ved å bruke analysenfunksjoner.
- Gå til kategorien analyse i målinger elementet. Gå til Analyse-menyen (Analyse> Analyser) og analysere minsteavstand fra cellen Tyngdepunktet (rød, grønn eller gul) til spheroid kanten, oppsummert av telling og organisert av befolkningen.
- Å telle antall celler som finnes i en viss avstand fra kanten opprette et filter (Analysis> Filter). Filteret for minste avstand på figur 2 er basert på Hoechst penetrasjon (f.eks minsteavstanden er mindre enn 80 gir den "ytre" populasjon). Alternativt eksport rådata til et regneark for videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det finnes flere metoder for fremstilling av tumor sfæroider, denne protokollen bruker den ikke-heftende vekstmetode, hvor cellene er dyrket på agar eller agarose 3,7,9. Figur 1 viser et eksempel på et C8161 melanom sfæroide etter 3 dager på agar. C8161 kuler danner vanlig størrelse kuler med en diameter på 500 - 600 mikrometer (gjennomsnitt = 565, SD = 19, n = 3) etter 3 døgn. Andre melanoma cellelinjer som vil danne kuler inkluderer: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (sfæroidene dannet med denne cellelinjen er uregelmessige og mindre tett 19).
For å visualisere cellesyklus av individuelle celler i 3D-modellen sfæroide, ble C8161 melanomaceller transdusert med FUCCI system 7,15. På grunn av den store størrelsen på kulene (opp til 1 mm i diameter etter 3 dager på agarose og 24 timers vekst i kollagen for C8161), er snitte det beste alternativet for å visualisere cellene i midten av den sfæroide. Helsfæroider (levende eller faste) kan bli avbildet ved konfokal mikroskopi, men det konfokale avbildnings er bare i stand til å trenge opp til omtrent 150 mikrometer, er derfor en midtre optisk stykke av den sfæroide kan bare oppnås i kuler med en diameter mindre enn 300 um. Figur 2A, B og C viser et eksempel på et snitt gjennom en C8161 FUCCI sfæroide. En nekrotisk kjerne, omgitt av G1 stansede celler, med en gradient av prolifererende celler i de ytre sjikt er tydelig. Å identifisere og kvantifisere celler basert på deres posisjon i spheroid og cellesyklus status, ble semi-automatisert bildeanalyse utført. Figur 2D viser FUCCI celle masker og spheroid disposisjon, og figur 2E viser tallfesting av antall røde (G1) og grønn eller gul (S / G2 / M-celler) enten mindre enn 80 um fra kanten av den sfæroide (ytre cellene) eller større enn 80 um fra den sfæroide kanten (indre cellene). Dette quantificatipå viser at røde celler i G1 er sterkt anriket i det indre området av den sfæroide, som forventet.
For å identifisere og eventuelt sortere celler basert på deres cellesyklusstatus og posisjon i den sfæroide, ble en Hoechst fargestoff diffusjon analyse i kombinasjon med FUCCI system som benyttes. Inkubering av hele kuler med Hoechst fargestoff resulterer i en begrenset diffusjon av fargestoffet i de ytre lag av den sfæroide, kan dette brukes til å separere Hoechst positive ytre lag celler fra Hoechst negative indre sfæroide celler via flowcytometri. Figur 2F viser inntrengning av Hoechst opp til ca 80 um fra den sfæroide kant. Hoechst positivitet avstand på 80 mikrometer fra kanten ble oppnådd ved visuell analyse av sfæroide seksjoner og optimalisering av fargestoff konsentrasjonen og inkubasjonstid, slik at Hoechst penetrasjon tett merket prolifererende celler i de ytre lag (som i hovedsak funnet mindreenn 80 um fra kanten), og ikke trenge inn i G1 arrestert area.The inkubasjonstid med Hoechst kan varieres for å oppnå dypere eller grunnere penetrasjon. Et eksempel på varierende Hoechst trengning over tid, vist i figur 3. Figur 4A viser et eksempel på gating for Hoechst høye og lave populasjoner, mens figur 4C og D demonstrerer gating for FUCCI røde, gule og grønne celler. Figur 4B viser kvantifisering for antall røde (G1) og grønn eller gul (S / G2 / M) celler enten i Hoechst høy (ytre cellene) eller lav (Hoechst indre cellene). Igjen denne teknikken viser at røde celler i G1 er sterkt anriket i det indre området av den sfæroide (jf. Likhet med bildeanalyse i figur 2E).
Figur1:. C8161 spheroid Representant fase kontrast bilde tatt på 10X forstørrelse på en C8161 spheroid etter 3 dager kultur på agar. Scale bar tilsvarer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. C8161 FUCCI spheroid Image Analysis Representant bilde av en C8161 FUCCI spheroid vibratome snitt på 20X forstørrelse. Sfæroid ble dyrket i tre dager på agarose, deretter ytterligere 24 timer i kollagenmatriksen. Confocal z-skive (A) Azami Green, (B) Kusabira Orange2 og (C) FUCCI overlegg. Scale bar = 100 mikrometer. (D) rødt og grønt objekt masker laget i Volocity, med spheroid disposisjon i grått. Arraden indikerer 80 mikrometer avstand fra spheroid kanten. (E) Kvantifisering av antall røde (G1) og grønn / gul (S / G2 / M) celler i det indre (> 80 um fra den sfæroide kant) og ytre (<80 um fra de sfæroide kant) regioner. Feilfelt representerer SD fra 4 sfæroide seksjoner fra 2 uavhengige eksperimenter. (F) Penetration på 10 mikrometer Hoechst fargestoff etter 1,5 timers inkubasjon. Scale bar = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. C8161 spheroid Hoechst Dye Diffusion Tid Course Representant konfokale z-slice bilder fra midten av hele C8161 kuler dyrket på agarose i 4 dager og inkubert med 10 mm Hoechst i de angitte tidsrom. Tatt på 10X forstørrelse. Hvite linjer indikerer den omtrent Hoechst inntrengningsdybde. Merk at C8161 agaroseplater kuler er tettere enn C8161 kuler som har blitt implantert i kollagen i 24 timer i figur 2, som resulterer i mindre fargestoff penetrasjon på samme tidspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4:. C8161 FUCCI spheroid Flow Analysis (A) Eksempel på Hoechst høy og lav gating etter inkubasjon av 20 kuler med 10 mikrometer Hoechst. Blå linjen angir unstained kontroll, indikerer et fullt farget Hoechst kontroll grønne linjen. (B) Kvantifisering av antall røde og grønne / gule legemer i det indre (Hoechst lav) og ytre (Hoechst høy) populations. Feilfelt representerer SD fra 8 uavhengige forsøk (inkludert både live sortering og fast celle analyse). Eksempel på FUCCI gating for den indre (C) og ytre (D) sfæroide populasjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Semi-automatisert bildeanalyse identifiserte spheroid indre G1 arrestert region, og voksende ytre lag. Denne fremgangsmåten kan brukes på levende sfæroider ved hjelp av en optisk del, eller i faste sfæroide seksjoner, for å identifisere endringer i ikke bare cellesyklusen, men da uttrykket (via immunofluorescens), celledød, eller cellemorfologi i disse forskjellige områder. Cellemotilitet innenfor ulike sfæroide områder kan også kvantifiseres - hvis levende konfokal tidsforløp avbildning sammen med en cellesporingsbildeanalysetrinnet blir tilsatt. Kritisk til bildeanalyse er at høy kvalitet z- slice konfokale bilder oppnås, høyere oppløsning gir bedre identifisering av celler. En begrensning med bildeanalyse er at det ikke er mulig å finne hver celle på riktig måte hvis kjernene er for tett, eller hvis det er for mye variasjon i den røde og grønne intensitet. FUCCI negative celler (i tidlig G1) er ikke i stand til å bli funnet med denne bildeanalysemetode, bare rødt (G1),gul (tidlig S-fasen) og grønn (S / G2 / M). En annen ulempe med den bildebasert analysemetode som er beskrevet her, er at den ikke tar hensyn til det fulle 3D arten av sfæroidene. Selv om Volocity programvaren kan utføre 3D-målinger ved hjelp av z-stack-bilder, er konfokal mikroskopi ikke kan trenge inn og bildet gjennom hele spheroid på grunn av den store størrelsen. Multi-foton avbildning kan anvendes for å oppnå en z-stabel med en hel sfæroide for 3D-målinger 7 som denne teknologien tillater penetrasjon på opptil 500 um, selv om noen sfæroider kan fremdeles være for stor til å avbilde hele kuler via denne metoden. Et annet alternativ for å avbilde hele sfæroide er lys-ark-baserte mikroskopi, som tillater visualisering av den sfæroide fra flere vinkler og trenger opp til 200 um inne store kuler 20,21. Valg av bilde strategi kan bli påvirket av spheroid størrelse, cellepakketetthet og celletype.
Hoechst fargestoff diffusion fremgangsmåte for separering av indre og ytre celler i en flercellet sfæroide via strømningscytometri ble først beskrevet i 1982 22. Denne metode basert på det faktum at Hoechst fargestoff diffunderer langsomt inn i den sfæroide, med de ytre cellene blir farget første. Protokollen er beskrevet her kombinerer det Hoechst metoden med FUCCI system 15, som ikke bare tillater separasjon av indre og ytre sfæroide celler, men også visualisering av Hoechst penetrasjon i forhold til den indre ring av G1 stansede celler. Dette tillater nøyaktig separering av G1 arrestert regionen av sfæroide. Ved hjelp av FUCCI alene ikke tillater separasjon av de indre G1 stansede celler fra en sfæroide, gitt at de ytre prolifererende celler også inneholder celler i G1. En begrensning er at denne metoden tillater kun en grov separasjon av den sfæroide i to regioner ("ytre" Hoechst positive og "indre" Hoechst negative). Fordelen med denne metoden med bildeanalyse, er det flav cytometry gjør at flere markører for å bli testet på en gang, og fysisk separasjon av levende celler for videre nedstrøms analyse som gen eller protein uttrykk, re-dyrking i ulike miljøforhold, medikamentell behandling eller annen analyse.
Den FUCCI sfæroid system i kombinasjon med flowcytometri og bildeanalyse muliggjør identifisering av en indre ring av G1 stansede celler som omgir nekrotisk kjerne, og et ytre lag av prolifererende celler. Den nekrose og G1 arrest funnet i midten av den sfæroide er på grunn av mangel av oksygen og næringsstoffer, og utvikler seg som den sfæroide vokser i størrelse. Tidligere har vi og andre vist samlokalisering av pimonidazole hypoksi markør med G1 arrestert spheroid sentrum 7,23. Vi viser også at spredning skjer hovedsaklig innenfor omtrent 100 mikrometer fra kanten av den sfæroide. Dette samsvarer med tidligere studier i sfæroidene 12,23,24, og også korrelerer med distance av voksende celler fra nærmeste blodkar in vivo 25,26.
En alternativ metode som kan anvendes for å separere celler basert på deres posisjon i den sfæroide for flowcytometri eller andre analyser er sekvensiell trypsinization 24,27. I denne fremgangsmåten suksessive "skall" av den sfæroide fjernes ved korte, sekvensiell inkubasjonsperioder med trypsin ved lave temperaturer. Men ved hjelp av denne metoden er det vanskelig å fastslå den nøyaktige størrelsen på det ytre skall (i mikrometer tykkelse) som er fjernet i forhold til Hoechst fargestoff diffusjons-metoden, hvor Hoechst gjennomtrengning kan være direkte visualisert og målt.
Separering av de "indre" og "ytre" celler ved diffusjon fargestoff og / eller bildeanalyse kan utvides til studier av FUCCI tumorxenografter i mus. Imidlertid, for analyse av cellesyklusen in vivo, nærvær av vaskulaturen bør også være TAken i betraktning, som celler i en svulst kan være i stand til å få tilgang til oksygen og næringsstoffer fra blodkar i sentrale strøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
