Introduction
Mehrzelligen Sphäroiden 3D haben als Tumor-Modell seit Jahrzehnten bekannt, aber es ist erst vor kurzem, dass sie in häufiger Verwendung als in vitro-Modell für viele soliden Tumoren kommen. Sie werden zunehmend in Hochdurchsatz-Wirkstoffsuche Bildschirme als Vermittler zwischen komplex, teuer und zeitaufwendig in vivo-Modelle und die einfache, kostengünstige 2D-Einzelschicht-Modell 1-6 verwendet. Studies in 2D Kultur sind oft nicht in der Lage, um in vivo repliziert werden. Spheroid Modelle von vielen Arten von Krebs in der Lage, die Wachstumseigenschaften, Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten, Drogen-Penetration, Zell-Zell-Interaktionen, eingeschränkte Verfügbarkeit von Sauerstoff und Nährstoffen und die Entwicklung der Nekrose, die in vivo in soliden Tumoren 6-11 zu sehen ist zu imitieren. Sphäroide Entwicklung einer nekrotischen Kern, eine ruhende oder G1 verhaftet Umgebung des Kerns und proliferierenden Zellen in der Peripherie des Sphäroids 7. Die Entwicklung dieser Regionenkann abhängig von der Zelldichte, der Proliferationsrate und der Größe des Sphäroids 12 variieren. Es wurde vermutet, dass die zelluläre Heterogenität in diesen verschiedenen Teilbereiche ersichtlich kann in der Krebstherapie Widerstand 13,14 beizutragen. Deshalb separat ist die Fähigkeit, Zellen in diesen Bereichen zu analysieren entscheidend für das Verständnis Tumorarzneimittelreaktionen.
Und Grün (Azami Green - AG) Fluoreszenzmarkierung von Cdt1 und Geminin, die in verschiedenen Phasen des Zellzyklus 15 abgebaut werden - die Fluoreszenz Ubiquitinierung Zellzyklus-Anzeigesystem (Fucci) auf dem roten (KO Kusabira orange) basiert. So Zellkerne erscheinen rot in G1, gelb in der frühen S und S / G2 / M Phase grün. Wir beschreiben hier zwei sich ergänzende Methoden sowohl mit Fucci den Zellzyklus zu identifizieren, zusammen mit der Verwendung von Bildbearbeitungssoftware oder ein Farbstoffdiffusions Durchflusscytometrieassay um zu bestimmen, ob die Zellen befinden sich in der G1 verhaftet Mitte oder den äußeren proliferating Rings und der Abstand der einzelnen Zellen von der Kante des Sphäroids. Diese Verfahren wurden in unserer früheren Veröffentlichung, wo wir gezeigt, dass Melanomzellen in hypoxischen Regionen in der Mitte des Sphäroids entwickelt und / oder in Gegenwart von zielgerichtete Therapien sind in der Lage, in die G1-Arretierung für längere Zeit zu bleiben, und kann RE- geben Sie den Zellzyklus, wenn günstigere Bedingungen entstehen 7.
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Protocol
1. Fucci Transduktion und Zellkultur
- Fucci Transduktion
- Erstellen Zelllinien stabil exprimieren die Fucci Konstrukte mKO2-hCdt1 (30-120) und Mag-hGem (1-100) 15 mit Lentivirus-Cotransduktion wie zuvor beschrieben 7.
Hinweis: Die Fucci System ist jetzt im Handel erhältlich. - Generieren Unter Klone mit heller Fluoreszenz durch Einzelzellsortierung. Sortier einzelnen Zellen positiv für beide AG und KO (gelb) durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung in eine 96-Well-Platte wie oben beschrieben 7,16.
- Erstellen Zelllinien stabil exprimieren die Fucci Konstrukte mKO2-hCdt1 (30-120) und Mag-hGem (1-100) 15 mit Lentivirus-Cotransduktion wie zuvor beschrieben 7.
- Melanom-Zellkultur
- Kultur C8161 menschlichen Melanomzellen, wie zuvor beschrieben 7,17.
2. 3D-Sphäroidbildung (wie zuvor beschrieben 3,9)
- Agaroseplatte Vorbereitung
- Aufzulösen 1,5% Agarose (oder Edel Agar) in 100 ml ausgewogener Hank-Salzlösung (HBSS) oder Phosphat Buffered Kochsalzlösung (PBS) durch Kochen in der Mikrowelle für 3-5 min unter Schwenken. Achten Sie darauf, die Agarose vollständig gelöst ist.
- Unmittelbar Verteilen von 100 ul der Agarose-Lösung pro Vertiefung auf eine Flachboden-96-Well-Gewebekulturplatte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette.
Hinweis: Agarose kann in den Spitzen nach einer kurzen Zeit zu verfestigen, um dieses Problem zu überwinden Spitzen müssen zwischen den Platten geändert werden, wenn die mehr als einen Agarose-Platte. - Lassen Sie 96-Well-Platte auf einer ebenen Fläche, für mindestens 1 Stunde aushärten Agarose.
- Zellpräparation und Overlay auf Agarose
- Wachsen Zellen auf etwa 80% Konfluenz in einer T75-Flasche. Mit 10 ml HBSS waschen.
- Lösen Zellen unter Verwendung von 1,5 ml 0,05% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und resuspendieren in 10 ml Normalmedium.
- Zählen von Zellen mit einer Zählkammer 18 oder andere automatisierte Zählweise.
- Die Zellen in einer Endkonzentration von 25.000 Zellen / ml in normal Medium.
- Lagern Agarose Vertiefungen mit 200 ul der Zellsuspension für eine endgültige Anzahl von 5.000 Zellen pro Well.
- Rückplatten zu der Zellkultur-Inkubator (5% CO 2 und 37 ° C), um Sphäroide zu bilden über etwa 3 Tagen.
Anmerkung: Die Zeit, die ein Sphäroid zu bilden, variiert zwischen verschiedenen Zelllinien. Einige Zelllinien sind nicht Sphäroiden mit dieser Methode überhaupt. - Bild Sphäroid Morphologie mit einem inversen Mikroskop mit einem 4X Objektiv und eine Phasenkontrastfilter. Eine Zelllinie, die erfolgreich bildet Sphäroiden wird kompakt, annähernd kugelförmige Zellaggregate zu produzieren, und es sollte nur ein Sphäroid pro Vertiefung sein.
Anmerkung: Optional: Sobald Sphäroide gebildet haben, können sie in Kollagen oder anderen Matrix zur weiteren Analyse des Wachstums und der Invasion 3,7,17 transplantiert werden. Sphäroide aus Kollagen zu entfernen, Behandlung mit 500 ul 2 mg / ml Collagenase bei 37 ° C, bis das Kollagen genug für die spher gelösteoids zu kommen kostenlos in die Medien (ca. 30 min). Sphäroiden mit einer 1 ml Pipette vorsichtig entfernen. - Zum Schneiden / Imaging fix Sphäroiden (entweder isoliert von Kollagen oder für 3-5 Tage auf Agarose gezüchtet) in 10% neutral gepuffertem Formalin (ACHTUNG: Formalin sollte im Abzug verwendet werden) für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur (RT) oder über Nacht (O / N) bei 4 ° C. Sphäroide in HBSS bei 4 ° C für mehrere Tage gelagert werden.
3. Spheroid Vibratom Schnitte
- Aufzulösen 5 g niedrigschmelzender Agarose in 100 ml HBSS in einer 500 ml Glasflasche in einer Mikrowelle. Verwenden Sie eine mittlere Heizstufe mit wirbelnden. ACHTUNG: Halten Sie den Deckel lose bei Kochen der Lösung, so dass der Druck freigegeben werden kann. Verwenden Sie hitzebeständige Schutzhandschuhe, um die Hände vor Verbrennungen zu schützen beim Umgang mit dem heißen Glasflasche.
- Warten Sie, bis die Agarose kühlt leicht - so die Flasche berührt werden können, ohne zu brennen Händen.
- Gießen Sie approximadig 2 ml Agaroselösung in den Boden eines Coulter-Counters Tasse oder ähnlichen Kunststoffform. Sofort absaugen eine feste Sphäroid (siehe Abschnitt 2.2.8) unter Verwendung einer 1 ml Pipette in der kleinsten Flüssigkeitsvolumen möglich. Sphäroid hinzuzufügen, um die Agarose. Einige Sphäroide (bis zu 10) pro Schale zugegeben werden.
- Decken Sie die Sphäroide mit 2 ml mehr aus Agarose. Tun dies schnell, um die Agarose Aushärtung zu vermeiden, bevor die zweite Schicht hinzugefügt wird.
- Ermöglichen die Agarose bei RT im Dunkeln für mindestens 3 Stunden aushärten. An dieser Stelle kann Cups für eine kurze Zeit bei 4 ° C mit 2-3 gespeichert ml HBSS überlagert, um eine Austrocknung zu verhindern.
- Entfernen Agarose aus der Tasse. Schneiden Sie die Agarose mit den Sphäroiden, so dass es auf die Vibratom Metallblock passt, und Sphäroiden sind in der Nähe der Spitze der Agarose. Sphäroiden können als kleine weiße Gegenstände in der Agarose zu sehen. Superkleber die Agarose auf den Block.
- Füllen Sie das Vibratom mit destilliertem Wasser und montieren Sie den Block in der Vibratom. Stellen Sie dieVibratom 100 um Abschnitte mit geringer Geschwindigkeit (Einstellung 2) und hohe Vibrations (Einstellung 8) zu schneiden. Stellen Sie die Schneideklinge Winkel bis 16 °. Schalten Vibratom auf, schalten Sie die Vibratom Licht und Zuschnitte von der Spitze der Agarose, bis 100 & mgr; m Sphäroid Abschnitte geschnitten. Zeigen geschnitten Sphäroid Abschnitte in HBSS in einem 24-Well-Platte.
- Wählen Mittelabschnitte zur Bildanalyse. Berg Schnitte auf Objektträgern durch die Übertragung der Abschnitt flach auf den Objektträger mit einer Pinzette. Füllen Sie eine 10 ml Spritzenzylinder mit Vakuumfett; fügen Sie eine dünne Linie der Vakuumfett um die Ränder des Abschnitts, um die Befestigungsmittel aus läuft die Kanten des Schlittens zu verhindern und helfen, dichten den Abschnitt unter dem Deckglas. Bedecken Sie den Abschnitt mit Eindeckmittel und einem Deckglas. Siegel Kanten des Deckglases mit Nagellack. Objektträger bei 4 ° C vor der Bilderzeugung.
4. Die konfokale Bildaufnahme
- Werfen Sie einen z-Scheibe Bild einer mittleren Fucci Sphäroid Abschnitt mit einem 10Xoder 20x-Objektiv wie zuvor beschrieben 7. Achten Sie darauf, zwischen dem Kusabira Orange2 und Azami Grün keine Überlappung oder Übersprechen auftritt. Wenn einem Vergleich der Bildanalyse zwischen mehreren Sphäroid Abschnitte, halten Laserleistung und andere Einstellungen das gleiche zwischen den Proben.
5. Hoechst Dye Diffusion Assay für Fluss Sortierung
- Übertragen Sie Live-Sphäroiden (3-5 Tage nach Agarose-seeding) auf einen 15-ml-Tube. Lassen Sphäroide Schwerkraft zu dem Boden des Röhrchens absetzen. Mehrere Sphäroiden können pro Röhrchen gefärbt werden. Etwa 20 Sphäroide notwendig sind, um ausreichende Zellzahlen für die Durchflusszytometrie zu gewinnen.
- Entfernen Sie überschüssiges Medium und 1 ml von 10 & mgr; M Hoechst in Normalmedium verdünnt. Sphäroide bei 37 ° C für ca. 1 Std. Schon flicking, um die Kügelchen während der Inkubation einmal oder zweimal zu resuspendieren.
Anmerkung: Die Inkubationszeit variiert werden kann, um zu ändern, wie weit der Hoechst-Farbstoff in die Sphäroide eindringt. Dies wird auf variierendas Sphäroid Größe, Dichte und Zelllinie. Für einige große / dichte Kügelchen kann es zu einer maximalen Durchfärbung, die weniger als 100% sein. - Vorsichtig mit 5 ml HBSS mit Schwerkraftabsetzung Waschen Sie die Sphäroiden.
- Optional: Für die Bildgebung der Farbeindringprüfung: Fix Sphäroiden mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 2 h bei RT oder O / N bei 4 ° C. Bereiten Vibratom Abschnitte, Mount auf Dias und Bild auf der konfokalen wie in Schritt 3 und 4 oben beschrieben.
- Um Zellen für die Strömung mit 1 ml 0,05% Trypsin / EDTA bei 37 ° C etwa 30 min mit Ausklopfen alle 10 min bis der Sphäroide auseinanderzubrechen vorzubereiten Zytometrie trypsinize Sphäroide.
Anmerkung: Sphäroide schwierig in Einzelzellsuspension zu erhalten, müssen Bedingungen, die optimiert werden. Lebensfähigkeit C8161 4 Tage alte Sphäroide nach diesem Prozeß beträgt ca. 95%. - Stain-Zellen mit einem Nah-Infrarot-Live / Dead-Färbung nach dem Protokoll des Herstellers. Waschen mit HBSS dann mit 1 fixml 10% neutral gepuffertem Formalin für ca. 30 min. Zellen können in HBSS bei 4 ° C mehrere Tage vor Flussanalyse gespeichert werden.
6. Durchflusszytometrie Analyse von Hoechst Stained Fucci Spheroids
- Sicherzustellen Zellen nicht miteinander, indem sie durch ein Zellsieb verklumpt. Resuspendieren der Hoechst gefärbt Fucci Sphäroiden in eiskaltem Wasch FACS (PBS mit 5% fötales Kälberserum) in einer Konzentration von 1-5 × 10 6 Zellen / ml. Übertragen Sie 200 ul der Probe auf 5 ml Rundbodenröhrchen.
- Bereiten Sie die folgenden einzelnen Farbkontrollproben wie in 6.1 beschrieben: un-angefärbt Melanomzellen; haft Melanom-Zellen mit 10 & mgr; M Hoechst 1 Stunde gefärbt; Azami Grün nur ausdrücken Melanomzellen; und Kusabira orange nur ausdrücken Melanomzellen.
Hinweis: Einzelne Farbe Kontrollen können in Formalin fixiert und in FACS gespeichert werden abwaschen mit 0,1% Natriumazid bei 4 ° C für Wochen oder sogar Monate. - Führen Sie Einzelzellsuspensionen ona Durchflusszytometrie Analysator mit geeigneten Lasern und einzelne Farbe / ungefärbten Kontrolle wie vorher beschrieben 7,16.
- Verwenden kommerziellen Zytometrie Software wie FlowJo zur Analyse der inneren vs. Außen Sphäroid-Zellen wie folgt:
- Entfernen Sie die Ablagerungen durch Gating auf der Hauptzellpopulation im Vorwärtsstreulicht (FSC) gegen Seitwärtsstreulichts (SSC).
- Dubletten entfernen durch Gating an einzelnen Zellen unter Verwendung von FSC (Region) vs. FSC (Höhe)
- Tor für lebende Zellen durch Gating auf dem Live / Dead geringer Bevölkerungs.
- Definieren Hoechst High-Zellen, bezogen auf das positive Signal von der adhärenten Zellen mit Hoechst gefärbt gated, als "äußere" Zellen.
- Definieren Hoechst niedrigen oder negativen Zellen, basierend auf dem Signal von dem nicht-gefärbten Steuer gated, als "innere" Zellen.
- Nach Gating für den inneren und äußeren Populationen können Zellen weiter Fucci rot (G1), gelb (frühe S), Grün (S / G2 / M) oder negativ (frühen G1) ausgeblendet werden.
Anmerkung: Compensation mit den einzelnen Farbsteuerung erforderlich sein, um die Fucci rot, gelb, grün und negativen Populationen richtig zu definieren.
- Nachdem der Assay wurde optimiert und Hoechst Eindringen über die konfokale Mikroskopie bestätigt, laufen Zellen ohne Fixierung auf eine Fließzellsortierer, wie zuvor beschrieben 7,16 für die weitere Analyse der Lebendzellunterpopulationen.
7. Bildanalyse von Fucci Spheroid Sections
- Offene Software zB. Volocity, wählen Sie die Quantifizierung NUR Konfiguration.
- Erstellen Sie eine neue Bibliothek. Importieren Sie die Fucci Sphäroid konfokale Bilddatei in die Software, indem Sie die Rohdatendatei von der konfokalen in die Bibliothek. Alternativ können Sie den Befehl Datei> Importieren.
- Gehen Sie zur Registerkarte Messungen, um eine Bildanalyse-Protokoll zu bauen. Das Protokoll wird per Drag & Drop die entsprechenden Befehle in der richtigen Reihenfolge, wie im Protokoll Fenster folgt aufgebaut.
- Finden objECTS im grünen Kanal: Ziehen Sie das Suchen von Objekten Befehl (in "Finding 'gefunden) in das Protokollfenster, wählen Sie den richtigen Kanal in der gewünschten Objekte protocol.Add einen offenen Befehl (in" Verarbeitung "gefunden), dann ein separater berührende Objekte Befehl (in "Verarbeitung" gefunden - dies Zellen zu trennen). Objekte Größe <50 & mgr; m auszuschließen sind (in 'Filtering' gefunden - dies kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen).
Hinweis: Variablen wie dem Suchen von Objekten Schwelle, Anzahl der offenen Iterationen, um die Größe von Objekten getrennt werden und die Größe der Objekte ausschließen müssen manuell optimiert werden, bis die Objektmasken passen Sie das Bild. - Suchen von Objekten im roten Kanal: Wiederholen Objekte, wie oben für den roten Kanal zu finden. Grüne und rote Protokolle müssen separat eingestellt werden.
Hinweis: Aufgrund der Kerne als in G2, sind grün Kerne oft etwas größer. - Bestätigen gefundenen Objekte sind genau bestätigen rote und grüne Objekte entsprechen denrote und grüne Kerne in dem Bild, das durch Aus- und Einschalten der grünen und roten Kanälen (mit dem ein- oder ausblenden Kanalbefehl), während die Anzeige der roten und grünen Masken durch das Protokoll gefunden. Feedback-Optionen (Measurements> Feedback-Optionen) können verwendet werden, um das Erscheinungsbild der Objektmasken ändern.
- Finden gelbe Objekte (frühen S-Phase-Zellen): Um gelben Zellen zu finden, fügen Sie einen schneiden Rot mit grünen Zellen-Befehl (in "Die Kombination" gefunden). Objekte nach Größe (<50 um, in 'Filtering' gefunden), um kleine nicht-zelluläre Objekte auszuschließen auszuschließen.
- Finden Sie ausschließlich rote Objekte (G1-Phase-Zellen): Um ausschließlich roten Kerne zu finden, subtrahieren Sie die gelben Zellen von den roten Blutzellen (in "Die Kombination" gefunden). Objekte ausschließen, indem Größe <50 & mgr; m (in 'Filtering' gefunden), um kleine nicht-zelluläre erstellte Objekte zu entfernen.
- Finden Sie ausschließlich grüne Objekte (S / G2 / M-Phasen-Zellen): Wiederholung für den grünen Kanal ausschließlich grün zu finden.
Neinte: Wenn es immer noch nicht-zelluläre Objekte verbleibenden, ein Filter Bevölkerung Befehl kann zur exklusiven grün oder rot Exclusive-Protokolle (in 'Filtering' gefunden), nur zu halten hinzugefügt werden Objekte mit einem Formfaktor größer als 0,25. Dies wird nicht kreisförmige Objekte zu entfernen. - Finden Sie die Sphäroid Gliederung: Finden Sie die Sphäroid Umriss mit einem Fundobjekte Befehl mit der grünen oder roten Kanal (je nachdem, was mehr Zellen am Rand des Sphäroids ist) (in "Finding" gefunden). Eine viel niedrigere Schwelle (in der find gefundenen Objekte Variablen) müssen verwendet werden, um das Sphäroid Umrisse im Vergleich zu einzelnen Zellen zu finden.
- Verwenden Sie einen Schließbefehl an Objekten (in "Verarbeitung" gefunden) anzuschließen, dann füllen Sie Löcher in Objekten (in der "Verarbeitung" gefunden), dann mit einem Feinfilter (in 'Filtering' gefunden), um Lärm von Objekten zu entfernen. Schließlich schließen Objekte nach Größe, um kleinere Gegenstände <30.000 & mgr; m (abhängig von der Sphäroid Größe) zu entfernen.
Notiz: Dieses Protokoll müssen manuell optimiert, bis das Sphäroid Umrisse korrekt werden. Ein Hellfeld Bild können auch verwendet werden - allerdings ist dies in der Regel weniger genau mit einem Sphäroid Schnitt und einer Invert-Befehl (in "Die Kombination 'gefunden) müssen verwendet werden.
- Verwenden Sie einen Schließbefehl an Objekten (in "Verarbeitung" gefunden) anzuschließen, dann füllen Sie Löcher in Objekten (in der "Verarbeitung" gefunden), dann mit einem Feinfilter (in 'Filtering' gefunden), um Lärm von Objekten zu entfernen. Schließlich schließen Objekte nach Größe, um kleinere Gegenstände <30.000 & mgr; m (abhängig von der Sphäroid Größe) zu entfernen.
- Entfernungen messen von Kernen zum Sphäroid Gliederung: Messen Sie Abstände von den gelben, grünen und ausschließlich exklusiv roten Populationen aus der Zelle Schwerpunkt an den Rand des Sphäroids outline.To die Mindestabstände zu visualisieren (in 'Bezogen' gefunden), die aus dem sein sollte Zelle zur nächsten Sphäroid Kante, schalten Sie zeigen Wege auf der Registerkarte Beziehungen in Feedback-Optionen (Measurements> Feedback-Optionen> Beziehungen).
- Speichern Sie das Protokoll. Dieses Protokoll kann auf andere Bilder mit den Messungen erneut angewendet werden> Protokollbefehl wiederherstellen.
- Erstellen Sie einen Messpunkt (Measurements> Make Mess Artikel). Daten können unter Verwendung der Analyse analysiert werden,Funktionen.
- Gehen Sie auf die Registerkarte Analyse im Messpunkt. Zum Menü Analyse (Analysis> Analyze) und Analyse der Mindestabstand von der Zellenschwerpunkt (rot, grün oder gelb) an das Sphäroid Kante, von Graf zusammengefasst und durch die Bevölkerung organisiert.
- Um die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Abstand von der Kante gefunden zählen erstellen Sie einen Filter (Analyse> Filter). Der Filter für Mindestabstand in Figur 2 ist an Hoechst Eindringen basiert (zB minimale Abstand kleiner als 80 gibt die "äußeren" Bevölkerung). Alternativ Export von Rohdaten in eine Tabellenkalkulation zur weiteren Analyse.
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Representative Results
Es gibt mehrere Verfahren zur Herstellung Tumorsphäroide Dieses Protokoll verwendet die nicht-haftenden Wachstumsverfahren, bei dem Zellen auf Agar oder Agarose 3,7,9 kultiviert werden. 1 zeigt ein Beispiel eines C8161-Melanom Sphäroid nach 3 Tagen auf Agar. C8161 Sphäroide bilden regelmäßige Größe Sphäroiden mit einem Durchmesser von 500 bis 600 & mgr; m (Mittelwert = 565, SD = 19, n = 3) nach 3 Tagen. Andere Melanom-Zelllinien, die Sphäroide bilden gehören: WM793, WM983C, WM983B, WM164, (sind Sphäroiden mit dieser Zelllinie gebildet unregelmäßiger und weniger dicht 19) 1205lu.
Um den Zellzyklus der einzelnen Zellen in der 3D-Sphäroid-Modell zu visualisieren, wurden C8161-Melanomzellen mit dem Fucci System 7,15 transduziert. Aufgrund der großen Größe der Kügelchen (bis zu 1 mm im Durchmesser nach 3 Tagen auf Agarose und 24 Stunden Wachstum in Kollagen für C8161) ist Sektionierung die beste Option für die Visualisierung Zellen in der Mitte des Sphäroids. GanzeSphäroide (live oder feste) kann durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, jedoch ist die konfokale Abbildung ist nur in der Lage, etwa 150 & mgr; m durchdringen sich daher eine mittlere optische Scheibe des Sphäroids nur in Sphäroide mit einem Durchmesser kleiner als 300 um erhalten werden. Figur 2A, B und C zeigt ein Beispiel eines Schnittes durch eine C8161 Fucci Sphäroid. Nekrose durch G1 arretierten Zellen umgeben ist, mit einem Gradienten von proliferierenden Zellen in den äußeren Schichten ist offensichtlich. Zur Identifizierung und Quantifizierung Zellen auf der Basis ihrer Position in der Sphäroid und Zellzyklus-Status wurde halbautomatischen Bildanalyse durchgeführt. 2D zeigt die Fucci Zelle Masken und Sphäroid Kontur und 2E zeigt die Quantifizierung der Zahl der roten (G1) und grün oder gelb (S / G2 / M-Zellen), entweder weniger als 80 & mgr; m von der Kante des Sphäroids (äußeren Zellen) oder mehr als 80 & mgr; m von der Kante Sphäroid (innere Zellen). Diese quantificatiauf, zeigt, daß rote Blutzellen in G1 sind stark in den Innenbereich des Sphäroids angereichert, wie erwartet.
Um zu identifizieren und möglicherweise zu sortieren Zellen auf ihrer Zellzyklus-Status und der Position in dem Sphäroid wurde eine Hoechst-Farbstoff-Diffusionstest in Kombination mit dem Fucci System in einer begrenzten Diffusion des Farbstoffs in verwendet wird. Die Inkubation von Voll Sphäroide mit Hoechst-Farbstoff Ergebnisse die äußeren Schichten des Sphäroids, kann dies verwendet werden, um Hoechst positive äußere Schicht Zellen von Hoechst negativen inneren Sphäroid Zellen mittels Durchflusszytometrie getrennt. 2F zeigt das Eindringen von Hoechst bis zu etwa 80 & mgr; m von der Kante Sphäroid. Die Hoechst Positivität Abstand von 80 & mgr; m von der Kante wurde durch visuelle Analyse der Sphäroid Abschnitte und Optimierung der Farbstoffkonzentration und Inkubationszeit erhalten, so dass das Eindringen der Hoechst proliferierenden Zellen in den äußeren Schichten (die im Wesentlichen weniger gefunden eng markiertenals 80 & mgr; m von der Kante) hat und nicht in die G1 eindringen verhaftet area.The Inkubationszeit mit Hoechst variiert werden, um tiefer oder flacher Eindringtiefe zu erhalten. Ein Beispiel unterschiedlicher Hoechst Penetration über die Zeit in der 3 gezeigt. 4A zeigt ein Beispiel für die Gating für Hoechst High-und Low-Populationen, während 4C und D zeigt die Gating für Fucci roten, gelben und grünen Zellen. 4B zeigt die Quantifizierung der Zahl der roten (G1) und grün oder gelb (S / G2 / M-Zellen), entweder in der Hoechst High (äußere Zellen) oder Hoechst niedrig (innere Zellen). Auch dieses Verfahren zeigt, dass die roten Blutzellen in der G1 sind stark in den Innenbereich des Sphäroids (cf an die Bildanalyse in 2E. Ähnlichkeit) angereichert.
Abbildung1:. C8161 Spheroid Repräsentative Phasenkontrastbild bei 10-facher Vergrößerung eines C8161 Sphäroid nach 3 Tagen Kultur auf Agar gemacht. Maßstabsbalken entspricht 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 2: C8161 Fucci Spheroid Bildanalyse Repräsentative Bild eines C8161 Fucci spheroid Vibratom Abschnitt bei 20facher Vergrößerung. Spheroid war für drei Tage auf Agarose, dann weitere 24 h in Kollagen-Matrix kultiviert. Konfokalen z-Scheibe (A) Azami Grün, (B) Kusabira Orange2 und (C) Fucci Overlay. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. (D) Rot und Grün Objektmasken in Volocity gestaltet, mit dem Sphäroid Gliederung in grau. ArReihe zeigt 80 um Abstand von der Sphäroid Kante. (E) Die Quantifizierung der Zahl der roten (G1) und grün / gelb (S / G2 / M-Zellen) innerhalb der inneren (> 80 & mgr; m von der Kante Sphäroid) und äußeren (<80 um aus den Sphäroiden Flanke) Regionen. Fehlerbalken stellen die SD von 4 Sphäroid Schnitte von 2 unabhängigen Experimenten. (F) Penetration von 10 uM Hoechst-Farbstoff nach 1,5 h Inkubation. Maßstabsbalken = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: C8161 Spheroid Hoechst Farbstoff-Diffusionszeitverlauf Repräsentative konfokalen z-Schnittbilder von der Mitte des gesamten C8161 Sphäroide für die angegebenen Zeiten auf Agarose für 4 Tage kultiviert und mit 10 & mgr; M inkubiert Hoechst. Genommen in 10-facher Vergrößerung. Weiße Balken geben die ungefähre Hoechst Eindringtiefe. Beachten Sie, dass C8161 Agarose-Kügelchen sind dichter als die C8161 Sphäroiden, die in Kollagen 24 h in 2 implantiert wurden, was zu weniger Durchfärbung gleichzeitig Punkt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 4: C8161 Fucci Spheroid Flow Analysis (A) Beispiel der Hoechst hohen und niedrigen Gating nach Inkubation von 20 Sphäroiden mit 10 & mgr; M Hoechst. Blaue Linie zeigt die ungefärbten Kontrolle, grüne Linie zeigt einen vollständig gefärbten Hoechst Kontrolle. (B) Quantifizierung der Zahl der roten und grün / gelb Zellen innerhalb des inneren (Hoechst niedrig) und äußeren (Hoechst hoch) populations. Fehlerbalken stellen die SD von 8 unabhängigen Experimenten (einschließlich Live-Sortier- und feste Zellanalyse). Beispiel Fucci Gating für die innere (C) und äußeren (D) Sphäroid Populationen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Halbautomatische Bildanalyse identifizierte die Sphäroid Innen G1 festgenommen Region und wuchernden äußeren Schichten. Dieses Verfahren kann auf Live-Sphäroiden mit einem optischen Abschnitt verwendet werden, oder in festen Sphäroid Abschnitte, auf Veränderungen nicht nur des Zellzyklus, sondern Markerexpression (über Immunfluoreszenz), Zelltod oder Zellmorphologie in diesen verschiedenen Regionen zu identifizieren. Zellbeweglichkeit in verschiedenen Regionen Sphäroid kann auch quantifiziert werden -, wenn Live-konfokale Zeitraffer-Bildgebung zusammen mit einer Zellverfolgung Bildanalyseschritt wird hinzugefügt. Entscheidend für die Bildanalyse ist, dass hohe Qualität z- Scheibe konfokalen Bildern erhält man Bilder mit höherer Auflösung eine bessere Identifizierung von Zellen. Eine Einschränkung bei der Bildanalyse ist, dass es nicht möglich ist, jede Zelle korrekt finden, wenn Kerne zu dicht sind oder wenn es zu viel Veränderung in der roten und grünen Intensität. Fucci negativen Zellen (in der frühen G1) nicht in der Lage, mit dieser Bildanalyseverfahren nur Rot (G1) ermittelt werden,Gelb (frühen S-Phase) und Grün (S / G2 / M). Einen weiteren Nachteil der hier beschriebenen bildbasierten Analyseverfahren ist, dass sie nicht unter Berücksichtigung der vollen 3D Natur der Sphäroide zu nehmen. Obwohl die Volocity Software 3D-Messungen mit Z-Stapel-Bildern durchführen können, ist die konfokale Mikroskopie nicht in der Lage zu durchdringen und Bild über die gesamte Sphäroid kann aufgrund der großen Größe. Multi-Photonen-Bildgebung verwendet werden, um eine z-Stapel Ganzes Sphäroid 3D-Messungen 7 zu erhalten, wie diese Technologie ermöglicht das Eindringen von bis zu 500 & mgr; m, obwohl einige Sphäroide noch zu groß ist, um Bild ganze Sphäroide über diese Methode. Eine weitere Option für die Abbildung des gesamten Sphäroids ist Lichtbogen-basierte Mikroskopie, die Visualisierung der Sphäroid aus verschiedenen Blickwinkeln ermöglicht und dringt bis zu 200 & mgr; m in großen Sphäroiden 20,21. Wahl der Abbildungsstrategie kann durch Sphäroids Größe, Zellpackungsdichte und Zellentyp beeinflusst werden.
Die Hoechst-Farbstoff diffusion Verfahren zum über Durchflusszytometrie Trenn inneren und äußeren Zellen in einem mehrzelligen Sphäroids wurde zuerst im Jahr 1982 22 beschrieben. Dieses Verfahren wird auf der Tatsache, dass die Hoechst-Farbstoff diffundiert langsam in den Sphäroiden, wobei die äußeren Zellen zunächst gebeizt basiert. Das hier beschriebene Protokoll verbindet die Hoechst-Methode mit dem Fucci System 15, das nicht nur die Trennung von Innen- und Außen Sphäroid Zellen, sondern auch die Visualisierung von Hoechst Eindringen in Bezug auf den Innenring des G1 arretierten Zellen ermöglicht. Dies ermöglicht eine genaue Trennung des G1 verhafteten Bereich des Sphäroids. Verwendung Fucci allein nicht die Trennung der inneren G1 arretierten Zellen aus einem Sphäroid, da die äußeren proliferierenden Zellen enthalten auch Zellen in G1 erlauben. Eine Einschränkung ist, dass diese Methode erlaubt nur eine grobe Trennung des Sphäroids in zwei Regionen ("äußeren" Hoechst positiven und "innere" Hoechst negativ). Der Vorteil dieser Methode gegenüber der Bildanalyse, das heißt fNieder Durchflusszytometrie ermöglicht mehrere Marker auf einmal getestet werden, und eine physikalische Trennung von lebenden Zellen für Downstream-Analyse wie Gen- oder Proteinexpression, erneute Kultivierung unter verschiedenen Umgebungsbedingungen, Medikamente oder andere Analysen.
Die Fucci Sphäroid System in Kombination mit Durchflusszytometrie und Bildanalyse ermöglicht die Identifizierung von einem Innenring G1 arretierten Zellen um den nekrotischen Kern und eine äußere Schicht von proliferierenden Zellen. Nekrose und G1-Arrest in der Mitte des Sphäroids Ergebnis ist wegen des Mangels an Sauerstoff und Nährstoffen, und entwickelt und das Sphäroid in der Größe wächst. Zuvor haben wir und andere Co-Lokalisation des pimonidazole Hypoxie-Marker mit dem G1 verhaftet Sphäroid Zentrum 7,23 gezeigt. Wir zeigen auch, dass die Proliferation innerhalb von etwa 100 & mgr; m von der Kante des Sphäroids weitgehend auftritt. Dies entspricht früheren Studien in Sphäroiden 12,23,24 und auch korreliert mit der distance proliferierender Zellen vom nächsten Gefäßsystem in vivo 25,26.
Eine alternative Methode, die verwendet werden, um Zellen auf der Basis ihrer Position in der Sphäroid für die Durchflusszytometrie oder andere Analyse trennen kann, ist sequentiellen Trypsinisierung 24,27. Bei diesem Verfahren wird aufeinander "Schalen" des Sphäroids sind durch kurze, aufeinanderfolgende Inkubationszeiten mit Trypsin bei niedrigen Temperaturen entfernt. Jedoch unter Verwendung dieses Verfahrens ist es schwierig, die exakte Größe der Außenschale (in & mgr; m Dicke), festzustellen, dass im Vergleich zu dem Hoechst-Farbstoff-Diffusions-Verfahren, wobei der Hoechst Eindringen direkt visualisiert und gemessen werden entfernt wird.
Trennen der "inneren" und "äußeren" Zellen durch Farbstoffdiffusion und / oder Bildanalyse auf Studien der Fucci Tumorxenotransplantaten in Mäusen verlängert. Jedoch für die Analyse des Zellzyklus in vivo das Vorhandensein Vaskulatur auch taken berücksichtigt, wie Zellen in einem Tumor in der Lage, Sauerstoff und Nährstoffe aus dem Gefäßsystem in den mittleren Bereichen zuzugreifen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
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