Introduction
Multicellulære sfæroider 3D har været kendt som en tumormodel i årtier, men det er først for nylig, at de er kommet ind i mere almindelige anvendelse som en in vitro model for mange faste cancere. De bliver i stigende grad brugt i high-throughput drug discovery-skærme som et mellemprodukt mellem komplekse, dyre og tidskrævende in vivo modeller og enkle, billige 2D monolag model 1-6. Studier i 2D kultur er ofte ude af stand til at blive gentaget in vivo. Sfæroide modeller af mange typer cancer er i stand til at efterligne egenskaberne vækst, medikamentfølsomhed lægemiddelpenetrering, celle-celle-interaktioner, begrænset tilgængelighed af ilt og næringsstoffer og udvikling af nekrose, der ses in vivo i faste tumorer 6-11. Sfæroider udvikle en nekrotisk kerne, en hvilende eller G1 standset område, der omgiver kernen, og prolifererende celler ved periferien af klumpformet 7. Udviklingen af disse regionerkan variere afhængigt af celletætheden, proliferationshastighed og størrelsen af sfæroide 12. Det er blevet antaget, at den cellulære heterogenitet ses i disse forskellige delregioner kan bidrage til cancerterapi resistens 13,14. Derfor evnen til at analysere celler i disse regioner særskilt er afgørende for forståelsen tumor narkotika reaktioner.
Systemet fluorescens ubiquitinering cellecyklus indikator (Fucci) er baseret på den røde (Kusabira Orange - KO) og grøn (Azami Green - AG) fluorescerende mærkning af Cdt1 og geminin, som nedbrydes i forskellige faser af cellecyklus 15. Således cellekerner ser røde i G1, gul i begyndelsen af S og grøn i S / G2 / M-fasen. Vi beskriver her to komplementære metoder både ved hjælp Fucci at identificere cellecyklus, sammen med anvendelse af imaging software eller et farvestof diffusion flowcytometriassayet at afgøre, om cellerne bor i G1 standset center eller den ydre proliferating ring, og afstanden af de enkelte celler fra kanten af sfæroide. Disse fremgangsmåder blev udviklet i vores tidligere publikation, hvor vi vist, at melanomceller i hypoxiske regioner i midten af sfæroid og / eller i nærværelse af målrettede behandlinger er i stand til at forblive i G1 arrest i længere perioder, og kan re- ind i cellens cyklus, når mere gunstige betingelser opstår 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fucci Transduktion og cellekultur
- Fucci transduktion
- Opret cellelinjer, der stabilt udtrykker den Fucci konstruktionerne mKO2-hCdt1 (30-120) og MAG-hGem (1-100) 15 under anvendelse af lentivirus co-transduktion som tidligere beskrevet 7.
Bemærk: Det Fucci system er nu kommercielt tilgængelige. - Generere sub-kloner med lyse fluorescens ved en enkelt-celle-sortering. Sorter enkeltceller positive for både AG og KO (gul) ved fluorescensaktiveret cellesortering i en 96-brønds plade som beskrevet tidligere 7,16.
- Opret cellelinjer, der stabilt udtrykker den Fucci konstruktionerne mKO2-hCdt1 (30-120) og MAG-hGem (1-100) 15 under anvendelse af lentivirus co-transduktion som tidligere beskrevet 7.
- Melanom cellekultur
- Kultur C8161 humane melanomceller som tidligere beskrevet 7,17.
2. 3D Sfæroide Formation (som tidligere beskrevet 3,9)
- Agarose forberedelse plade
- Opløs 1,5% agarose (eller ædle agar) i 100 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) eller phosphat Buffered saltvand (PBS) ved kogning i mikrobølgeovnen i 3-5 min med hvirvlende. Sørg for, at agarose er helt opløst.
- Umiddelbart dispenseres 100 pi af agaroseopløsningen per brønd til en fladbundet 96-brønds vævskulturplade anvendelse af en multi-kanal pipette.
Bemærk: Agarose kan størkne i spidserne efter en kort periode, for at overvinde dette problem tips skal skiftes mellem pladerne, hvis foretager mere end én agarose plade. - Efterlad 96-brønds plade på en flad overflade for at hærde agarose i mindst 1 time.
- Celle forberedelse og overlay på agarose
- Grow celler til ca. 80% konfluens i en T75 kolbe. Vask med 10 ml HBSS.
- Frigør celler under anvendelse af 1,5 ml 0,05% trypsin / ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og resuspender i 10 ml normalt medium.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer 18 eller andre automatiserede optælling metode.
- Resuspender celler til en slutkoncentration på 25.000 celler / ml i normenal medium.
- Overlay agarose brønde med 200 pi af cellesuspensionen til en endelig antal 5000 celler per brønd.
- Return plader til cellekultur inkubator (5% CO2 og 37 ° C) til dannelse af sfæroider over ca. 3 dage.
Bemærk: Den tid, det tager at danne en klumpformet varierer mellem forskellige cellelinjer. Nogle cellelinier ikke danner sfæroider ved hjælp af denne metode på alle. - Billede klumpformet morfologi med et omvendt mikroskop ved hjælp af en 4X objektiv og en fase kontrast filter. En cellelinie, der med succes danner spheroids vil producere kompakte, omtrent kugleformede celleaggregater, og der bør kun være én klumpformet per brønd.
Bemærk: Valgfrit: Når sphæroider har dannet, kan de transplanteres til collagen eller anden matrix for yderligere analyse af vækst og invasion 3,7,17. At fjerne sfæroider fra collagen, behandles med 500 pi 2 mg / ml collagenase ved 37 ° C, indtil kollagen opløses nok til Sphereoids at komme fri i mediet (ca. 30 minutter). Fjern forsigtigt kugler ved hjælp af en 1 ml pipette. - For sektionering / imaging fix sfæroider (enten isoleret fra collagen eller dyrket i 3-5 dage på agarose) i 10% neutral bufret formalin (ADVARSEL: Formalin bør anvendes i stinkskab) i mindst 2 timer ved stuetemperatur (RT) eller natten over (O / N) ved 4 ° C. Sfæroider kan opbevares i HBSS ved 4 ° C i flere dage.
3. Sfæroide Vibratome Sektionsinddeling
- 5 g agarose med lavt smeltepunkt i 100 ml HBSS opløses i en 500 ml glasflaske i en mikrobølgeovn. Brug en medium varme indstilling med hvirvlende. ADVARSEL: Hold låget løs, når kogende løsningen, så trykket kan frigives. Brug beskyttelseshandsker termoglas handsker ved håndtering af varme glasflaske for at beskytte hænderne mod forbrændinger.
- Vent, indtil agarosen køler lidt - så flasken kan berøres uden at brænde hænderne.
- Hæld opstillet cately 2 ml agarose i bunden af en Coulter-tæller kop eller lignende plast støber. Umiddelbart aspirere et fast sfæroid (se afsnit 2.2.8) under anvendelse af en 1 ml pipette i den mindste mængde af væske muligt. Tilføj sfæroid til agarose. Et par sfæroider (op til 10) kan tilsættes pr kop.
- Dæk sfæroider med 2 ml flere af agarose. Gør dette hurtigt for at undgå den agarose hærdning før der tilsættes det andet lag.
- Lad agarose til at hærde ved stuetemperatur i mørke i mindst 3 timer. På kan lagres dette punkt kopper for en kort tid ved 4 ° C med 2-3 ml HBSS overlejret for at undgå dehydrering.
- Fjern agarose fra bægeret. Trimme agarose indeholdende sfæroider, så det passer på vibratome metalblok og sfæroider er tæt på toppen af agarose. Sfæroider kan ses som små hvide objekter inde i agarose. Superlim agarose til blokken.
- Fyld vibratome med destilleret vand og montere blok i vibratome. Indstilvibratome at skære 100 um sektioner ved hjælp lav hastighed (indstilling 2) og høj vibration (indstilling 8). Indstil klingen vinkel til 16 °. Vend vibratome på, tænde vibratome lys og skære sektioner fra toppen af agarose indtil 100 um sfæroide snit skæres. Placer skåret sfæroide sektioner i HBSS i en 24-brønds plade.
- Vælg midterste sektioner for billedanalyse. Mount afsnittene om dias ved at overføre afsnittet fladt på dias med en pincet. Fyld en 10 ml sprøjte tønde med vakuum fedt; tilføje en tynd linie af vakuum fedt omkring kanterne af afsnittet for at forhindre montere medier fra kører ud over kanterne af objektglasset og hjælpe forsegle afsnit under dækglasset. Dæk sektion med monteringsmedium og et dækglas. Seal kanter dækglas med neglelak. Store glider ved 4 ° C før billeddannelse.
4. Konfokal Image Acquisition
- Tag en z-skive billede af en midterste Fucci klumpformet sektion ved hjælp af en 10Xeller 20X objektiv som tidligere beskrevet 7. Sørg for, at nogen overlapning eller krydstale opstår mellem Kusabira Orange2 og Azami Green. Hvis man sammenligner billedanalyse mellem flere sfæroide sektioner, at holde laser magt og andre indstillinger på samme mellem prøverne.
5. Hoechst Dye Diffusion analyse for Flow Sortering
- Overfør levende sfæroider (3-5 dage efter podning agarose) til et 15 ml rør. Lad sfæroider tyngdekraften løse til bunden af røret. Flere sfæroider kan farves per rør. Ca. 20 sfæroider er nødvendige for at opnå tilstrækkelig celleantal til flowcytometri.
- Fjern overskydende medie og tilsæt 1 ml 10 uM Hoechst fortyndet i normalt medium. Inkuber sfæroider ved 37 ° C i ca. 1 time. Brug blide flicking at resuspendere sfæroiderne en eller to gange under inkubation.
Bemærk: Inkubationstiden kan varieres til at ændre, hvor langt Hoechst farvestof trænger ind i sfæroider. Dette vil variere baseret påsfæroiden størrelse, densitet og cellelinie. For nogle store / tætte sfæroider kan der være en maksimal penetration farvestof, der er mindre end 100%. - Vask sfæroiderne forsigtigt med 5 ml HBSS ved hjælp af tyngdekraften bundfældning.
- Valgfrit: For billeddannelse af farvestof penetration: Fix sfæroider med 10% neutral bufret formalin i mindst 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Forbered vibratome sektioner, montere på dias og billede på konfokale som beskrevet i trin 3 og 4 ovenfor.
- For at fremstille celler til flowcytometri, Trypsinisér sfæroider med 1 ml 0,05% trypsin / EDTA ved 37 ° C i ca. 30 min med bladrer hver 10 min at bryde sfæroider hinanden.
Bemærk: Sfæroider er vanskelige at komme ind enkelt cellesuspension, kan være nødvendigt at optimerede betingelser. Levedygtighed C8161 4 dage gamle sfæroider efter denne proces er ca. 95%. - Farv cellerne med en nær-infrarød levende / døde plet ifølge producentens protokol. Vask med HBSS derefter fix med 1ml 10% neutral bufret formalin i ca. 30 min. Celler kan opbevares i HBSS ved 4 ° C i adskillige dage før flow analyse.
6. flowcytometri Analyse af Hoechst Stained Fucci Sfæroider
- Sørg celler er ikke klumpet sammen ved at føre dem gennem en celle si. Resuspender Hoechst farvede Fucci sfæroider i iskold FACS vask (PBS med 5% føtalt kalveserum) ved en koncentration på 1-5 x 10 6 celler / ml. Overfør 200 ul prøve til 5 ml rundbundede rør.
- Forbered følgende enkelte farve kontrolprøver som beskrevet i 6.1: un-farvede melanom celler; adhærente melanomceller farvet med 10 pM Hoechst i 1 time; Azami Green kun udtrykker melanomceller; og Kusabira Orange kun udtrykke melanom celler.
Bemærk: Enkelte farve kontrol kan fikseret i formalin og opbevares i FACS vask med 0,1% natriumazid ved 4 ° C i uger eller endda måneder. - Kør enkeltcellesuspensioner ona flowcytometri analyseapparat med passende lasere og enkelt farve / ufarvede kontroller som tidligere beskrevet 7,16.
- Brug kommerciel cytometri software som FlowJo at analysere den indre vs. ydre sfæroide celler som følger:
- Fjern snavs ved gating på de vigtigste celle populationen i Forward spredt lys (FSC) vs. Side spredt lys (SSC).
- Fjern dubletter ved gating på enkelte celler ved hjælp af FSC (Area) vs. FSC (Højde)
- Gate for levende celler ved gating på live / døde lav befolkningstæthed.
- Definer Hoechst høje celler, gated baseret på det positive signal fra de vedhængende celler farvet med Hoechst, som "ydre" celler.
- Definer Hoechst lave eller negative celler, gated baseret på signalet fra den ikke-farvet kontrol, som "indre" celler.
- Efter gating for de indre og ydre populationer, kan celler yderligere gated for Fucci rød (G1), gul (tidlig S), grøn (S / G2 / M) eller negative (tidlig G1).
Bemærk: Compensation ved hjælp af de enkelte farver kontrol kan kræves til korrekt definere Fucci rød, gul, grøn og negative befolkninger.
- Når analysen er optimeret og Hoechst penetration valideret via konfokal mikroskopi, køre celler uden fastsættelse på en flow-celle sorteringsanlæg som tidligere beskrevet 7,16 til yderligere analyse af levende celler delpopulationer.
7. billedanalyse af Fucci klumpformet Sektioner
- Åben software, f.eks. Volocity, vælg Kvantificering KUN konfiguration.
- Opret et nyt bibliotek. Importer Fucci klumpformet konfokale billedfil i softwaren ved at trække den rå datafil fra konfokale ind i biblioteket. Alternativt kan du bruge Filer> Importer kommandoen.
- Gå til fanen målinger for at opbygge et billede analyseprotokol. Protokollen er opbygget ved at trække og slippe de relevante kommandoer i den rigtige rækkefølge som følger i protokollen vinduet.
- Find objECTS i den grønne kanal: Træk find objekter kommandoen (findes i "Finding«) i protokol-vinduet, skal du vælge den korrekte kanal i finder objekter protocol.Add en åben kommando (findes i »behandling«), så en særskilt rørende objekter kommando (findes i 'Behandler' - det vil adskille celler). Udeluk objekter ved størrelse <50 um (findes i "Filtrering" - dette vil udelukke små ikke-cellulære objekter).
Bemærk: variabler som finder objekter tærsklen, antal åbne iterationer til størrelsen af objekter adskilles og størrelsen af objekter at udelukke skal manuelt optimeret indtil objektet masker til billedet. - Find objekter i den røde kanal: Gentag finde objekter som ovenfor for den røde kanal. Kan være nødvendigt at blive justeret separat grønne og røde protokoller.
Bemærk: På grund af kerner er i G2, grønne kerner er ofte lidt større. - Bekræft genstande fundet er korrekte: Bekræft røde og grønne objekter matcherrøde og grønne kerner i billedet ved at slukke og på de grønne og røde kanaler (ved hjælp af skjule eller vise kanal kommando) under visning af de røde og grønne masker fundet af protokollen. Feedback muligheder (Målinger> Feedback optioner) kan anvendes til at modificere udseendet af genstanden masker.
- Find gule objekter (tidlig S-fase celler): For at finde gule celler, tilføj en Intersect rød med grønne celler Kommando (findes i "kombinere"). Udeluk objekter ved størrelse (<50 um, der findes i 'Filtrering ") for at udelukke enhver lille ikke-cellulære genstande.
- Find udelukkende røde objekter (G1 fase celler): At finde udelukkende røde kerner, trække de gule celler fra de røde blodlegemer (som findes i "kombinere"). Udeluk objekter efter størrelse <50 um, (findes i "Filtrering") for at fjerne eventuelle små ikke-cellulære objekter skabt.
- Find udelukkende grønne objekter (S / G2 / M fase celler): Gentag for den grønne kanal for at finde udelukkende grøn.
Ingente: Hvis der stadig ikke-cellulære genstande tilbage, et filter population kommando kan tilføjes til den eksklusive grønne eller Exclusive røde protokoller (findes i "Filtrering") kun at beholde objekter med en formfaktor større end 0,25. Dette vil fjerne ikke-cirkulære objekter. - Find den klumpformet omrids: Find klumpformet skitse ved hjælp af en fund objekter kommando (findes i "Finde") med den grønne eller røde kanal (alt efter hvad har flere celler rundt i kanten af klumpformet). En langt lavere tærskel (findes i fund objekter variabler) skal bruges til at finde den klumpformet omrids i forhold til de enkelte celler.
- Brug en tæt kommando til at slutte sig til objekter (findes i »behandling«), derefter udfylde huller i objekter (findes i »behandling«), og brug derefter en fin filter (findes i "Filtrering") til at fjerne støj fra objekter. Endelig udelukker objekter efter størrelse for at fjerne mindre objekter <30.000 um (afhængigt af klumpformet størrelse).
Note: Denne protokol skal optimeres manuelt indtil klumpformet omrids er korrekte. En lysfelt billede kan også anvendes - men dette er normalt mindre præcis med en sfæroid afsnit, og en omvendt kommando (fundet i "kombinere") skal anvendes.
- Brug en tæt kommando til at slutte sig til objekter (findes i »behandling«), derefter udfylde huller i objekter (findes i »behandling«), og brug derefter en fin filter (findes i "Filtrering") til at fjerne støj fra objekter. Endelig udelukker objekter efter størrelse for at fjerne mindre objekter <30.000 um (afhængigt af klumpformet størrelse).
- Mål afstande på kerner til klumpformet omrids: måle afstande (findes i "Vedrørende") fra de gule, udelukkende grøn og udelukkende røde populationer fra cellen geometriske tyngdepunkt til kanten af klumpformet outline.To visualisere minimumsafstande, der skal ske fra celle til den nærmeste klumpformet kant, tænde show afstande i fanen relationer i feedback-optioner (Målinger> Feedback valg> relationer).
- Gem protokollen. Denne protokol kan re-anvendes på andre billeder ved hjælp af Målinger> Gendan protokol kommando.
- Opret en målinger punkt (Målinger> Lav Måling Item). Data kan analyseres ved hjælp af analysefunktioner.
- Gå til fanen analysen i målinger element. Gå til Analyse menuen (Analyse> Analyser) og analysere den mindste afstand fra cellen geometriske tyngdepunkt (rød, grøn eller gul) til klumpformet kant, sammenfattet af optælling og organiseret af befolkningen.
- At tælle antallet af celler, som findes i en vis afstand fra kanten oprette et filter (Analyse> Filter). Filteret for minimumsafstand i figur 2 er baseret på Hoechst penetration (f.eks minimumsafstand er mindre end 80 giver "ydre" befolkning). Alternativt, eksport rå data til et regneark til videre analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der er flere fremgangsmåder til fremstilling af tumor sfæroider denne protokol anvender ikke-klæbende vækst fremgangsmåde, hvor celler dyrkes på agar eller agarose 3,7,9. Figur 1 viser et eksempel på en C8161 melanom sfæroid efter 3 dage på agar. C8161 sfæroider danner almindelig størrelse sfæroider med en diameter på 500 - 600 um (middelværdi = 565, SD = 19, n = 3) efter 3 dage. Andre melanomcellelinier, der vil danne spheroids inkluderer: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (spheroids dannet med denne cellelinie er uregelmæssige og mindre tæt 19).
For at visualisere cellecyklussen af individuelle celler inden for 3D klumpformet model blev C8161 melanomceller transduceret med Fucci systemet 7,15. På grund af den store størrelse af sfæroider (op til 1 mm i diameter efter 3 dage på agarose og 24 timer vækst i kollagen til C8161), sektionering er den bedste mulighed for at visualisere celler i midten af sfæroide. Helsfæroider (levende eller faste) kan afbildes ved konfokal mikroskopi, men det konfokale billeddannelse er kun i stand til at trænge op til ca. 150 um derfor en midt optisk skive af sfæroid kan kun opnås i sfæroider med en diameter mindre end 300 um. Figur 2A, B og C viser et eksempel på et snit gennem en C8161 Fucci sfæroide. En nekrotisk kerne, omgivet af G1 standsede celler, med en gradient af prolifererende celler i de ydre lag er indlysende. At identificere og kvantificere celler baseret på deres position i klumpformet og cellecyklus status blev halvautomatisk billedanalyse udført. Figur 2D viser Fucci celle masker og klumpformet omrids, og figur 2E viser kvantificering af antallet af røde (G1) og grøn eller gul (S / G2 / M) celler som enten er mindre end 80 um fra kanten af sfæroidet (ydre celler) eller større end 80 um fra klumpformet kant (indre celler). Denne quantificatipå viser, at røde celler i G1 er stærkt beriget i det indre område af sfæroide som forventet.
For at identificere og potentielt sortere celler baseret på deres cellecyklus status og position i sfæroide blev en Hoechst farvestof diffusion assay i kombination med Fucci anvendte system. Inkubation af hele sfæroider med Hoechst farvestof resulterer i en begrænset diffusion af farvestoffet ind de ydre lag af sfæroide kan det anvendes til at separere Hoechst positive ydre lag celler fra Hoechst negative indre sfæroide celler via flowcytometri. Figur 2F viser udbredelsen af Hoechst op til ca. 80 um fra klumpformet kant. Hoechst positivitet afstand af 80 um fra kanten blev opnået ved visuel analyse af kugleformede afsnit og optimering af farvestoffet koncentration og inkubationstid, således at Hoechst penetration tæt markeret prolifererende celler i de ydre lag (som i vid udstrækning ligger mindreend 80 um fra kanten), og ikke trænge ind i G1 standset area.The inkubationstid med Hoechst kan varieres for at opnå dybere eller mere overfladisk penetrering. Et eksempel på varierende Hoechst penetration over tid i demonstreret i figur 3. Figur 4A viser et eksempel på gating for Hoechst høje og lave populationer, mens figur 4C og D viser gating for Fucci røde, gule og grønne celler. Figur 4B viser kvantificering for antallet af røde blodlegemer (G1) og grøn eller gul (S / G2 / M) celler enten i Hoechst høj (ydre celler) eller Hoechst lav (indre celler). Igen denne teknik viser, at røde blodlegemer i G1 er stærkt beriget i det indre område af klumpformet (jf. Lighed med billedanalysen i figur 2E).
Figur1:. C8161 Sfæroide Repræsentant fase kontrast billede taget ved 10X forstørrelse af en C8161 klumpformet efter 3 dage kultur på agar. Skala bar lig 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. C8161 Fucci Sfæroide Image Analysis Repræsentant billede af en C8161 Fucci klumpformet vibratome sektion taget ved 20X forstørrelse. Sfæroid blev dyrket i tre dage på agarose, derefter en yderligere 24 timer i collagenmatrix. Konfokal z-skive (A) Azami Green, (B) Kusabira Orange2 og (C) Fucci overlay. Scale bar = 100 um. (D) Rød og Grøn objekt masker oprettet i Volocity, med klumpformet skitse i grå. Arrække angiver 80 pm afstand fra klumpformet kant. (E) Kvantificering af antallet af røde (G1) og grøn / gul (S / G2 / M) celler i det indre (> 80 um fra klumpformet kant) og den ydre (<80 um fra klumpformet edge) regioner. Fejlsøjler repræsenterer SD fra 4 sfæroide sektioner fra 2 uafhængige eksperimenter. (F) Penetration af 10 uM Hoechst farvestof efter 1,5 timers inkubation. Skala bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. C8161 Sfæroide Hoechst Dye Diffusion Tidsforløb repræsentant konfokal z-slice billeder fra midten af hele C8161 sfæroider dyrket på agarose i 4 dage og inkuberet med 10 pM Hoechst for de angivne tidspunkter. Taget ved 10X forstørrelse. Hvide søjler angiver den omtrentlige Hoechst indtrængningsdybde. Bemærk, at C8161 agarose kugler er tættere end de C8161 sfæroiderne, der er blevet implanteret i kollagen i 24 timer i figur 2, hvilket resulterer i mindre farvestof indtrængning på det samme tidspunkt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4:. C8161 Fucci Sfæroide Flow Analysis (A) Eksempel på Hoechst høj og lav gating efter inkubation af 20 kugler med 10 pM Hoechst. Blå linje viser den uplettet kontrol, grønne linje angiver en fuldt farvet Hoechst kontrol. (B) Kvantificering af antallet af røde og grøn / gul celler i det indre (Hoechst lav) og den ydre (Hoechst høj) populations. Fejlsøjler repræsenterer SD fra 8 uafhængige forsøg (herunder både live sortering og celleanalyse fast). Eksempel på Fucci gating til det indre (C) og ydre (D) sfæroide befolkninger. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Semi-automatiseret billedanalyse identificeret sfæroid indre G1 standset region og prolifererende ydre lag. Denne metode kan anvendes på levende sfæroider ved hjælp af en optisk sektion, eller i faste sfæroide sektioner, identificere forandringer i ikke kun cellecyklussen, men markørekspression (via immunfluorescens), celledød eller cellemorfologi i disse forskellige regioner. Cellemotilitet inden for forskellige sfæroide regioner kan også kvantificeres - hvis der tilsættes levende konfokal tidsforskydningen billeddannelse sammen med en cellesporing billedanalyse trin. Kritisk til billedanalyse er, at høj kvalitet Z- skive konfokale billeder opnås, billeder i høj opløsning tillader bedre identifikation af celler. En begrænsning med billedanalyse er, at det ikke er muligt at finde hver celle korrekt, hvis kerner er for tæt, eller hvis der er for stor variation i det røde og grønne intensitet. Fucci negative celler (i begyndelsen af G1) er ikke i stand til at blive fundet med billedet analysemetode, kun røde (G1),gul (tidlig S-fase) og grøn (S / G2 / M). En anden ulempe ved den her beskrevne billedbaseret analysemetode er, at den ikke tager hensyn til det fulde 3D karakter sfæroiderne. Selvom Volocity software kan udføre 3D målinger ved hjælp z-stack billeder, konfokal mikroskopi er i stand til at trænge ind og billedet gennem hele klumpformet grund af den store størrelse. Multi-foton-billeddannelse kan anvendes til at opnå en z-stak en hel sfæroid til 3D målinger 7 som denne teknologi tillader gennemtrængning af op til 500 um, selv om nogle sfæroider kan stadig være for stor til at afbilde hele sfæroider via denne metode. En anden mulighed for at afbilde hele sfæroid er lys ark-baseret mikroskopi, der tillader visualisering af sfæroid fra flere vinkler og trænger op til 200 um anbragt i store sfæroider 20,21. Valg af imaging strategi kan være påvirket af sfæroidet størrelse, celle pakningstæthed og celletype.
Hoechst farvestof diffusion fremgangsmåde til adskillelse af indre og ydre celler i en flercellet sfæroid via flowcytometri blev først beskrevet i 1982 22. Denne metode bygger på den kendsgerning, at Hoechst farvestof diffunderer langsomt ind i sfæroide med de ydre celler, der farves først. Protokollen beskrevet her kombinerer Hoechst metoden med Fucci systemet 15, som ikke kun tillader separation af indre og ydre sfæroide celler, men også visualisering af Hoechst penetration med hensyn til den indre ring af G1 standsede celler. Dette muliggør nøjagtig adskillelse af G1 standset område af sfæroide. Brug af Fucci alene ikke tillader adskillelsen af de indre G1 standsede celler fra en sfæroide, eftersom de ydre prolifererende celler indeholder også celler i G1. En begrænsning er, at denne metode kun giver en rå adskillelse af sfæroid i to områder ("ydre" Hoechst positive og "indre" Hoechst negativ). Fordelen ved denne metode frem billedanalyse, er, at flav cytometri tillader flere markører, der skal testes på en gang, og fysisk adskillelse af levende celler til yderligere nedstrøms analyse såsom gen eller protein ekspression, re-dyrkning i forskellige miljøbetingelser, lægemiddelbehandlinger eller andre analyser.
Den Fucci sfæroid systemet i kombination med flowcytometri og billedanalyse tillader identifikation af en indre ring af G1 standsede celler omgiver det nekrotiske kerne og et ydre lag af prolifererende celler. Den nekrose og G1 arrest findes i midten af klumpformet skyldes mangel på ilt og næringsstoffer, og udvikler sig som sfæroiden vokser i størrelse. Tidligere har vi og andre viste co-lokalisering af pimonidazole hypoxi markering med G1 standset klumpformet center 7,23. Vi demonstrerer også, at spredningen sker i høj grad inden for ca. 100 um fra kanten af klumpformet. Dette matcher tidligere undersøgelser i sphæroider 12,23,24, og også korrelerer med distance af prolifererende celler fra nærmeste kar in vivo 25,26.
En alternativ fremgangsmåde, der kan anvendes til at adskille celler på basis af deres position i sfæroid til flowcytometri eller andre analyser er sekventiel trypsinisering 24,27. Ved denne fremgangsmåde successive "skaller" i sfæroid fjernes ved korte, sekventielle inkubationsperioder med trypsin ved lave temperaturer. Men ved hjælp af denne metode er det mere vanskeligt at fastslå den nøjagtige størrelse af den ydre skal (i um tykkelse), der er fjernet i forhold til Hoechst farvestof diffusion fremgangsmåde, hvor Hoechst penetration kan visualiseres direkte og måles.
Adskillelse af "indre" og "ydre" celler ved farvestof diffusion og / eller billedanalyse kan udvides til studier af Fucci tumorxenografter i mus. Men til analyse af cellecyklussen in vivo, tilstedeværelsen af vaskulatur bør også være taken i betragtning, som celler i en tumor kan være i stand til at få adgang til ilt og næringsstoffer fra kar i de centrale regioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
- Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
- Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
- Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
- Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
- Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
- Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
- Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
- Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
- Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
- Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
- Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
- Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
- Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
- Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
- Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
- Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
- Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).
