Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Imaging- और फ्लो के आधार पर सेल की स्थिति का विश्लेषण और 3 डी मेलेनोमा spheroids में कोशिका चक्र

Published: December 28, 2015 doi: 10.3791/53486
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, *1,4,5, *1,3,5
1The Centenary Institute, 2Sydney Medical School, University of Sydney, 3The University of Queensland Diamantina Institute, Translational Research Institute, The University of Queensland, 4Department of Dermatology, Royal Prince Alfred Hospital, 5Discipline of Dermatology, University of Sydney
* These authors contributed equally

Introduction

बहुकोशिकीय 3 डी spheroids हालांकि यह है कि वे कई ठोस कैंसर के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में अधिक आम उपयोग में आ गए हैं कि हाल ही में है, दशकों के लिए एक ट्यूमर मॉडल के रूप में जाने जाते हैं। वे तेजी से जटिल, खर्चीला और समय लेने वाली विवो मॉडल में और सरल, कम लागत 2 डी monolayer मॉडल 1-6 के बीच एक मध्यस्थ के रूप में उच्च throughput दवाओं की खोज स्क्रीन में इस्तेमाल किया जा रहा है। 2 डी संस्कृति में अध्ययन अक्सर विवो में दोहराया जा करने में असमर्थ हैं। कैंसर के कई प्रकारों में से अंडाकार आकृति मॉडल विकास विशेषताओं, दवा संवेदनशीलता, दवा प्रवेश, सेल सेल बातचीत, ठोस ट्यूमर 6-11 इन विवो में देखा जाता है कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों और नेक्रोसिस के विकास के प्रतिबंधित उपलब्धता की नकल करने में सक्षम हैं। Spheroids अंडाकार आकृति 7 की परिधि में एक परिगलित कोर, कोर के आसपास के एक मौन या G1 गिरफ्तार किया क्षेत्र, और proliferating कोशिकाओं का विकास। इन क्षेत्रों के विकाससेल घनत्व, प्रसार दर और अंडाकार आकृति 12 के आकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। यह इन विभिन्न उप-क्षेत्रों में देखा सेलुलर विविधता कैंसर के उपचार प्रतिरोध 13,14 में योगदान कर सकते धारणा रही है कि। इसलिए इन क्षेत्रों में कोशिकाओं का विश्लेषण करने की क्षमता अलग से समझ ट्यूमर दवा प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है।

सेल चक्र 15 के विभिन्न चरणों में अपमानित कर रहे हैं जो Cdt1 और geminin के फ्लोरोसेंट टैगिंग, - और हरे रंग (एजी Azami ग्रीन) - प्रतिदीप्ति ubiquitination सेल चक्र सूचक (FUCCI) प्रणाली लाल (को Kusabira नारंगी) पर आधारित है। इस प्रकार सेल नाभिक जल्दी एस में पीले, G1 में लाल और एस / जी 2 / एम चरण में हरे रंग दिखाई देते हैं। हम यहाँ दो पूरक विधियों का वर्णन दोनों कोशिकाओं G1 के आरोप में गिरफ्तार केंद्र या बाहरी proliferatin में रहते हैं कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर या परख cytometry एक डाई प्रसार प्रवाह के उपयोग के साथ-साथ, कोशिका चक्र की पहचान करने के लिए FUCCI का उपयोग करजी अंगूठी, और अंडाकार आकृति के किनारे से व्यक्ति की कोशिकाओं की दूरी। या / और लक्षित चिकित्सा की उपस्थिति में समय की विस्तारित अवधि के लिए G1 गिरफ्तारी में रहने के लिए सक्षम हैं, और फिर से कर सकते हैं इन विधियों हम अंडाकार आकृति के केंद्र में hypoxic क्षेत्रों में है कि मेलेनोमा कोशिकाओं का प्रदर्शन किया, जहां हमारे पिछले प्रकाशन, में विकसित किए गए अधिक अनुकूल परिस्थितियों 7 उठता है जब सेल चक्र में प्रवेश।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FUCCI पारगमन और सेल संस्कृति

  1. FUCCI पारगमन
    1. स्थिरतापूर्वक FUCCI व्यक्त सेल लाइनों बनाएँ पहले 7 के रूप में वर्णित lentivirus के सह-पारगमन का उपयोग कर mKO2-hCdt1 (30-120) और पत्रिका-hGem (1-100) 15 निर्माण करती है।
      नोट: FUCCI प्रणाली अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है।
    2. एकल कोशिका छँटाई द्वारा उज्ज्वल प्रतिदीप्ति के साथ उप क्लोन उत्पन्न। एक 96 अच्छी तरह से थाली में प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई द्वारा एजी और KO (पीला) दोनों के लिए सकारात्मक क्रमबद्ध एकल कक्षों के रूप में पहले से 7,16 का वर्णन किया।
  2. मेलेनोमा सेल संस्कृति
    1. संस्कृति C8161 मानव मेलेनोमा कोशिकाओं के रूप में पहले से 7,17 का वर्णन किया।

2. 3 डी उपगोल गठन (के रूप में पहले 3,9 वर्णित)

  1. Agarose प्लेट तैयारी
    1. हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) या फॉस्फेट buffere की 100 मिलीलीटर में 1.5% agarose (या महान अगर) भंगघूमता के साथ 3-5 मिनट के लिए माइक्रोवेव में उबलते द्वारा घ खारा (पीबीएस)। Agarose पूरी तरह से भंग कर रहा है सुनिश्चित करें।
    2. इसके तत्काल बाद एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर एक फ्लैट तली 96 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट करने के लिए अच्छी तरह से प्रति agarose समाधान के 100 μl बांटना।
      नोट: agarose, समय की एक छोटी अवधि के बाद सुझावों में जमना सकता है और अधिक से अधिक एक agarose प्लेट बनाने, तो यह समस्या युक्तियों प्लेटों के बीच परिवर्तित किया जाना चाहिए काबू पाने के लिए।
    3. कम से कम 1 घंटे के लिए agarose कड़ा करने के लिए एक फ्लैट सतह पर 96 अच्छी तरह से थाली छोड़ दें।
  2. Agarose पर सेल तैयारी और ओवरले
    1. एक T75 फ्लास्क में लगभग 80% confluency करने के लिए कोशिकाओं को विकसित। HBSS के 10 मिलीलीटर के साथ धोएं।
    2. सामान्य माध्यम के 10 मिलीलीटर में 0.05% / trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) और resuspend के 1.5 मिलीलीटर का उपयोग कोशिकाओं को अलग करें।
    3. एक hemocytometer 18 या अन्य स्वचालित मतगणना विधि का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
    4. आदर्श में 25,000 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए कोशिकाओं Resuspendअल मध्यम।
    5. अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं के अंतिम संख्या के लिए सेल निलंबन के 200 μl के साथ agarose कुओं ओवरले।
    6. सेल कल्चर इनक्यूबेटर (5% सीओ 2 और 37 सी) के लिए वापसी प्लेटों पर लगभग 3 दिनों spheroids के रूप में।
      नोट: एक अंडाकार आकृति के रूप में करने में लगने वाले समय के लिए अलग सेल लाइनों के बीच होती है। कुछ सेल लाइनों पर सभी इस पद्धति का उपयोग spheroids फार्म नहीं है।
    7. एक 4X उद्देश्य और एक चरण विपरीत फिल्टर का उपयोग कर एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ छवि अंडाकार आकृति आकृति विज्ञान। सफलतापूर्वक spheroids कॉम्पैक्ट, मोटे तौर पर गोलाकार सेल समुच्चय का उत्पादन होगा, और अच्छी तरह प्रति केवल एक अंडाकार आकृति नहीं होनी चाहिए कि रूपों एक सेल लाइन।
      नोट: वैकल्पिक: spheroids का गठन किया है एक बार, वे विकास और आक्रमण 3,7,17 ​​के आगे के विश्लेषण के लिए कोलेजन या अन्य मैट्रिक्स में प्रत्यारोपित किया जा सकता है। कोलेजन spher के लिए पर्याप्त भंग कर रहा है जब तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिलीग्राम / एमएल collagenase के 500 μl के साथ व्यवहार, मज्जा से spheroids निकालने के लिएoids मीडिया (लगभग 30 मिनट) में मुक्त आने के लिए। धीरे से एक 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग spheroids हटा दें।
    8. प्रोटोकॉल के लिए / इमेजिंग (कोलेजन से पृथक या agarose पर 3-5 दिनों के लिए हो तो) 10% तटस्थ बफर formalin में तय spheroids (चेतावनी: Formalin एक धूआं अलमारी में इस्तेमाल किया जाना चाहिए) कमरे के तापमान पर कम से कम 2 घंटे के लिए (आरटी) 4 डिग्री सेल्सियस पर, या रात (ओ / एन)। Spheroids कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर HBSS में संग्रहित किया जा सकता है।

3. उपगोल Vibratome सेक्शनिंग

  1. एक माइक्रोवेव में एक 500 मिलीलीटर कांच की बोतल में HBSS के 100 मिलीलीटर में कम पिघलने बिंदु agarose के 5 ग्राम भंग। घूमता के साथ एक मध्यम गर्मी की स्थापना का प्रयोग करें। चेतावनी: दबाव जारी किया जा सकता है, ताकि समाधान उबलते जब ढीला ढक्कन रखें। गर्म कांच की बोतल से निपटने जब जलने से हाथ की रक्षा करने के लिए सुरक्षात्मक heatproof दस्ताने का प्रयोग करें।
  2. Agarose थोड़ा ठंडा होने तक प्रतीक्षा करें - तो बोतल हाथ जल के बिना छुआ जा सकता है।
  3. Approxima डालोएक कल्टर काउंटर कप या इसी तरह के प्लास्टिक मोल्ड के तल में agarose की tely 2 मिलीलीटर। इसके तत्काल बाद तरल संभव की छोटी मात्रा में 1 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग (धारा 2.2.8 देखें) एक निश्चित अंडाकार आकृति महाप्राण। Agarose के लिए अंडाकार आकृति जोड़ें। (10) कुछ spheroids कप प्रति जोड़ा जा सकता है।
  4. Agarose के 2 मिलीलीटर अधिक के साथ spheroids कवर। दूसरी परत जोड़ा जाता है पहले agarose सख्त से बचने के लिए जल्दी से यह मत करो।
  5. Agarose कम से कम 3 घंटे के लिए अंधेरे में आरटी पर कड़ा करने की अनुमति दें। इस बिंदु कप 2-3 से 4 डिग्री सेल्सियस पर थोड़े समय के लिए भंडारित किया जा सकता है पर HBSS के मिलीलीटर निर्जलीकरण को रोकने के लिए मढ़ा।
  6. कप से agarose निकालें। यह vibratome धातु खंड पर फिट बैठता है, और spheroids agarose के शीर्ष के करीब हैं, इसलिए है कि spheroids युक्त agarose ट्रिम। Spheroids agarose के अंदर छोटे सफेद वस्तुओं के रूप में देखा जा सकता है। सुपर ब्लॉक करने के लिए agarose गोंद।
  7. आसुत जल के साथ vibratome भरें और vibratome में ब्लॉक माउंट। ठीकvibratome कम गति (2 सेटिंग) और उच्च कंपन (8 स्थापना) का उपयोग कर 100 माइक्रोन वर्गों में कटौती करने के लिए। 16 डिग्री को काटने ब्लेड कोण सेट करें। , Vibratome पर मुड़ें vibratome प्रकाश पर बारी और 100 माइक्रोन अंडाकार आकृति वर्गों में कटौती कर रहे हैं जब तक agarose के ऊपर से वर्गों में कटौती। 24 अच्छी तरह से थाली में HBSS में कटौती अंडाकार आकृति वर्गों रखें।
  8. छवि विश्लेषण के लिए मध्यम वर्गों के लिए चुनें। चिमटी का उपयोग कर स्लाइड पर खंड फ्लैट स्थानांतरित करके स्लाइड पर माउंट वर्गों। वैक्यूम तेल के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज प्रति बैरल भरें; स्लाइड के किनारों से दूर चलने से बढ़ते मीडिया को रोकने और coverslip के तहत खंड को सील करने में मदद करने के लिए खंड के किनारों के आसपास वैक्यूम तेल की एक पतली रेखा जोड़ें। बढ़ते मध्यम और एक coverslip साथ अनुभाग को कवर। नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील। स्टोर इमेजिंग से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर स्लाइड।

4. confocal छवि अधिग्रहण

  1. एक 10X का उपयोग कर एक मध्यम FUCCI अंडाकार आकृति खंड की एक Z-टुकड़ा छवि ले लोया 20X उद्देश्य के रूप में पहले 7 का वर्णन किया। कोई ओवरलैप या crosstalk Kusabira Orange2 और Azami ग्रीन के बीच होता है सुनिश्चित करें। कई अंडाकार आकृति वर्गों के बीच छवि विश्लेषण की तुलना करते हैं, तो लेजर बिजली और अन्य सेटिंग्स नमूनों के बीच में ही रहते हैं।

प्रवाह छंटाई के लिए 5. Hoechst डाई प्रसार परख

  1. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब लाइव spheroids (agarose बोने के बाद 3-5 दिन) स्थानांतरण। Spheroids गुरुत्वाकर्षण ट्यूब के नीचे करने के लिए तय है। कई spheroids ट्यूब प्रति कलंकित किया जा सकता है। लगभग 20 spheroids प्रवाह cytometry के लिए पर्याप्त सेल नंबर हासिल करने के लिए आवश्यक हैं।
  2. अतिरिक्त मध्यम निकालें और सामान्य मध्यम में पतला 10 माइक्रोन Hoechst के 1 मिलीलीटर जोड़ें। लगभग 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर spheroids सेते हैं। गर्मी के दौरान एक या दो बार spheroids resuspend कोमल flicking का प्रयोग करें।
    नोट: ऊष्मायन समय Hoechst डाई spheroids में प्रवेश कितनी दूर बदलने के लिए अलग किया जा सकता है। इस के आधार पर अलग अलग होंगेअंडाकार आकृति आकार, घनत्व और सेल लाइन। कुछ बड़े / घने spheroids के लिए कम से कम 100% है कि एक अधिकतम डाई प्रवेश हो सकता है।
  3. गुरुत्वाकर्षण निपटाने का उपयोग कर HBSS के 5 मिलीलीटर के साथ धीरे spheroids धो लें।
    1. वैकल्पिक: डाई प्रवेश की इमेजिंग के लिए: 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन में कम से कम 2 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर formalin साथ spheroids को ठीक करें। , Vibratome वर्गों तैयार ऊपर चरण 3 और 4 में वर्णित के रूप में confocal पर स्लाइड और छवि पर माउंट।
  4. अलग spheroids तोड़ने के लिए हर 10 मिनट flicking के साथ लगभग 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.05% / trypsin EDTA के 1 मिलीलीटर के साथ cytometry, Trypsinize spheroids प्रवाह के लिए कोशिकाओं को तैयार करने के लिए।
    नोट: Spheroids एकल कक्ष निलंबन में पाने के लिए मुश्किल हो जाता है, की स्थिति अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है। इस प्रक्रिया के बाद C8161 4 दिन पुरानी spheroids के व्यवहार्यता लगभग 95% है।
  5. निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार एक के पास अवरक्त लाइव / मृत दाग के साथ कोशिकाओं दाग। तो एक साथ तय HBSS के साथ धोलगभग 30 मिनट के लिए 10% तटस्थ बफर formalin की मिलीलीटर। प्रकोष्ठों प्रवाह विश्लेषण करने से पहले कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर HBSS में संग्रहित किया जा सकता है।

Hoechst सना हुआ FUCCI spheroids के 6. फ्लो विश्लेषण

  1. सुनिश्चित करें कोशिकाओं को एक सेल झरनी के माध्यम से उन्हें गुजर द्वारा एक साथ clumped नहीं कर रहे हैं। Hoechst 1-5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में (5% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पीबीएस) बर्फ के ठंडे FACS धोने में FUCCI spheroids दाग ​​Resuspend। दौर 5 मिलीलीटर नीचे ट्यूबों के लिए नमूने के 200 μl स्थानांतरण।
  2. 6.1 में वर्णित के रूप में निम्नलिखित एकल रंग नियंत्रण के नमूने तैयार: संयुक्त राष्ट्र के दाग मेलेनोमा कोशिकाओं; पक्षपाती मेलेनोमा कोशिकाओं 1 घंटे के लिए 10 माइक्रोन Hoechst के साथ दाग; Azami ग्रीन केवल मेलेनोमा कोशिकाओं को व्यक्त; और Kusabira ऑरेंज केवल मेलेनोमा कोशिकाओं को व्यक्त।
    नोट: एकल रंग नियंत्रण हफ्तों या महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.1% सोडियम azide से धो लें formalin में तय की और FACS में संग्रहित किया जा सकता है।
  3. भागो एकल कक्ष निलंबन ओपहले के रूप में उपयुक्त लेजर और ही रंग / बेदाग नियंत्रण के साथ विश्लेषक cytometry ना प्रवाह 7,16 का वर्णन किया।
  4. इस प्रकार के रूप बाहरी अंडाकार आकृति कोशिकाओं बनाम भीतरी विश्लेषण करने के लिए इस तरह के FlowJo के रूप में वाणिज्यिक cytometry के सॉफ्टवेयर का उपयोग करें:
    1. फॉरवर्ड बिखरे हुए प्रकाश की ओर बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) बनाम (एफएससी) में मुख्य सेल की आबादी पर gating से मलबे को हटा दें।
    2. एफएससी बनाम एफएससी (एरिया) (ऊंचाई) का उपयोग कर एकल कक्षों पर gating द्वारा दोहरी हटाये
    3. लाइव / मृत कम जनसंख्या पर gating द्वारा जीवित कोशिकाओं के लिए गेट।
    4. Hoechst "बाहरी" कोशिकाओं के रूप में Hoechst के साथ दाग पक्षपाती कोशिकाओं से सकारात्मक संकेत के आधार पर gated उच्च कोशिकाओं, परिभाषित करें।
    5. "आंतरिक" कोशिकाओं के रूप में, संयुक्त राष्ट्र के दाग नियंत्रण से संकेत के आधार पर गेटेड Hoechst कम या नकारात्मक कोशिकाओं, परिभाषित करें।
    6. भीतरी और बाहरी आबादी के लिए gating के बाद, कोशिकाओं को आगे FUCCI हरे, लाल (G1), पीला (प्रारंभिक एस), (एस / जी 2 / एम) या नकारात्मक (प्रारंभिक G1) के लिए gated जा सकता है।
      नोट: सीएकल रंग नियंत्रण का उपयोग कर ompensation ठीक से FUCCI लाल, पीले, हरे और नकारात्मक आबादी को परिभाषित करने की आवश्यकता हो सकती है।
  5. परख अनुकूलित और Hoechst पैठ confocal माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मान्य किया गया है एक बार, पहले से जीवित कोशिका उप आबादी के आगे के विश्लेषण के लिए 7,16 वर्णित के रूप में एक प्रवाह सेल सॉर्टर पर फिक्सिंग बिना कोशिकाओं को चलाते हैं।

FUCCI उपगोल धारा 7. छवि विश्लेषण

  1. खुला सॉफ्टवेयर जैसे। Volocity, Quantitation केवल विन्यास चुनें।
  2. एक नए पुस्तकालय बनाएँ। पुस्तकालय में कोंफोकल से कच्चे डेटा फ़ाइल को खींचकर सॉफ्टवेयर में FUCCI अंडाकार आकृति confocal छवि फ़ाइल आयात करें। वैकल्पिक रूप से, फ़ाइल> आयात कमांड का उपयोग करें।
  3. एक छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल का निर्माण करने के लिए माप टैब पर जाएँ। प्रोटोकॉल खींचने और प्रोटोकॉल खिड़की में इस प्रकार के रूप में सही क्रम में उचित आदेशों को छोड़ने के द्वारा बनाया गया है।
  4. Obj खोजेंECTS ग्रीन चैनल में: मिल जाए, प्रोटोकॉल विंडो में ('खोज' में पाया) आदेश वस्तुओं खींचें ('प्रसंस्करण' में पाया जाता है) एक खुला आदेश protocol.Add मिल वस्तुओं में सही चैनल, तो एक अलग छू वस्तुओं का चयन कमांड ('प्रसंस्करण' में पाया - यह कोशिकाओं को अलग किया जाएगा)। आकार <50 माइक्रोन से वस्तुओं को बाहर निकालें ('छनन' में पाया - इस छोटे गैर सेलुलर वस्तुओं को बाहर निकाल देगा)।
    नोट: खोजने सीमा, खुले पुनरावृत्तियों की संख्या वस्तुओं चर, जैसे वस्तुओं के आकार अलग होना और वस्तु मास्क छवि से मेल जब तक बाहर करने के लिए वस्तुओं के आकार मैन्युअल अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  5. लाल चैनल में वस्तुओं का पता लगाएं: लाल चैनल के लिए ऊपर के रूप में वस्तुओं को खोजने दोहराएँ। हरे और लाल प्रोटोकॉल अलग से समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है।
    नोट: नाभिक G2 में होने की वजह से, हरी नाभिक अक्सर थोड़ा बड़ा कर रहे हैं।
  6. पाया वस्तुओं सही कर रहे हैं की पुष्टि करें: लाल की पुष्टि करें और हरे रंग की वस्तुओं मैचबंद करके और प्रोटोकॉल के द्वारा पाया लाल और हरे रंग मास्क प्रदर्शित करते हुए (छिपाने या दिखाने चैनल आदेश का उपयोग), हरे और लाल चैनलों पर छवि में लाल और हरे रंग के नाभिक। प्रतिक्रिया विकल्प (माप> प्रतिक्रिया विकल्प) वस्तु मास्क की उपस्थिति को संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  7. पीले रंग की वस्तुओं (प्रारंभिक एस चरण कोशिकाओं) का पता लगाएं, पीले रंग की कोशिकाओं को खोजने ('का मेल' में पाया) आदेश हरी कोशिकाओं के साथ लाल एक दूसरे को काटना को जोड़ने के लिए। किसी भी छोटे गैर सेलुलर वस्तुओं को बाहर करने ('छनन' में पाया <50 माइक्रोन) आकार से वस्तुओं को बाहर निकालें।
  8. (G1 चरण कोशिकाओं) विशेष रूप से लाल वस्तुओं का पता लगाएं: ('का मेल' में पाया) लाल कोशिकाओं से पीले रंग की कोशिकाओं, विशेष रूप से लाल नाभिक मिल घटाना करने के लिए। बनाई गई किसी भी छोटे गैर सेलुलर वस्तुओं को दूर करने के लिए ('छनन' में पाया जाता है) आकार <50 माइक्रोन, द्वारा वस्तुओं को बाहर निकालें।
  9. विशेष रूप से हरे रंग की वस्तुओं (एस / जी 2 / एम चरण कोशिकाओं) का पता लगाएं: विशेष रूप से हरे रंग लगाने के लिए ग्रीन चैनल के लिए दोहराएँ।
    नहींते: अभी भी शेष गैर सेलुलर वस्तुओं रहे हैं, तो एक फिल्टर आबादी आदेश केवल बनाए रखने के लिए ('छनन' में पाया) विशेष हरे या अनन्य लाल प्रोटोकॉल के लिए जोड़ा जा सकता है 0.25 की तुलना में अधिक से अधिक एक आकार कारक के साथ वस्तुओं। इस गैर-गोल वस्तुओं को हटा देगा।
  10. अंडाकार आकृति रूपरेखा खोजें: एक खोज का उपयोग कर अंडाकार आकृति रूपरेखा का पता लगाएं (अंडाकार आकृति के किनारे के आसपास अधिक कोशिकाओं है, जो भी) हरे या लाल चैनल के साथ ('खोज' में पाया) आदेश वस्तुओं। एक बहुत कम सीमा (खोजने में पाया चर वस्तुओं) व्यक्तिगत कोशिकाओं की तुलना में अंडाकार आकृति रूपरेखा खोजने के लिए इस्तेमाल करने की आवश्यकता होगी।
    1. तब वस्तुओं से शोर को दूर करने के लिए ('छनन' में पाया जाता है) ठीक एक फिल्टर का उपयोग करें, तो ('प्रसंस्करण' में पाया जाता है) वस्तुओं में छेद भरने ('प्रसंस्करण' में पाया जाता है) वस्तुओं में शामिल होने के लिए एक करीबी आदेश का उपयोग करें। अंत में, छोटी वस्तुओं (अंडाकार आकृति आकार पर निर्भर करता है) <30,000 माइक्रोन दूर करने के आकार से वस्तुओं को बाहर।
      ध्यान दें: इस प्रोटोकॉल अंडाकार आकृति रूपरेखा सटीक है जब तक मैन्युअल अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता होगी, लेकिन इस आम तौर पर कम सटीक एक अंडाकार आकृति अनुभाग, और ('का मेल' में पाया जाता है) एक औंधा कमांड के साथ है - एक brightfield छवि भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
  11. से होना चाहिए, जो कम से कम दूरी की कल्पना outline.To अंडाकार आकृति के किनारे करने के लिए सेल केन्द्रक से, पीले विशेष रूप से हरे और विशेष रूप से लाल आबादी से ('से संबंधित' में पाया) उपाय दूरी: अंडाकार आकृति रूपरेखा के नाभिक की दूरी को मापने निकटतम अंडाकार आकृति किनारे करने के लिए सेल, प्रतिक्रिया विकल्प (माप> प्रतिक्रिया विकल्प> रिश्ते) में रिश्तों टैब में शो दूरी पर बारी।
  12. प्रोटोकॉल को बचाओ। इस प्रोटोकॉल माप का उपयोग अन्य छवियों के लिए फिर से लागू किया जा सकता है> प्रोटोकॉल आदेश पुनर्स्थापित।
  13. एक माप आइटम बनाएँ (माप> मापन मद मेक)। डेटा विश्लेषण का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता हैकार्य करता है।
    1. माप मद में विश्लेषण टैब पर जाएँ। विश्लेषण मेनू पर जाएँ (विश्लेषण> विश्लेषण) और अंडाकार आकृति किनारे करने के लिए (हरे या पीले, लाल,) सेल केन्द्रक, गिनती से संक्षेप और जनसंख्या द्वारा आयोजित से न्यूनतम दूरी का विश्लेषण।
    2. किनारे से एक निश्चित दूरी पर पाया कोशिकाओं की संख्या गिनने के लिए एक फिल्टर (विश्लेषण> फिल्टर) बना। चित्रा 2 में कम से कम दूरी के लिए फिल्टर (जैसे न्यूनतम दूरी 80 "बाहरी" जनसंख्या देता है, कम से कम है) Hoechst प्रवेश पर आधारित है। वैकल्पिक रूप से, आगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए निर्यात कच्चे डेटा।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ट्यूमर spheroids उत्पादन के कई तरीके इस प्रोटोकॉल कोशिकाओं अगर या agarose 3,7,9 पर सुसंस्कृत हैं, जहां गैर पक्षपाती विकास विधि का उपयोग करता है, कर रहे हैं। 1 अगर पर 3 दिनों के बाद एक C8161 मेलेनोमा अंडाकार आकृति का एक उदाहरण से पता चलता है। C8161 spheroids 500 की एक व्यास के साथ नियमित रूप से आकार spheroids फार्म - 600 माइक्रोन के बाद 3 दिन (= 565, एसडी = 19, एन = 3 मतलब है)। Spheroids बनेगी कि अन्य मेलेनोमा सेल लाइनों में शामिल हैं: WM793, WM983C, WM983B, WM164, 1205lu (इस सेल लाइन के साथ बनाई spheroids अनियमित और 19 कम घना) कर रहे हैं।

3 डी अंडाकार आकृति मॉडल के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के कोशिका चक्र कल्पना करने के क्रम में, C8161 मेलेनोमा कोशिकाओं FUCCI सिस्टम 7,15 साथ transduced थे। कारण spheroids के बड़े आकार के लिए (अप agarose पर 3 दिनों के बाद व्यास में 1 मिमी और C8161 के लिए कोलेजन में 24 घंटा वृद्धि करने के लिए), सेक्शनिंग अंडाकार आकृति के केंद्र में कोशिकाओं को दृश्यमान करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प है। पूरे(लाइव या फिक्स्ड) spheroids confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है, तथापि confocal इमेजिंग इसलिए अंडाकार आकृति के एक मध्यम ऑप्टिकल टुकड़ा केवल 300 माइक्रोन से छोटे एक व्यास के साथ spheroids में प्राप्त किया जा सकता है, लगभग 150 माइक्रोन तक के घुसना करने में सक्षम है। चित्रा 2A, बी और सी के एक C8161 FUCCI अंडाकार आकृति के माध्यम से एक अनुभाग का एक उदाहरण से पता चलता है। बाहरी परत में कोशिकाओं proliferating की एक ढाल के साथ G1 गिरफ्तार कोशिकाओं से घिरा हुआ एक परिगलित कोर, स्पष्ट है। अंडाकार आकृति और सेल चक्र स्थिति में उनकी स्थिति के आधार पर कोशिकाओं की पहचान करने और यों, अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण चित्रा 2 डी, FUCCI सेल मास्क और अंडाकार आकृति रूपरेखा से पता चलता है। प्रदर्शन किया गया था और चित्रा 2 ई लाल की संख्या की मात्रा का ठहराव (G1) से पता चलता है और हरे या पीले रंग (एस / जी 2 / एम) कोशिकाओं या तो अंडाकार आकृति (बाहरी कोशिकाओं) या अंडाकार आकृति बढ़त (भीतरी कोशिकाओं) से अधिक से अधिक से अधिक 80 माइक्रोन के किनारे से कम से कम 80 माइक्रोन। इस quantificatiउम्मीद के रूप में G1 में लाल कोशिकाओं बहुत, अंडाकार आकृति के भीतरी क्षेत्र में समृद्ध कर रहे हैं कि शो पर।

अंडाकार आकृति में अपने सेल चक्र स्थिति और स्थिति के आधार पर कोशिकाओं की पहचान करने और संभावित को सॉर्ट करने के लिए, FUCCI प्रणाली के साथ संयोजन में एक Hoechst डाई प्रसार परख इस्तेमाल किया गया था। Hoechst डाई परिणामों के साथ पूरे spheroids के ऊष्मायन डाई का एक सीमित प्रसार में में अंडाकार आकृति की बाहरी परत, इस नकारात्मक भीतरी अंडाकार आकृति कोशिकाओं फ्लो के माध्यम से Hoechst से Hoechst सकारात्मक बाहरी परत की कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चित्रा 2 एफ लगभग 80 माइक्रोन अंडाकार आकृति किनारे से अप करने के लिए Hoechst के प्रवेश से पता चलता है। Hoechst पैठ बारीकी से काफी हद तक कम पाया जाता है, जो बाहरी परत में proliferating कोशिकाओं (चिह्नित इतना है कि किनारे से 80 माइक्रोन की Hoechst सकारात्मकता दूरी अंडाकार आकृति वर्गों और डाई एकाग्रता और ऊष्मायन समय के अनुकूलन के दृश्य विश्लेषण द्वारा प्राप्त किया गया थाकिनारे से 80 माइक्रोन) की तुलना में, और G1 में घुसना नहीं किया Hoechst के साथ area.The ऊष्मायन समय गहरी या उथले प्रवेश प्राप्त करने के लिए अलग किया जा सकता है गिरफ्तार कर लिया। चित्रा 4C और डी FUCCI लाल, पीले और हरे रंग की कोशिकाओं के लिए gating को दर्शाता है, जबकि चित्रा 3 में प्रदर्शन में समय के साथ Hoechst पैठ बदलती का एक उदाहरण है। चित्रा -4 ए, Hoechst उच्च और निम्न आबादी के लिए gating का एक उदाहरण से पता चलता है। 4B चित्रा से पता चलता है लाल (G1) की संख्या और हरे या पीले रंग (एस / जी 2 / एम) कोशिकाओं या तो Hoechst उच्च (बाहरी कोशिकाओं) में या Hoechst कम (भीतरी कोशिकाओं) के लिए मात्रा। फिर इस तकनीक G1 में लाल कोशिकाओं बहुत अंडाकार आकृति के भीतरी क्षेत्र में समृद्ध कर रहे हैं कि (सीएफ। समानता चित्रा 2 ई में छवि विश्लेषण करने के लिए) से पता चलता है।

आकृति 1
आकृति1:। C8161 उपगोल प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि अगर पर 3 दिन संस्कृति के बाद एक C8161 अंडाकार आकृति की 10X बढ़ाई लिया। स्केल बार 100 माइक्रोन के बराबर होती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। C8161 FUCCI उपगोल छवि विश्लेषण एक C8161 FUCCI के प्रतिनिधि छवि 20X बढ़ाई लिया vibratome अनुभाग अंडाकार आकृति। अंडाकार आकृति agarose पर तीन दिन, कोलेजन मैट्रिक्स में तो एक और 24 घंटे के लिए संवर्धित किया गया था। (ए) Azami ग्रीन, (बी) Kusabira Orange2 और (सी) FUCCI ओवरले के confocal जेड-टुकड़ा। स्केल बार = 100 माइक्रोन। ग्रे में अंडाकार आकृति रूपरेखा के साथ Volocity में बनाया (डी) लाल और हरे रंग की वस्तु मास्क,। अरपंक्ति अंडाकार आकृति किनारे से 80 माइक्रोन दूरी इंगित करता है। (ई) भीतरी भीतर लाल (G1) की संख्या और हरी / पीला (एस / जी 2 / एम) कोशिकाओं की मात्रा (अंडाकार आकृति किनारे से> 80 माइक्रोन) और बाहरी क्षेत्रों (अंडाकार आकृति किनारे से <80 माइक्रोन)। त्रुटि सलाखों 2 स्वतंत्र प्रयोगों से 4 अंडाकार आकृति वर्गों से एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं। 1.5 घंटे ऊष्मायन के बाद 10 माइक्रोन Hoechst डाई (एफ) प्रवेश। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। C8161 उपगोल Hoechst डाई प्रसार टाइम कोर्स पूरे C8161 के बीच में से प्रतिनिधि confocal जेड-टुकड़ा छवियों संकेत समय के लिए 4 दिन के लिए agarose पर सुसंस्कृत और 10 माइक्रोन Hoechst के साथ incubated spheroids। 10X बढ़ाई लिया। सफेद सलाखों अनुमानित Hoechst प्रवेश गहराई से संकेत मिलता है। कि C8161 agarose spheroids एक ही समय बिंदु पर प्रवेश डाई भी कम समय में जिसके परिणामस्वरूप, चित्रा 2 में 24 घंटे के लिए कोलेजन में प्रत्यारोपित किया गया है कि C8161 spheroids से सघन होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। 10 माइक्रोन Hoechst के साथ 20 spheroids के ऊष्मायन के बाद Hoechst उच्च और निम्न gating की C8161 FUCCI उपगोल प्रवाह विश्लेषण (ए) के उदाहरण। ब्लू लाइन बेदाग नियंत्रण, हरे रंग की लाइन एक पूरी तरह से दाग Hoechst नियंत्रण इंगित करता है इंगित करता है। भीतरी (Hoechst कम) और बाहरी (Hoechst उच्च) पी के भीतर लाल और हरे रंग पीला / कोशिकाओं की संख्या (बी) की मात्राopulations। त्रुटि सलाखों (लाइव छँटाई और निश्चित सेल विश्लेषण सहित दोनों) 8 स्वतंत्र प्रयोगों से एसडी प्रतिनिधित्व करते हैं। भीतरी (सी) के लिए gating FUCCI और बाहरी (डी) अंडाकार आकृति आबादी का उदाहरण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

अर्द्ध स्वचालित छवि विश्लेषण अंडाकार आकृति भीतरी G1 के आरोप में गिरफ्तार क्षेत्र की पहचान की है, और बाहरी परत proliferating। इस विधि को एक ऑप्टिकल अनुभाग का उपयोग लाइव spheroids पर इस्तेमाल किया जा सकता है, या तय अंडाकार आकृति वर्गों में, इन अलग-अलग क्षेत्रों में सेल चक्र लेकिन (इम्यूनोफ्लोरेसेंस के माध्यम से) मार्कर अभिव्यक्ति, कोशिका मृत्यु, या सेल आकृति विज्ञान न केवल में परिवर्तन की पहचान करने के लिए। अलग अंडाकार आकृति क्षेत्रों के भीतर सेल गतिशीलता भी मात्रा निर्धारित किया जा सकता है - एक सेल ट्रैकिंग छवि विश्लेषण कदम के साथ-साथ जीना confocal समय चूक इमेजिंग जोड़ा जाता है। छवि विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण उच्च गुणवत्ता Z-टुकड़ा confocal छवियों उच्च संकल्प छवियों कोशिकाओं की बेहतर पहचान की अनुमति प्राप्त कर रहे हैं। छवि विश्लेषण के साथ एक सीमा नाभिक भी घने हैं कि अगर इसे सही ढंग से हर कोशिका खोजना संभव नहीं है कि है, या लाल और हरे रंग की तीव्रता में बहुत अधिक भिन्नता है। (प्रारंभिक G1 में) FUCCI नकारात्मक कोशिकाओं, इस छवि विश्लेषण विधि, केवल लाल (G1) के साथ पाया जा करने में सक्षम नहीं हैंपीला (प्रारंभिक एस चरण) और हरी (एस / जी 2 / एम)। यहाँ वर्णित छवि के आधार पर विश्लेषण विधि से एक अन्य दोष यह है कि खाते में spheroids के पूर्ण 3 डी प्रकृति नहीं ले करता है। Volocity सॉफ्टवेयर Z ढेर छवियों का उपयोग कर 3 डी मापन का प्रदर्शन कर सकते हैं, confocal माइक्रोस्कोपी वजह से बड़े आकार के लिए पूरे अंडाकार आकृति के माध्यम से प्रवेश करने में असमर्थ है और छवि है। कुछ spheroids अभी भी इस विधि के माध्यम से छवि पूरे spheroids करने के लिए बहुत बड़ा हो सकता है, हालांकि बहु फोटॉन इमेजिंग, इस तकनीक के ऊपर माइक्रोन से 500 के प्रवेश की अनुमति देता है के रूप में 3 डी माप 7 के लिए एक पूरी अंडाकार आकृति का एक z ढेर प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। पूरे अंडाकार आकृति इमेजिंग के लिए एक अन्य विकल्प के कई कोण से अंडाकार आकृति के दृश्य की अनुमति देता है और बड़े spheroids 20,21 के अंदर 200 माइक्रोन तक के प्रवेश जो प्रकाश-पत्र के आधार पर माइक्रोस्कोपी है। इमेजिंग रणनीति का चुनाव अंडाकार आकृति आकार, सेल पैकिंग घनत्व और सेल प्रकार से प्रभावित किया जा सकता है।

Hoechst डाई diffusioफ्लो के माध्यम से एक बहुकोशिकीय अंडाकार आकृति में भीतरी और बाहरी कोशिकाओं को अलग करने के लिए N विधि पहली बार 1982 22 में वर्णित किया गया है। इस पद्धति का बाहरी कोशिकाओं पहले से सना हुआ जा रहा है साथ Hoechst डाई, अंडाकार आकृति में धीरे-धीरे diffuses कि इस तथ्य पर आधारित है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल G1 गिरफ्तार कोशिकाओं के भीतर की अंगूठी के लिए सम्मान के साथ आंतरिक और बाहरी अंडाकार आकृति कोशिकाओं की जुदाई, लेकिन यह भी Hoechst प्रवेश के दृश्य न केवल अनुमति देता है जो FUCCI प्रणाली 15, साथ Hoechst विधि को जोड़ती है। इस अंडाकार आकृति की G1 गिरफ्तार किया क्षेत्र का सही जुदाई की अनुमति देता है। बाहरी proliferating कोशिकाओं को भी G1 में सेल होते हैं यह देखते हुए कि एक अंडाकार आकृति से भीतरी G1 गिरफ्तार कोशिकाओं की जुदाई, की अनुमति नहीं है अकेले FUCCI का उपयोग करना। एक सीमा है कि इस विधि से केवल दो क्षेत्रों ("बाहरी" Hoechst सकारात्मक और "आंतरिक" Hoechst नकारात्मक) में अंडाकार आकृति के एक कच्चे जुदाई की अनुमति देता है। छवि विश्लेषण पर इस विधि का लाभ, कि चकम cytometry के कई मार्कर एक बार में परीक्षण किया जा करने की अनुमति देता है, और इस तरह के जीन या प्रोटीन अभिव्यक्ति, विभिन्न पर्यावरणीय स्थितियों, दवा उपचार या अन्य विश्लेषण में फिर से संवर्धन के रूप में आगे बहाव के विश्लेषण के लिए जीवित कोशिकाओं के भौतिक जुदाई।

फ्लो और छवि विश्लेषण के साथ संयोजन में FUCCI अंडाकार आकृति सिस्टम परिगलित कोर आसपास के G1 गिरफ्तार कोशिकाओं की एक इनर रिंग की पहचान, और proliferating कोशिकाओं के एक बाहरी परत की अनुमति देता है। अंडाकार आकृति के बीच में पाया गल जाना और G1 गिरफ्तारी ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कमी की वजह से है, और अंडाकार आकृति का आकार बढ़ता के रूप में विकसित करता है। इससे पहले, हम और दूसरों G1 के आरोप में गिरफ्तार अंडाकार आकृति केंद्र 7,23 साथ pimonidazole हाइपोक्सिया मार्कर के सह स्थानीयकरण दिखाया है। हम यह भी है कि प्रसार काफी हद तक लगभग 100 माइक्रोन अंडाकार आकृति के किनारे से भीतर होता है प्रदर्शित करता है। इस spheroids 12,23,24 में पिछले अध्ययनों से मेल खाता है, और यह भी घ के साथ संबद्धविवो 25,26 में निकटतम वाहिका से कोशिकाओं proliferating की सहायता।

प्रवाह cytometry या अन्य विश्लेषण के लिए अंडाकार आकृति में अपनी स्थिति के आधार पर कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक वैकल्पिक तरीका अनुक्रमिक trypsinization 24,27 है। इस विधि में अंडाकार आकृति की लगातार "गोले" कम तापमान पर trypsin के साथ लघु, अनुक्रमिक ऊष्मायन अवधि से हटा रहे हैं। हालांकि इस पद्धति का उपयोग कर इसे Hoechst पैठ सीधे कल्पना और मापा जा सकता है, जहां Hoechst डाई प्रसार विधि की तुलना में निकाल दिया जाता है कि (माइक्रोन मोटाई में) बाहरी कवच ​​का सही आकार का पता लगाने के लिए और अधिक कठिन है।

डाई प्रसार और / या छवि विश्लेषण द्वारा "आंतरिक" और "बाहरी" कोशिकाओं को अलग चूहों में FUCCI ट्यूमर xenografts के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, विवो में सेल चक्र के विश्लेषण के लिए, वाहिका की उपस्थिति भी टा होना चाहिएखाते में केन, एक ट्यूमर में कोशिकाओं मध्य क्षेत्रों में वाहिका से ऑक्सीजन और पोषक तत्वों का उपयोग करने में सक्षम हो सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 Life Technologies H3570
agarose low melting point Life Technologies 16520-050 For sectioning
noble agar  Sigma A5431 For making spheroids
agarose for spheroids Fisher Scientific BP1356-100 For making spheroids
0.05% trypsin/EDTA Life Technologies 25300-054
HBSS Life Technologies 14175-103
10% formalin Sigma HT5014-1CS CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do  not breath fumes (open in a fume cupboard).
live/dead near IR Life Technologies L10119
vibratome Technical Products International, Inc
coulture cup Thermo-Fisher Scientific SIE936 Mold for sectioning spheroids
hemocytometer Sigma Z359629
96-well tissue culture plate Invitro FAL353072
collagenase Sigma C5138 
confocal microscope Leica TCS SP5
Flow cytometer analyser Becton Dickinson LSRFortessa
volocity PerkinElmer Imaging software
flowjo Tree Star Flow cytometry software
Vaccuum grease Sigma Z273554
Mounting media Vector Laboratories H1000
FUCCI (commercial constructs) Life Technologies P36238 Transient transfection only
Cell strainer 70 μm In Vitro FAL352350
Round bottom 5 ml tubes (sterile) In Vitro FAL352003
Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) In Vitro FAL352008

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 7, 819-830 (2012).
  2. Beaumont, K. A., Mohana-Kumaran, N., Haass, N. K. Modeling Melanoma In Vitro and In Vivo. Healthcare. 2, 27-46 (2014).
  3. Smalley, K. S., Lioni, M., Noma, K., Haass, N. K., Herlyn, M. In vitro three-dimensional tumor microenvironment models for anticancer drug discovery. Expert opinion on drug discovery. 3, 1-10 (2008).
  4. Reid, B. G., et al. Live multicellular tumor spheroid models for high-content imaging and screening in cancer drug discovery. Current chemical genomics and translational medicine. 8, 27-35 (2014).
  5. Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model. Journal of biomolecular screening. 9, 273-285 (2004).
  6. Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of biotechnology. 148, 3-15 (2010).
  7. Haass, N. K., et al. Real-time cell cycle imaging during melanoma growth, invasion, and drug response. Pigment cell & melanoma research. 27, 764-776 (2014).
  8. Lucas, K. M., et al. Modulation of NOXA and MCL-1 as a strategy for sensitizing melanoma cells to the BH3-mimetic ABT-737. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 18, 783-795 (2012).
  9. Smalley, K. S., et al. Multiple signaling pathways must be targeted to overcome drug resistance in cell lines derived from melanoma metastases. Molecular cancer therapeutics. 5, 1136-1144 (2006).
  10. Thoma, C. R., Zimmermann, M., Agarkova, I., Kelm, J. M., Krek, W. 3D cell culture systems modeling tumor growth determinants in cancer target discovery. Advanced drug delivery reviews. 69-70, 29-41 (2014).
  11. Santini, M. T., Rainaldi, G. Three-dimensional spheroid model in tumor biology. Pathobiology : journal of immunopathology, molecular and cellular biology. 67, 148-157 (1999).
  12. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240, 177-184 (1988).
  13. Haass, N. K. Dynamic tumour heterogeneity in melanoma therapy: how do we address this in a novel model system? Melanoma Manag. 2, 93-95 (2015).
  14. Desoize, B., Jardillier, J. Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance. Critical reviews in oncology/hematology. 36, 193-207 (2000).
  15. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  16. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  17. Smalley, K. S., et al. Up-regulated expression of zonula occludens protein-1 in human melanoma associates with N-cadherin and contributes to invasion and adhesion. The American journal of pathology. 166, 1541-1554 (2005).
  18. Using a Hemacytometer to Count Cells | Protocol. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2015).
  19. Wang, Q., et al. Targeting glutamine transport to suppress melanoma cell growth. International journal of cancer. Journal international du cancer. 135, 1060-1071 (2014).
  20. Lorenzo, C., et al. Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy. Cell division. 6, 22 (2011).
  21. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and tissue research. 352, 161-177 (2013).
  22. Durand, R. E. Use of Hoechst 33342 for cell selection from multicell systems. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 30, 117-122 (1982).
  23. Laurent, J., et al. Multicellular tumor spheroid models to explore cell cycle checkpoints in 3D. BMC cancer. 13, 73 (2013).
  24. LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer research. 64, 1621-1631 (2004).
  25. Kyle, A. H., Huxham, L. A., Baker, J. H., Burston, H. E., Minchinton, A. I. Tumor distribution of bromodeoxyuridine-labeled cells is strongly dose dependent. Cancer research. 63, 5707-5711 (2003).
  26. Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nature reviews. Cancer. 6, 583-592 (2006).
  27. Giesbrecht, J. L., Wilson, W. R., Hill, R. P. Radiobiological studies of cells in multicellular spheroids using a sequential trypsinization technique. Radiation research. 86, 368-386 (1981).

Tags

चिकित्सा अंक 106 मेलेनोमा अंडाकार आकृति कोशिका चक्र छवि विश्लेषण प्रवाह cytometry विश्लेषण 3 डी बहुकोशिकीय कैंसर चिकित्सा कैंसर कोशिका जीव विज्ञान हाइपोक्सिया ट्यूमर उप आबादी vibratome सेक्शनिंग,।
Imaging- और फ्लो के आधार पर सेल की स्थिति का विश्लेषण और 3 डी मेलेनोमा spheroids में कोशिका चक्र
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, … More

Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. J. Vis. Exp. (106), e53486, doi:10.3791/53486 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter