Introduction
다세포 차원 타원체는 그러나 그들이 많은 고형암에 대한 체외 모델로 일반적인 사용에 온 것이 최근이다, 수십 년 동안 종양 모델로 알려져있다. 그들은 점점 복잡, 고가이며 시간 소모적 인 비보 모델에서와 간단한 저비용 차원 단층 모델 1-6 사이의 중간으로 높은 처리량 약물 발견 화면에 사용하고있다. 2D 문화 연구는 종종 생체 내에서 복제 할 수 없습니다. 많은 종류의 암의 회전 타원체 모델은 성장 특성, 약물 감수성, 약물 침투, 세포 - 세포 상호 작용, 고형 종양 6-11 생체 내에서 볼 산소 및 영양분과 괴사 현상의 제한된 유용성을 모방 할 수있다. 스페 로이드는 회전 타원체 (7)의 주변부 괴사 코어, 코어를 둘러싸는 대기 또는 G1 체포 영역 및 세포 증식을 개발한다. 이들 영역의 개발세포 밀도, 증식 속도 및 회전 타원체 (12)의 크기에 따라 달라질 수있다. 그러나, 이들 서로 다른 서브 - 지역에서 보이는 세포 이질성은 암 치료 용 저항 (13, 14)에 기여할 수 있음을 가정하고있다. 따라서, 이들 영역에서 세포를 분석하는 기능은 별도 이해 종양 약물 반응에 중요하다.
세포주기 (15)의 다른 단계에서 열화 Cdt1 및 geminin 형광 태그 - 녹색 (AG Azami 그린) - 형광 유비퀴틴 세포주기 표시기 (FUCCI) 시스템은 적색 (KO Kusabira 오렌지)에 기초한다. 따라서 세포 핵은 초 S 노란색, G1 빨간색과 S / G2 / M 단계에서 녹색 나타납니다. 우리는 여기에 두 개의 상보적인 방법을 기술 모두 셀 G1 체포 센터 혹은 외측 proliferatin에 상주하는지 여부를 결정하기 위해 이미징 소프트웨어 또는 분석 계측법 염료 확산 유동의 사용과 함께, 세포주기를 식별 FUCCI를 사용g 링과 회전 타원체의 에지로부터 각 셀의 거리. 또는 / 및 표적 치료의 존재하에 장시간 G1 체포에 남아있게하고, 재 수 이들 방법은 우리가 회전 타원체의 중심에 저산소 영역에서 그 흑색 종 세포를 보여 이전 공보, 개발되었다 보다 유리한 조건이 발생할 때 7 세포주기를 입력한다.
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Protocol
1. FUCCI 형질 도입 및 세포 배양
- FUCCI 전달
- 안정적으로 FUCCI을 표현 세포 라인을 만들기 이전에 7 설명한 바와 같이 렌티 바이러스 공동 전달을 사용 mKO2-hCdt1 (30-120) 및 MAG-hGem (1-100) (15)를 구성한다.
참고 : FUCCI 시스템은 현재 상업적으로 사용할 수 있습니다. - 단일 셀 정렬하여 밝은 형광과 서브 클론을 생성합니다. 96 웰 플레이트에 형광 활성화 세포 선별에 의한 AG 및 KO (노란색) 모두 긍정적 정렬 단셀은 앞서 설명 7,16.
- 안정적으로 FUCCI을 표현 세포 라인을 만들기 이전에 7 설명한 바와 같이 렌티 바이러스 공동 전달을 사용 mKO2-hCdt1 (30-120) 및 MAG-hGem (1-100) (15)를 구성한다.
- 흑색 종 세포 배양
- 문화 C8161 인간의 흑색 종 세포는 이전에 7,17을 설명했다.
2. 3D 회전 타원체의 형성 (로 이전 3,9 설명)
- 아가로 오스 플레이트 준비
- 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 또는 인산염 buffere 100 ml의 1.5 % 아가로 오스 (또는 귀금속 한천)를 용해소용돌이와 3 ~ 5 분 동안 전자 레인지에 끓는로 D 식염수 (PBS). 아가로 오스가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다.
- 즉시 멀티 채널 피펫을 사용하여 바닥이 평평한 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰 당 아가 용액 100 μL를 분배.
주 : 아가로 오스, 단시간 후에 팁에 고화 수 이상의 아가 플레이트를 만드는 경우에이 문제는 팁 플레이트 사이에 변경해야 극복. - 적어도 1 시간 동안 아가 강화하기 위해 평평한 표면에 96 웰 플레이트를 남겨주세요.
- 아가로 오스 위에 셀 준비 및 오버레이
- T75 플라스크에 약 80 %의 포화 상태로 세포를 성장. HBSS 10 mL로 씻는다.
- 정상 배지 10ml에 0.05 % 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 및 재현 탁 1.5 mL를 사용하여 세포를 분리.
- 혈구 (18) 또는 다른 자동화 된 계산 방법을 사용하여 세포를 카운트.
- 규범에 25,000 세포 / ml의 최종 농도로 세포를 재현 탁알 매체.
- 웰 당 5,000 세포 수를 최종 세포 현탁액 200 μl를 웰과 아가 오버레이.
- 세포 배양 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ℃)으로 돌아 판 위에 약 3일 스페 로이드를 형성 하였다.
참고 : 구형을 형성하는 데 걸리는 시간은 다른 세포주 사이에서 다양하다. 일부 세포주는 모두이 방법을 사용하여 타원체를 형성하지 않는다. - 4X 목적 및 위상차 필터를 사용하여 반전 현미경 이미지 회전 타원체 형태. 성공적으로 타원체 컴팩트, 대략 구형 세포 집합체를 만들어, 잘 당 하나의 구형이 있어야 형성 세포주.
참고 : 선택 사항 : 타원체가 형성되면, 그들은 성장과 침략 3,7,17의 추가 분석을 위해 콜라겐 또는 다른 매트릭스에 이식 할 수 있습니다. 콜라겐이 spher 충분히 용해 될 때까지 37 ℃에서 2 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 500 μL로 처리, 콜라겐에서 타원체를 제거하려면OID를 미디어 (약 30 분)에 무료로 제공합니다. 부드럽게 1 ML의 피펫을 사용하여 타원체를 제거합니다. - 절편의 경우 / 영상 (콜라겐에서 분리 또는 아가로 오스 3-5 일 동안 성장 중) 10 % 중성 포르말린에 수정 타원체 (주의 : 포르말린이 연기 찬장에 사용되어야한다) 실온에서 적어도 2 시간 동안 (RT)를 4 ° C에서, 또는 밤새 (O / N). 스페 로이드는 수일 동안 4 ℃에서 HBSS에 저장 될 수있다.
3. 회전 타원체 Vibratome 단면
- 마이크로파에서 500 ㎖의 유리 병에 HBSS 100ml에 저 융점 아가 로스 5 g을 용해. 소용돌이와 중간 열 설정을 사용합니다. 주의 : 압력이 해제 될 수 있도록 상기 용액을 비등 때 뚜껑을 느슨하게 유지. 뜨거운 유리 병을 처리 할 때 화상으로부터 손을 보호하기 위해 보호 내열 장갑을 사용합니다.
- 아가로 오스가 조금 식을 때까지 기다리십시오 - 그래서 병은 손을 굽기없이 접촉 할 수있다.
- approxima 부어콜터 카운터 컵 또는 이와 유사한 플라스틱 금형의 하부에서 아가 로스의 2ml를 tely. 즉시 액체 가능한 가장 작은 볼륨 1 ML의 피펫을 사용하여 (섹션 2.2.8 참조) 고정 된 회전 타원체를 대기음. 아가로 오스에 회전 타원체를 추가합니다. (10 개까지)은 몇 타원체 컵당 첨가 할 수있다.
- 아가로 오스 2 ㎖ 이상으로 회전 타원체를 커버. 두 번째 레이어가 추가되기 전에 아가로 오스 경화를 방지하기 위해 신속하게이 작업을 수행합니다.
- 아가로 오스는 적어도 3 시간 동안 어둠 속에서 실온에서 경화 할 수 있습니다. 이 때 컵 2-3 4 ° C에서 짧은 시간 동안 저장 될 수있다에 HBSS ml의 탈수를 방지하기 위해 입혔다.
- 컵에서 아가로 오스 제거합니다. 그것은 vibratome 금속 블록에 적합하고, 회전 타원체는 아가의 상단 부근되도록 타원체 함유 아가 트림. 타원체는 아가로 오스 내부 작은 흰색 개체로 볼 수 있습니다. 슈퍼 블록에 아가로 오스를 붙입니다.
- 증류수로 vibratome를 입력하고 vibratome의 블록을 탑재합니다. 설정vibratome는 저속 (설정 2) 높은 진동 (8 설정)를 사용하여 100 μm의 섹션을 잘라. 16 °로 절단 날의 각도를 설정합니다. , vibratome 켜 vibratome 라이트를 켜고 100 μm의 구형 부분이 절단 될 때까지 아가로 오스의 상단에서 부분을 잘라. 24 웰 플레이트에 HBSS로 절단 회전 타원체 섹션을 배치합니다.
- 이미지 분석을위한 중간 섹션을 선택합니다. 핀셋을 사용하여 슬라이드에 섹션 평면을 전송하여 슬라이드에 마운트 부분. 진공 그리스와 10 ML의 주사기 배럴 채우기; 슬라이드의 가장자리를 실행 실장 용지를 방지 커버 슬립 아래 부분을 밀봉 돕기 위하여 부의 가장자리 진공 그리스의 얇은 라인을 추가한다. 설치 매체와 coverslip에와 절을 커버. 매니큐어와 커버 슬립의 가장자리를 밀봉합니다. 스토어 이미징 전에 4 ° C에서 슬라이드.
4. 공 초점 이미지 인식
- 10X를 사용하여 중간 FUCCI 타원체 부의 Z 슬라이스 화상을또는 20X 목적은 앞서 7을 설명했다. 중첩 또는 크로스 토크가 Kusabira Orange2과 Azami 그린 사이에 발생해야합니다. 다중 회전 타원체 부분 사이에 영상을 비교 분석하면, 레이저 파워 등의 설정 샘플 간의 동일한 유지.
흐름 정렬 5. 헥스 염료 확산 분석
- 15 ML 튜브 라이브 타원체 (아가 로스 파종 후 3~5일)를 전송합니다. 타원체 중력이 튜브 바닥에 침전하자. 여러 타원체는 튜브 당 염색 할 수있다. 약 20 타원체 유세포 위해 충분한 세포 수를 얻기 위해 필요하다.
- 초과 매체를 제거하고 정상 매체에 희석하여 10 μm의 훽스트 (Hoechst) 1 ㎖를 추가합니다. 약 1 시간 동안 37 ° C에서 배양 한 타원체. 배양하는 동안 한 번 또는 두 번 회전 타원체를 재현 탁하는 부드러운 긋기를 사용합니다.
주의 : 항온 처리 시간은 훽스트 염료 타원체 침투 얼마나 변경하도록 변경 될 수있다. 이에 따라 달라집니다회전 타원체의 크기, 밀도 및 세포주. 일부 대형 / 조밀 한 회전 타원체를 들어 100 %보다 최대 염료 침투가있을 수 있습니다. - 중력 침강을 사용하여 HBSS 5 ㎖로 부드럽게 회전 타원체를 씻으십시오.
- 옵션 : 염료의 침투 영상의 경우 : 4 ° C에서 RT 또는 O / N에서 적어도 2 시간 동안 10 % 중성 완충 포르말린과 타원체를 수정합니다. , vibratome 섹션을 준비 위의 3 단계와 4 단계에 설명 된대로 공 초점에 슬라이드 및 이미지를 탑재합니다.
- 이격 타원체 휴식 매 10 분 플릭으로 약 30 분 동안 37 ℃에서 0.05 % 트립신 / EDTA 1 ㎖와 함께, 구 상체를 Trypsinize 계측법을 플로우 셀을 제조 하였다.
참고 : 회전 타원체는 단일 세포 현탁액에 들어갈 어려운 조건이 최적화 될 필요가있다. 이 과정 후 C8161 사일 된 타원체의 생존 능력은 약 95 %이다. - 제조 업체의 프로토콜에 따라 근적외선 라이브 / 죽은 얼룩 얼룩 세포. 다음 1로 고정 HBSS로 세척약 30 분 동안 10 % 중성 완충 포르말린 용액. 세포 유동 분석 전에 몇 일 동안 39 ° C에서 HBSS에 저장 될 수있다.
헥스 스테인드 FUCCI 타원체 6. 유동 세포 계측법 분석
- 확인 셀은 셀 스트레이너를 통해 전달하여 함께 응집되어 있지 않습니다. 훽스트 1-5 × 106 세포 / ml의 농도 (5 % 소 태아 혈청 PBS) 빙냉 FACS 세척에 FUCCI의 타원체를 염색 재현 탁. 라운드 5 ml의 바닥 튜브 샘플 200 μl를 전송합니다.
- 6.1에 기술 된 바와 같이 다음과 단색 제어 샘플 준비 : 미 염색 흑색 종 세포; 점착성 흑색 종 세포를 1 시간 동안 10 μM로 염색 훽스트; Azami 녹색은 흑색 종 세포를 발현; 그리고 오렌지 Kusabira은 흑색 종 세포를 발현.
참고 : 단일 색상 컨트롤이 몇 주 또는 몇 달 동안 4 ° C에서 0.1 % 아 지드 화 나트륨으로 세척 포르말린에 고정 외과에 저장 될 수있다. - 실행 단일 세포 현탁액 오이전에 적절한 레이저와 단일 색상 / 흠 컨트롤 분석기 세포 계측법 NA 흐름은 7,16을 설명했다.
- 다음과 같이 외부 회전 타원체 세포 대 내부를 분석하는 등 FlowJo 같은 상용 세포 계측법 소프트웨어를 사용 :
- 앞으로 조금 라이트 사이드 흩어져 빛 (SSC) 대 (FSC)의 주요 세포 인구에 게이팅에 의해 이물질을 제거합니다.
- FSC 대 FSC (지역) (높이)를 사용하여 단일 세포에 게이팅으로는 이중 제거
- 라이브 / 죽은 낮은 인구에 게이팅하여 살아있는 세포에 대한 게이트.
- 훽스트 (Hoechst)에게 "외부"세포와 같은 훽스트 염색 접착 세포에서 긍정적 인 신호를 기초로 게이트 높은 세포를, 정의합니다.
- "내부"세포로서, 유엔 묻은 컨트롤로부터의 신호에 기초하여 게이트 훽스트 낮거나 음성 세포를 정의합니다.
- 내부 및 외부 집단에 대한 게이팅 후, 세포는 더 FUCCI의 녹색, 빨간색 (G1), 노란색 (초 S), (S / G2 / M) 또는 음 (초기 G1)에 대한 문이 될 수 있습니다.
참고 : C를단일 색상 컨트롤을 사용하여 ompensation 제대로 FUCCI, 빨강, 노랑, 녹색 및 부정적인 집단을 정의해야 할 수 있습니다.
- 분석 및 최적화 훽스트 침투 초점 현미경을 통해 확인되면, 이전에 생균 하위 집단의 추가 분석을 7,16 바와 같은 플로우 셀 소터에 고정하지 않고 세포를 실행.
FUCCI 회전 타원체 섹션 7. 이미지 분석
- 오픈 소프트웨어 예. Volocity는 정량 만 구성을 선택합니다.
- 새 라이브러리를 작성합니다. 라이브러리에 공 초점에서 원시 데이터 파일을 드래그하여 소프트웨어에 FUCCI의 회전 타원체 공 초점 이미지 파일을 가져옵니다. 또한, 파일> 가져 오기 명령을 사용합니다.
- 이미지 분석 프로토콜을 구축하기 위해 측정 탭으로 이동합니다. 이 프로토콜은 끌어 프로토콜 창에서 다음과 같이 올바른 순서로 적절한 명령을 놓는 방법으로 내장되어 있습니다.
- OBJ 찾기ECTS 녹색 채널 : 찾기는 프로토콜 창에 ( '찾기'에 있음) 명령 개체를 드래그 ( '처리'에 있음) 열기 명령을 protocol.Add 찾기 객체에서 올바른 채널, 다음, 별도의 감동 개체를 선택 명령 ( '처리'에서 발견 -이 세포를 분리합니다). 크기 <50 μm의에 의해 개체 제외 ( '필터링'에서 발견을 -이 작은 비 세포 개체를 제외한다).
주 : 찾기 임계 개방 반복 수를 변수 개체와 같은 개체의 크기는 분리 할 대상물 마스크 이미지와 일치 될 때까지 제외하는 물체의 크기를 수동으로 최적화되어야한다. - 빨강 채널에서 개체를 찾기 : 빨강 채널에 대한 위의 물체를 발견 반복합니다. 녹색과 빨간색 프로토콜은 별도로 조정해야 할 수도 있습니다.
참고 : 핵 G2에있는로 인해, 녹색 핵 종종 약간 크다. - 발견 된 개체 정확한 확인 : 빨간색 확인하고 녹색 개체가 일치껐다가 켜 프로토콜에 의해 발견 된 빨간색과 녹색 마스크를 표시하는 동안 (숨기거나 표시 채널 명령을 사용하여) 녹색과 적색 채널의 이미지에서 빨간색과 녹색 핵. 피드백 옵션 (측정> 피드백 옵션) 객체 마스크의 모양을 수정하는 데 사용될 수있다.
- 노란색 물체 (초기 S 단계 세포)를 찾기 : 노란색 세포를 발견 ( '결합'에 있음) 명령 녹색 세포 빨간색 교차을 추가 할 수 있습니다. 어떤 작은 비 세포 개체를 제외 ( '필터링'에있는 <50 μm의) 크기에 따라 개체를 제외합니다.
- (G1 단계 세포)를 독점적으로 빨간색 물체를 찾기 : ( '결합'에 있음) 적혈구의 노란색 세포를 독점적으로 빨간색 핵을 찾을 빼기. 만든 작은 비 세포 개체를 제거하는 ( '필터링'에 있음) 크기 <50 μm의에 의해 객체를 제외합니다.
- 독점적으로 녹색 객체 (S / G2 / M 단계에서 세포를) 찾기 : 독점적으로 녹색 찾기 위해 녹색 채널에 대해 반복합니다.
아니TE : 여전히 남아있는 비 셀룰러 물체가있는 경우, 필터 인구 명령만을 보유하는 ( '필터'에 위치한) 전용 녹색 또는 적색 독점 프로토콜에 부가 될 수있다 0.25보다 큰 형상 계수와 개체. 이 비 원형 개체를 제거합니다. - 회전 타원체 개요 찾기 : 찾기를 사용하여 회전 타원체의 개요를 찾기 (회전 타원체의 가장자리 주위에 더 많은 세포를 가지고 중) 녹색 또는 빨간색 채널 ( '찾기'에 있음) 명령을 객체. 훨씬 낮은 임계 값 (찾기에있는 변수를 객체)는 각각의 세포에 비해 회전 타원체의 개요를 찾는 데 사용되어야합니다.
- 다음 개체에서 노이즈를 제거하는 ( '필터링'에 있음) 미세 필터를 사용하여, 다음 ( '처리'에 있음) 객체에 구멍을 채우기 ( '처리'에 있음) 객체에 가입 닫기 명령을 사용하십시오. 마지막으로, 작은 개체 (회전 타원체의 크기에 따라) <30,000 μm의를 제거하는 크기 객체를 제외합니다.
노트이 프로토콜은 타원체 개요가 정확까지 수동으로 최적화 될 필요가있을 것이다. 사용할 필요가 있지만,이 보통 덜 정확한 구형 부, 및 ( '결합'에 있음) 반전 명령이다 - 시야 화상이 사용될 수도있다.
- 다음 개체에서 노이즈를 제거하는 ( '필터링'에 있음) 미세 필터를 사용하여, 다음 ( '처리'에 있음) 객체에 구멍을 채우기 ( '처리'에 있음) 객체에 가입 닫기 명령을 사용하십시오. 마지막으로, 작은 개체 (회전 타원체의 크기에 따라) <30,000 μm의를 제거하는 크기 객체를 제외합니다.
- 로부터되어야하는 최소 거리를 시각화 outline.To 타원체의 가장자리 셀 중심으로부터 황색 독점적 녹색 및 독점적 적색 개체군에서 ( '관련된'에서 발견) 측정 거리 : 타원체 윤곽에 핵의 거리를 측정 가장 가까운 회전 타원체의 가장자리에 셀은 피드백 옵션 (측정> 피드백 옵션> 관계)의 관계 탭에 표시 거리를 켭니다.
- 프로토콜을 저장합니다. 이 프로토콜은 측정을 사용하여 다른 이미지에 다시 적용 할 수있다> 프로토콜 명령을 복원합니다.
- 측정 항목 만들기 (측정> 측정 항목을 확인합니다). 데이터 분석을 이용하여 분석 될 수있다기능.
- 측정 항목의 분석 탭으로 이동합니다. 분석 메뉴로 이동 (분석> 분석) 및 회전 타원체 에지 (녹색 또는 빨간색, 노란색) 셀 중심, 카운트로 요약 인구에 의해 조직의 최소 거리를 분석 할 수 있습니다.
- 에지로부터 일정 거리에서 발견 세포 수를 계수 필터 (분석> 필터)를 생성한다. 도 2의 최소 거리에 대한 필터 (예를 들어 최소 거리 (80)는 "외부"모집단을 준다보다 적은) 훽스트 침투에 기초한다. 또한, 추가 분석을 위해 스프레드 시트로 내보내기 원시 데이터를.
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Representative Results
종양 구 상체를 제조하는 몇 가지 방법이 프로토콜은 세포가 아가 또는 아가로 오스 3,7,9에 배양 비 - 부착 성장 법을 사용있다. (1) 한천 3 일후 C8161 흑색 타원체의 일례를 도시한다. C8161의 타원체 (500)의 직경이 일반 크기의 타원체 형성 - 600 μm의 후 3 일 (= 565, SD = 19, N = 3을 의미). 타원체를 형성 할 다른 흑색 종 세포 라인은 다음과 같습니다 : WM793는, WM983C는, WM983B는, WM164는, 1205lu (이 셀 라인을 형성 타원체가 불규칙하고 19 밀도가 낮은 있습니다).
3D 타원체 모델 내의 개별 세포의 세포주기를 시각화하기 위해서, C8161 흑색 종 세포 FUCCI 시스템 7,15 형질 도입 하였다. 때문에 타원체의 큰 크기 (최대 아가로 오스 3 일 후에 직경 1mm 및 C8161 콜라겐에 24 시간 성장), 절편은 회전 타원체의 중심에 세포를 시각화하기위한 최선의 방법입니다. 완전한(생균 또는 고정) 스페 로이드가 공 초점 현미경에 의해 촬영 될 수있다, 그러나 촛점 촬상 따라서 회전 타원체의 중간 광학 슬라이스가 300 ㎛의보다 작은 직경의 회전 타원체로 얻을 수 있고, 약 150 μm의 최대 침투하기 만 할 수있다. 도 2A는, B 및 C는 C8161 FUCCI 타원체의 단면도의 일례를 나타낸다. 외부 층에서 세포 증식의 구배로 구속 G1 세포 괴사에 의해 둘러싸인 코어는 분명하다. 회전 타원체 및 세포주기 상태에서의 위치에 기초하여 셀을 식별하고 정량화하기 위해 반자동 이미지 분석은도 2D는, FUCCI 셀 마스크와 회전 타원체 개략을 나타낸다. 실시하고,도 2e는 적색의 숫자 부량 (G1)를 나타낸다 녹색 또는 노란색 (S / G2 / M) 세포 중 하나 회전 타원체 (외부 세포) 또는 회전 타원체 에지 (내부 세포)에서보다 큰 80 μm의 가장자리 미만 80 μm의. 이 quantificati예상대로 (G1)에서 적혈구가 크게 회전 타원체의 내부 영역에 농축되어 있음을 나타냅니다합니다.
회전 타원체에서의 세포주기 상태 및 위치에 기초하여 셀을 식별하고 잠재적으로 정렬하기 위해, FUCCI 시스템과 조합 훽스트 염료 확산 분석을 사용 하였다. 훽스트 염료 결과 전체 타원체의 인큐베이션 염료의 제한된 확산로에서 회전 타원체의 외층이 네가티브 내측 회전 타원체 세포 유세포 통해 훽스트로부터 훽스트 양 외층 세포를 분리하기 위해 사용될 수있다.도 2 층은 약 80 ㎛의 회전 타원체 가장자리까지 훽스트의 침투를 나타낸다. 훽스트 침투 밀접 크게 덜 발견 외층에서 증식 세포 (표시되도록 에지에서 80 ㎛, 훽스트 양성 거리는 회전 타원체 부분과 염료 농도와 항온 처리 시간의 최적화의 시각적 분석에 의해 얻은가장자리에서 80 μm의) 미만, G1 침투하지 않았다는 훽스트와 area.The 배양 시간은 깊이 또는 얕게 침투를 얻기 위해 변화 될 수있다 체포. 도 4c 및 D가 FUCCI 빨간색, 노란색 및 녹색 셀 게이팅을 설명하면서도 3에 보여 시간 동안 훽스트 침투를 변화의 예.도 4a는 훽스트 높고 낮은 인구에 대한 게이트의 일례를 나타낸다.도 4B는를 나타낸다 적색 (G1)의 수와 녹색 또는 노란색 (S / G2 / M) 세포 중 하나의 Hoechst 높은 (외부 세포) 또는 훽스트 낮은 (내부 세포)에 대한 정량화. 또이 기술은 G1에서 적혈구 크게 회전 타원체의 내측 영역에 농축되어 (CF. 유사성도 2e의 화상 분석)을 나타낸다.
그림1 :. C8161 회전 타원체 대표 위상 콘트라스트 이미지 한천 3 일 문화 후 C8161의 회전 타원체의 10 배 배율로 촬영. 스케일 바는 100 ㎛ 같다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. C8161 FUCCI 회전 타원체 이미지 분석 C8161 FUCCI의 대표 이미지는 20 배 배율로 촬영 vibratome 섹션을 회전 타원체. 회전 타원체는 아가로 오스에 삼일, 콜라겐 매트릭스 후 추가 24 시간 동안 배양 하였다. (A) Azami 그린, (B) Kusabira Orange2 및 (C)의 공 초점 FUCCI 오버레이 Z 슬라이스. 스케일 바 = 100 μm의. 회색의 회전 타원체 개요와 Volocity에서 만든 (D) 빨간색과 녹색 객체 마스크. 아르곤행은 회전 타원체 가장자리에서 80 μm의 거리를 나타냅니다. (E) 내부의 Red (G1)의 숫자와 녹색 / 노란색 (S / G2 / M) 세포의 정량 (회전 타원체 가장자리에서> 80 μm의) 및 외부 지역 (회전 타원체 가장자리에서 <80 μm의). 오차 막대는 2 독립적 인 실험에서 4 회전 타원체 섹션에서 SD를 나타냅니다. 1.5 시간 배양 후 10 μm의 훽스트 (Hoechst) 염료 (F) 침투. 스케일 바 = 100 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. C8161 회전 타원체의 Hoechst 염료 확산 타임 과정은 전체 C8161의 중간에서 대표 공 촛점 Z 슬라이스 이미지는 지정된 시간 4 일 아가로 오스에서 배양 및 10 μm의 훽스트와 함께 배양 회전 타원체. 10 배 배율로 촬영. 흰색 막대는 대략 훽스트의 침투 깊이를 나타냅니다. 그 C8161 아가로 오스 타원체가 동일한 시점에서 침투 염색 이하의 결과, 그림 2에서 24 시간 동안 콜라겐에 이식 된 C8161의 타원체보다 밀도가 있습니다 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 10 μm의 훽스트 (Hoechst) 20 타원체의 배양 후 훽스트 높고 낮은 게이트의 C8161 FUCCI 회전 타원체 흐름 분석 (A) 예. 블루 라인은 흠 제어, 녹색 선은 완전히 스테인드 헥스 컨트롤을 나타냅니다 나타냅니다. 내부 (훽스트 낮음) 및 외부 (훽스트 높은) 페이지 내에서 빨간색과 녹색 / 황색 세포의 수의 (B) 정량opulations. 오차 막대는 (라이브 정렬 및 고정 된 세포 분석을 모두 포함) 8 독립적 인 실험에서 SD를 나타냅니다. 내부 (C)에 대한 게이팅 FUCCI 및 외부 (D) 회전 타원체 인구의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
반 - 자동화 영상 분석은 내측 회전 타원체 G1 구속 영역을 식별하고, 외층 증식. 이 방법은 광학 부재를 이용하여 실시간 회전 타원체에 사용할 수도 있고, 고정 된 회전 타원체 부분에서, 서로 다른 영역에서의 세포주기하지만 (면역 통해) 마커의 발현, 세포 사멸 또는 세포 형태뿐만 아니라 변화를 식별하기. 다른 구형 영역 내의 세포 운동성은 정량화 될 수있다 - 셀 추적 이미지 분석 단계와 함께 라이브 촛점 시간 경과 화상이 추가되는 경우. 이미지 분석에 중요한 높은 품질의 Z- 조각 공 초점 이미지가 더 높은 해상도의 이미지는 세포보다 쉽게 식별 할 수 있도록, 얻을 수 있다는 것입니다. 이미지 분석 한 제한은 핵이 너무 조밀 경우 제대로 모든 셀을 찾을 수 없다는 점, 또는 적색 및 녹색 강도가 너무 많은 편차가 존재하는 경우. (초기 G1)에 FUCCI 음성 세포,이 이미지 분석 방법 만 빨간색 (G1)에서 발견 할 수없는노란색 (초 S 상)과 녹색 (S / G2 / M). 여기에 설명 된 이미지 기반의 분석 방법의 다른 단점은 고려 타원체의 전체 3D 특성을 고려하지 않는다는 것이다. Volocity Z 소프트웨어 스택을 사용하여 3 차원 이미지 측정을 수행 할 수 있지만, 공 초점 현미경에 의한 큰 크기로 전체 타원체을 관통 할 수없는 화상이다. 일부 타원체가 여전히이 방법을 통해 화상 전체 타원체에 너무 클 수 있지만, 다중 - 광자 영상화는,이 기술은 최대 500 ㎛로의 침투를 허용하는 3 차원 측정 7 전체 회전 타원체의 Z-스택을 얻기 위해 사용될 수있다. 전체 회전 타원체 이미징을위한 또 다른 옵션은 여러 각도에서 회전 타원체의 시각화를 허용하고 큰 회전 타원체 (20, 21) 내부에 200 μm의 최대 침투 빛 시트 기반 현미경입니다. 촬상 전략의 선택은 회전 타원체의 크기, 셀 밀도 및 패킹 세포 유형에 의해 영향을받을 수있다.
훽스트 염색 diffusio유동 세포 계측법 통해 다세포 타원체의 내부 및 외부 세포를 분리하기위한 해당 방법은, 1982 (22)에 기술되었다.이 방법은 외부 셀이 제 염색되면서 훽스트 염료, 회전 타원체로 서서히 확산한다는 사실에 기초한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 G1 세포 체포 내륜에 대하여 내측 및 외측 회전 타원체 세포의 분리뿐만 아니라, 훽스트 침투뿐만 시각화를 허용 FUCCI 시스템 (15)과 훽스트 방법을 결합한다. 이 회전 타원체의 G1 체포 영역의 정확한 분리를 할 수 있습니다. 외부 증식 세포는 G1 세포를 포함 주어진 회전 타원체에서 내부 G1 체포 세포의 분리를 허용하지 않습니다 혼자 FUCCI 사용. 제한이 방법은 두 지역 ( "외부"훽스트 긍정적 "내부"훽스트 네거티브)으로 회전 타원체의 원유 분리 할 수 있다는 것입니다. 이미지 분석을 통해이 방법의 장점은, 그 F이고낮은 계측법 여러 마커 한번에 시험 할 수 있도록, 이러한 유전자 또는 단백질 발현, 상이한 환경 조건, 약물 치료 또는 다른 분석에 재현 배양 등 하류 분석 생균의 물리적 분리.
유동 세포 계측법 및 이미지 분석과 조합 FUCCI 타원체 시스템 괴사 코어를 둘러싸는 세포의 G1 체포 내륜의 식별 및 증식 세포의 외층을 허용한다. 회전 타원체의 중심에 위치한 괴사 G1 정지 산소와 영양분의 결핍에 기인 한 회전 타원체의 크기가 커짐에 따라 발생한다. 이전에, 우리와 다른 G1 체포 회전 타원체 센터 7,23와 pimonidazole 저산소증 마커의 공동 현지화를 보여 주었다. 우리는 또한 그 확산이 크게 약 100 μm의 회전 타원체의 가장자리에서 내에서 발생 보여줍니다. 이 타원체 12,23,24에서 이전 연구와 일치하고, 또한 (D)와 상관 관계생체 (25), (26)에 가장 가까운 혈관에서 세포 증식의 istance.
유세포 분석 또는 기타 분석을 위해 회전 타원체의 그들의 위치에 따라 세포를 분리하는데 이용 될 수있다 또 다른 방법은 순차적 인 트립신 24,27이다. 이 방법에서는 회전 타원체의 연속 "쉘은"낮은 온도에서 트립신 짧은, 연속 배양 기간에 의해 제거된다. 그러나이 방법을 사용하여 그것을 훽스트 침투 직접 시각화 및 측정 될 수있다 훽스트 염료 확산법에 비해 제거되었는지 (μm의 두께) 외부 쉘의 정확한 크기를 확인하기 어렵다.
염료 확산 및 / 또는 이미지 분석에 의해 "내측"및 "외측"세포를 분리하는 것은 생쥐 FUCCI 종양 이종 이식 연구를 확장 할 수있다. 그러나, 생체 내에서 세포주기 분석을 위해 혈관의 존재는 또한 TA되어야계좌로 켄, 종양 세포는 중앙 지역에서 혈관계로부터 산소 및 영양분에 접근 할 수도있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | |
| agarose low melting point | Life Technologies | 16520-050 | For sectioning |
| noble agar | Sigma | A5431 | For making spheroids |
| agarose for spheroids | Fisher Scientific | BP1356-100 | For making spheroids |
| 0.05% trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| HBSS | Life Technologies | 14175-103 | |
| 10% formalin | Sigma | HT5014-1CS | CAUTION: Harmful, corrosive. Use Personal Protective Equipment, do not breath fumes (open in a fume cupboard). |
| live/dead near IR | Life Technologies | L10119 | |
| vibratome | Technical Products International, Inc | ||
| coulture cup | Thermo-Fisher Scientific | SIE936 | Mold for sectioning spheroids |
| hemocytometer | Sigma | Z359629 | |
| 96-well tissue culture plate | Invitro | FAL353072 | |
| collagenase | Sigma | C5138 | |
| confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Flow cytometer analyser | Becton Dickinson | LSRFortessa | |
| volocity | PerkinElmer | Imaging software | |
| flowjo | Tree Star | Flow cytometry software | |
| Vaccuum grease | Sigma | Z273554 | |
| Mounting media | Vector Laboratories | H1000 | |
| FUCCI (commercial constructs) | Life Technologies | P36238 | Transient transfection only |
| Cell strainer 70 μm | In Vitro | FAL352350 | |
| Round bottom 5 ml tubes (sterile) | In Vitro | FAL352003 | |
| Round bottom 5 ml tubes (non-sterile) | In Vitro | FAL352008 |
References
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