Introduction
La possibilité de manipuler l'activité cellulaire avec une résolution spatiale et temporelle précise représente une stratégie importante dans la recherche neuroscientifique et dans le traitement de troubles neurologiques et psychiatriques. 1 Les méthodes traditionnelles sont basés sur la stimulation électrique des cellules en utilisant des électrodes positionnées à proximité ou en contact avec le système cible, 2 qui peut être différent de complexité (cellule unique, le réseau cellulaire, des tranches de cerveau, in vivo des tissus cérébraux). Au cours du siècle passé, l'utilisation de patch-clamp, le métal et les électrodes de substrat intégré ont fourni une image détaillée de la physiologie et la physiopathologie de neurones simples et des mécanismes de réseaux de neurones de fonctionnement. Toutefois, la stimulation électrique souffre de limitations importantes. Le premier est lié à une résolution spatiale généralement médiocre en raison des dimensions physiques des électrodes et leur géométrie fixe, ce qui ne peut pas être facilement adaptésà des systèmes organisés complexes comme les tissus biologiques. En outre, les problèmes liés à l'impédance des électrodes et de diaphonie entre les systèmes de stimulation et d'enregistrement peuvent se détériorer le rapport signal final à bruit des mesures. 3 D'autre part, l'utilisation de la lumière pour la stimulation peut aider à surmonter de nombreuses limitations de l'approche électrique. Tout d'abord, elle offre sans précédent spatiale (<1 um) et la résolution temporelle (<1 ms), ce qui permet de cibler des types cellulaires spécifiques, voire des compartiments sub-cellulaires. En outre, il est hautement non invasif car il évite tout contact physique avec le tissu d'intérêt et se démêlent stimulation de l'enregistrement. En outre, à la fois l'intensité lumineuse et la longueur d'onde peuvent être précisément réglementés et protocoles de stimulation ainsi diverses peuvent être appliquées. 3,4
Cependant, la grande majorité des cellules animales ne présentent aucun sensibilité particulière à la lumière. Plusieurs stratégies pour stimulatio optiquen ont donc été proposées, soit l'exploitation de médiateurs moléculaires sensibles à la lumière à proximité ou à l'intérieur des cellules, ou en utilisant un dispositif photosensible placé à l'extérieur, à proximité de la cellule. La première catégorie se réfère aux mécanismes endogènes comme la stimulation par l'intermédiaire (IR) lumière visible ou infrarouge, ainsi que l'utilisation soit de composés photoisomérisables / photoclivable ou l'expression génétique des actionneurs moléculaires photosensibles (optogénétique). Cette dernière catégorie comprend les techniques de stimulation exogène obtenue avec l'utilisation de nano / micro-particules inorganiques ou des substrats de silicium photoconducteur. 5 Cependant, tous ces systèmes ont des côtés lumineux et des inconvénients. En particulier, l'absorption endogène de cellules dans le domaine visible est faible et non fiable, et la génération concomitante d'espèces réactives de l'oxygène peut être nuisible à la cellule. En général, les IR est utilisé pour induire chauffage thermique local du fait de l'absorption d'eau, mais le coefficient d'extinction de l'eau est faible, ce qui nécessite stlumière infrarouge rong (de quelques dizaines à des centaines de W / mm 2) qui est difficile à livrer via optique du microscope standard et peut poser des problèmes de sécurité pour les applications in vivo. D'autre part, les composés de cages photo-commutables ont une action limitée dans le temps et nécessitent souvent la lumière UV qui est difficile à remettre en raison de la pénétration tissulaire limitée. De plus, ils souffrent de problèmes de diffusion des composés activés lors de la photolyse en dehors de la zone éclairée. Enfin, des outils optogénétiques ont permis aux scientifiques de cibler sous-population cellulaire spécifique et des sous-compartiments et sont rapidement en train de devenir l'une des technologies clés dans la recherche neuroscientifique. Cependant, l'insertion d'un segment d'ADN exogène via un vecteur viral soulève des questions importantes sur la sécurité, notamment en vue de l'adoption sur des patients humains. 5,6 Pour ces raisons, la recherche sur de nouveaux matériaux et dispositifs capables de manipulation optique de la cellule est un sujet extrêmement chaud.
Récemment, un romanapproche basée sur l'utilisation de polymères conjugués sensibles à la lumière, capable de transduire efficacement un stimulus optique en une modulation de l'activité électrique de la cellule, a été proposée. La cellule de stimulation par Polymer photoexcitation (CSPP) technique exploite de nombreuses fonctionnalités clés génériques, typique de semi-conducteurs organiques: ils sont intrinsèquement sensibles à la lumière dans le domaine visible; 7 ils sont biocompatible, souple et adaptable et leur flexibilité mécanique permet une interface intime avec le tissu à la fois in vitro et in vivo 10.8. En dehors de cela, ils peuvent être facilement fonctionnalisés de mieux adapter à l'interface avec les cellules vivantes, et de permettre à excitation spécifique, sonder et de détection des capacités. 11,12 De plus, ils support électronique ainsi que le transport ionique, ce qui les rend idéal pour la combinaison de l'électronique annonce la biologie. 13,14 intéressant, ils peuvent fonctionner en mode photovoltaïque, évitant la nécessité d'appliquer un biais f extérieurou la stimulation de la cellule optique efficace. 15
La fiabilité de la technique CSPP a déjà été démontré dans plusieurs systèmes, y compris les neurones primaires, 15,16 astrocytes, 17 lignées cellulaires secondaires 18 et tissus rétiniens explantées. 16 Dans ce travail, toutes les mesures nécessaires pour fabriquer un bio-polymère sensible à la lumière interface 19 pour la stimulation optique de systèmes in vitro sont décrits en détail. Comme une étude de cas, un système photovoltaïque mélange organique prototypique de la région régulière poly (3-hexylthiophène) (rr-P3HT), fonctionnant comme le donneur d'électrons, et d'ester phényl-C61-butyrique-acide-méthyle (PCBM), agissant en tant que accepteur d'électrons est utilisé. Comme le système biologique, des cellules de rein embryonnaire humain (HEK-293) sont utilisées. Un exemple d'un protocole de photostimulation avec l'enregistrement relatif de l'activité des cellules par l'intermédiaire de mesures électrophysiologiques est fourni.
La plate-forme décritest cependant de validité générale, et il peut facilement être étendue à l'utilisation d'autres polymères conjugués (en ajustant convenablement le procédé en solution de préparation et les paramètres de dépôt), différents types de cellules (par correctement changeant le protocole de culture de cellules, la procédure et le temps requis placage pour l'ensemencement et la prolifération cellulaire) et des protocoles de stimulation différentes (longueur d'onde de la lumière, la fréquence et la durée des stimuli, densité de photoexcitation).
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Protocol
1. Préparation des substrats photoactifs
- Préparer une P3HT: PCBM solution (1: 1 en poids / poids) dans du chlorobenzène à une concentration de P3HT de 20 g / L. Mélanger la solution avec un agitateur magnétique pendant au moins 4 heures à 60 ° C. Considérons un volume de 150 ul de solution de substrat à chaque être préparé.
- Lames propres de ITO verre (= 10 Ω / m² de R, 18x18 mm 2, 170 um d'épaisseur) avec bains consécutifs d'eau déminéralisée, l'acétone et l'isopropanol dans un appareil à ultrasons (10 min pour chaque étape). Sécher les lamelles avec un pistolet d'azote. Mettre les échantillons dans un nettoyeur à plasma à 100 W pendant 10 min.
- Déposer un film mince de la couche active sur les substrats nettoyés par spin-coating.
- Avec une pointe de diamant, couper une lame de verre de microscope, (épaisseur ≈ 1 mm) pour les mêmes dimensions latérales des substrats ITO. Retirez le P3HT: PCBM solution de la plaque de cuisson et laisser refroidir à température ambiante.
- Définir un deux-steps programme spin-coucheuse: i) 30 secondes à 800 tours par minute; ii) 30 secondes à 1600 tours par minute. Placer la lame sur le mandrin de la spin-coucheuse et commencer le vide pour le fixer. Mettre une goutte d'acétone sur la diapositive et ensuite le substrat nettoyé, avec le côté revêtu d'ITO vers le haut. Commencez la rotation de spin-coucheuse pour se débarrasser de l'excès d'acétone.
- Mettez 150 pi de P3HT: PCBM solution sur les substrats et recommencer le spin-coucheuse (utiliser le même protocole décrit dans 1.3.2).
- Après le spin-laqueur a terminé, retirez l'échantillon et détachez soigneusement le substrat revêtu de la lame de verre. Nettoyez l'arrière du substrat avec un tampon de salle blanche trempée dans de l'acétone.
Remarque: Les supports photosensibles peuvent être stockés pendant quelques jours dans une boîte sombre jusqu'à utilisation. Pour de plus longues périodes, les maintenir dans une boîte à gants avec un gaz inerte.
2. Préparation du milieu de culture cellulaire et l'électrophysiologie Solutions
- Préparation du milieu de croissance complet (CGM) pourCellules HEK-293: Dulbecco modifié Eagle Medium (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) inactivé à la chaleur non, 100 U / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Stériliser le moyen d'un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C.
- Préparer la solution extracellulaire dans l'eau ultra-pure (concentrations en mM): 135 NaCl, KCl 5,4, 5 HEPES, 10 glucose, 1,8 CaCl2, MgCl2 1. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um et conserver à 4 ° C.
- Préparer la solution intracellulaire dans l'eau ultra-pure (concentrations en mM): 12 KCl, 125 K-gluconate, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Notez que l'ATP Na 2 est sensible à la chaleur et ajouter en dernier. Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH. Stériliser la solution avec un système de filtration de 0,2 um, aliquote de 1 ml tubes et conserver à -20 ° C.
3. Placage des cellules HEK-293sur les substrats actifs
- Placez le substrat photosensible dans un bécher de verre recouverte d'aluminium ou une boîte de Pétri fermée et mis dans un four à 120 ° C pendant 2 heures pour la stérilisation. Partir de ce moment, effectuer toutes les opérations dans des conditions stériles. Mettre les échantillons dans une hotte stérile et laissez-les refroidir.
- Revêtir le substrat avec une couche photosensible d'adhérence pour réduire le caractère hydrophobe de la surface et pour favoriser l'adhérence cellulaire.
- Placez les substrats actifs dans une boîte de Pétri de P35 ou une plaque multipuits 6. Compte tenu du caractère hydrophobe de la couche de polymère conjugué, Faites un polydiméthylsiloxane (PDMS) et de fixer l'échantillon et confiner les solutions.
- Mélanger PDMS et d'un catalyseur à 10: 1 proportion avec une baguette de verre pour obtenir une suspension visqueuse.
- Verser la pâte dans une plaque multi-puits 6, distribution d'un montant suffisant pour couvrir la moitié de chaque puits.
- Attendez pour la polymérisation PDMS à TA.
- Couper les PDMS durcis au milieu pour bénéficier du droit àining une forme carrée de la même dimension de l'échantillon de polymère.
- Stériliser les PDMS puits par immersion dans un mélange éthanol-eau de 70% pendant au moins 30 min.
- Si vous utilisez bien les PDMS, gratter la couche photosensible long de la frontière du puits avec des pincettes pointues, afin d'éviter le détachement de la totalité de la couche lors du retrait des PDMS bien après la culture de cellules.
- Couvrir toute la surface de chaque échantillon avec une solution de fibronectine (2 mg / L dans du PBS). Un volume entre 500-750 ul par échantillon est généralement suffisant si un PDMS puits est utilisée (surface claire du bien: 15x15 mm 2). Sans les PDMS ainsi, environ 2 ml d'une solution de fibronectine sont nécessaires pour immerger complètement l'échantillon; attention à ce que le substrat ne flotte pas, tout en ajoutant la solution. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant au moins 1 heure.
- Retirer la solution de fibronectine avec une pipette en verre et laver une fois avec 2 ml de PBS.
- Placez les substrats actifs dans une boîte de Pétri de P35 ou une plaque multipuits 6. Compte tenu du caractère hydrophobe de la couche de polymère conjugué, Faites un polydiméthylsiloxane (PDMS) et de fixer l'échantillon et confiner les solutions.
- Plmangé cellules HEK-293 sur des échantillons de fibronectine traitées à une densité de 15.000 cellules / cm2 dans du milieu de croissance complet. Utiliser un volume de 750-1,000 ul de CGM pour chaque échantillon si un PDMS bien est utilisé, autrement 2-3 ml de CGM sont nécessaires. Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO2 pendant 24 à 48 heures.
4. optique protocole Stimulation et électrophysiologiques Mesures
- Mettez la solution extracellulaire dans un bain d'eau à 37 ° C à thermaliser; décongeler la solution intracellulaire, le mettre dans une seringue de 1 ml avec une aiguille 34 gauge et le garder en contact avec de la glace pour éviter la dégradation de l'ATP.
- Prenez un substrat revêtu de cellules de l'incubateur, en enlevant soigneusement les PDMS bien si elle est présente. Retirer le milieu de croissance avec une pipette en verre et rinçage de l'échantillon avec la solution extracellulaire. Procéder lentement pour éviter le détachement des cellules.
- Mettre l'appareil dans le porte-échantillon de la station d'électrophysiologie avec solutio extracellulairen et l'électrode de référence. Préparer micropipettes de verre frais de patch-clamp avec un extracteur (résistance idéale est dans la gamme 2-4 MQ). Remplissez la moitié de la pipette avec la solution intracellulaire et le monter sur le micromanipulateur.
- Cherchez une cellule saine de patcher sur le dispositif. Pour éviter l'excitation involontaire du substrat photosensible, en utilisant un éclairage infrarouge pour l'imagerie, en plaçant un filtre passe-longueur d'onde (par exemple, une longueur d'onde de coupure λ = 750 nm peut être utilisée pour les polymères absorbant dans le visible) devant le dispositif d'éclairage de microscope.
- Patch la cellule sélectionnée et appliquer le protocole souhaité pour la stimulation optique en fournissant la lumière à l'échantillon via le trajet d'excitation de fluorescence du microscope (Figure 1). Une description détaillée du protocole de patch-clamp peut être trouvé dans la référence 20.
- Positionner la pipette de patch à proximité immédiate de la membrane cellulaire avec un manipulateur micrométrique. Pendant le positionnement, appliquer overpressure à la pipette afin d'éviter la saleté qui adhère à la pointe. La pipette devrait être de quelques microns au-dessus de la cellule.
- Commencer à abaisser la pipette vers la membrane cellulaire tout en contrôlant la résistance de la pipette sur le logiciel de contrôle de patch. Lorsque la résistance de la pipette a augmenté d'environ 1 MQ, éliminer la surpression à partir de la pipette tout en appliquant une légère aspiration, afin de former la gigaseal entre la pipette et la membrane cellulaire (par exemple, la résistance mesurée devrait augmenter à des valeurs supérieures à 1 GQ) .
- Appliquer un potentiel négatif à la pipette à proximité de la cellule attendue potentiel de repos (pour HEK293 cellule un potentiel de -40 mV peut être utilisé) pour aider à stabiliser le joint. Compenser les transitoires capacitifs en raison de la capacité de la pipette avec les commandes relatives à l'amplificateur de patch et / ou le logiciel de contrôle du patch.
- Casser la membrane pour permettre un accès électrique à la cytoplasme de la cellule en appliquant une impulsion d'aspiration brève et intenseà la pipette. Réglez l'amplificateur de patch clamp en mode de courant (I = 0, autrement dit, sans courant injecté dans la cellule) afin de suivre le potentiel de la membrane cellulaire. Attendez quelques minutes pour voir si le potentiel de la cellule est stable.
- Appliquer le protocole d'illumination désirée de la cellule et d'enregistrer l'effet sur le potentiel de membrane.
Remarque: L'éclairage peut être expédié à l'échantillon, soit par le bas ou par le haut, en fonction de l'architecture du microscope.- Sélectionner une longueur d'onde d'excitation qui est bien absorbé par le matériau actif; pour le P3HT: PCBM mélange, une longueur d'onde dans la gamme 450-600 nm peut être utilisé. Densités de photoexcitation appropriées sont dans la gamme 10-100 mW / mm 2.
Remarque: courtes impulsions de lumière (ci-dessous 10-20 msec) résultat dans une dépolarisation transitoire de la cellule, tout avec un éclairage prolongé (plusieurs centaines de millisecondes ou des impulsions plus longues) une hyperpolarisation soutenue est observée jusqu'à ce que la lumière est éteinte.
- Sélectionner une longueur d'onde d'excitation qui est bien absorbé par le matériau actif; pour le P3HT: PCBM mélange, une longueur d'onde dans la gamme 450-600 nm peut être utilisé. Densités de photoexcitation appropriées sont dans la gamme 10-100 mW / mm 2.
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Representative Results
Les cellules peuvent être facilement cultivées sur P3HT: PCBM substrats, à condition qu 'une couche d'adhérence est déposée convenable (tel que la fibronectine utilisé dans l'étape 3.2 du protocole décrit). P3HT: PCBM pics d'absorption optique dans la partie verte du spectre visible; cependant, d'autres polymères conjugués sensibles à la lumière peuvent être sélectionnés, en fonction de la gamme de longueurs d'onde de photostimulation préféré (figure 2). La biocompatibilité de ces substrats a été démontrée non seulement avec des lignées cellulaires HEK-18,21 comme 293, mais aussi avec des cultures primaires de neurones et les astrocytes 17 15 Une micrographie typique de saines cellules HEK-293 en culture sur une P3HT:. Le film est montré PCBM la figure 3. une stimulation optique de cellules à médiation par les substrats photoactifs peut se traduire par des effets différents sur la membrane de la cellule, en fonction de la durée du stimulus lumineux. 18 Lors de l'apparition de l'impulsion de lumière, unpic rapide (avec une intensité de l'ordre de 3 mV et une durée d'environ 1 ms) peut être observé dans les enregistrements potentiel de la membrane cellulaire (Figure 4). Ce signal est due à une charge capacitive de l'interface polymère / électrolyte lors de la génération de charge dans le matériau actif.
Après ce dopage initial rapide, une dépolarisation transitoire (avec une intensité d'environ 1 mV et une durée de l'ordre de dizaines de millisecondes) est observée dans la cellule (figure 4). Pour de courtes impulsions de lumière, comme la lumière est éteinte, un comportement inverse est observé. Ces signaux ont été attribués à une variation de capacité de la membrane due à un échauffement local suivant absorption de la lumière.
Pour un éclairage prolongé, cependant, la dépolarisation initiale pendant les impulsions de lumière se transforme en une hyperpolarisation de la cellule (figure 5). Ce phénomène a unobtenir une origine thermique, mais dans ce cas il est liée à une variation du potentiel d'équilibre de la membrane en raison d'un changement dans les canaux ioniques conductivités induites par la température élevée.
Figure 1. Croquis du substrat photosensible. Les interfaces photosensibles utilisées pour la stimulation optique cellulaire sont faites d'un film mince de semi-conducteurs organiques déposées sur un substrat de verre revêtu d'ITO. Les cellules peuvent être cultivées directement sur les surfaces de l'appareil après qu'il a été traité avec une couche d'adhérence approprié (par exemple, la fibronectine). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Absorp Les spectres de différents polymères conjugués tion. L'utilisation de films minces de semi-conducteurs organiques peut permettre une grande accordabilité en longueur d'onde d'excitation, tout en conservant une transparence partielle du substrat. A titre d'exemple, les spectres d'absorption des différents polymères conjugués généralement utilisé dans le photovoltaïque sont signalés. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Les cellules HEK-293 en culture sur un substrat photosensible. Micrographie type de cellules HEK-293 en culture sur la surface d'un substrat photosensible après 24 h d'incubation. La barre d'échelle, 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. stimulation optique de cellules HEK-293 avec 20 impulsions de lumière ms. La variation du potentiel membranaire d'une cellule HEK-293 provoquée par une impulsion de lumière 20 msec. Un pic initial rapide à l'apparition de la lumière est suivi d'une dépolarisation de la cellule au cours de l'impulsion. Comme la lumière est éteinte, un comportement inverse est observé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. stimulation optique de cellules HEK-293 avec 200 impulsions lumineuses ms. La variation du potentiel membranaire d'une cellule HEK-293 provoquée par une impulsion de 200 ms de la lumière. La dépolarisation initiale observée pour court illummination est seulement un phénomène transitoire, qui, après quelques dizaines de millisecondes d'éclairement prolongé se transforme en une hyperpolarisation de la cellule. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes critiques du protocole rapporté pour in vitro stimulation optique de cellules concernent principalement le choix du polymère sensible à la lumière, les paramètres de stérilisation thermique, l'intensité et la durée des stimuli lumineux. Un P3HT: PCBM film mince a été choisi ici, car il garantit une bonne stabilité temporelle et électrochimique. Cependant, il faut noter que tous les polymères sensibles à la lumière peuvent offrir des performances analogiques, 22 plus précisément lors de l'illumination. En outre, dans ce cas choisi la stérilisation thermique paramètres ne conduisent pas à une dégradation importante des fonctions optoélectroniques polymères; avis cependant que, dans le cas où la méthode de stérilisation ou les paramètres de traitement thermique sont modifiées, les effets possibles sur les propriétés du polymère doit être soigneusement évaluée. Il est connu, par exemple, que l'exposition aux UV conduit rapidement à blanchiment de polymère et la dégradation irréversible, en raison de la perte de conjugaison. En outre, le recuit différenttempératures et la durée peuvent conduire à différentes afin morphologique de la surface du polymère, avec des effets négatifs sur les propriétés de transport de charge électrique. Les paramètres du protocole de photoexcitation doivent être soigneusement évaluées ainsi: densités d'excitation supérieures à 100 mW / cm 2, et / ou des stimuli prolongées, peuvent facilement conduire à une dégradation du polymère et de l'échec du protocole de photostimulation. Une autre étape critique dans le protocole consiste dans l'utilisation d'une couche protéine d'adhésion, en raison du degré élevé d'hydrophobicité de la P3HT: PCBM surface. En l'absence de couche d'adhérence est utilisé dans la réalisation de l'interface bio-polymère, le semis et la prolifération cellulaire pourrait être sérieusement compromise.
Au cours des étapes critiques et des contraintes mentionnées ci-dessus, toutefois, le protocole rapporté peut être carrément à jour, en fonction des besoins et des objectifs expérimentaux spécifiques. Autres polymères stables, sensibles à la lumière peuvent être trouvés, 7 à partir de plusieurs comcommerciale fournisseurs ou par correctement synthétiser de nouveaux composés. Cela permet l'utilisation de différentes longueurs d'onde d'excitation, allant de la bleue à la plage rouge et proche infrarouge. De plus, la technique de dépôt de polymère ne se limite pas à l'utilisation de revêtement par centrifugation. En effet, d'autres méthodes assurant une bonne homogénéité et l'épaisseur de film approprié peuvent être envisagées, telles que l'impression à jet d'encre, revêtement par pulvérisation, ou Blading Les effets du contact prolongé avec les milieux de culture de la cellule et de la méthode de stérilisation doit être évalué pour chaque nouveau matériel prendre en considération. Bien que l'utilisation de couches d'adhérence de protéines est nécessaire pour obtenir de bonnes cultures de cellules au-dessus des surfaces de polymère, l'utilisation spécifique de la fibronectine, comme indiqué ici, est pas obligatoire. Les différentes couches de protéines d'adhérence peuvent être utilisés, également en conformité avec la lignée cellulaire à croître; 21 par exemple, les cellules neuronales sont généralement cultivées sur une couche de poly-L-lysine. Enfin, les protocoles d'éclairage peuvent être modifiés et adaptés à la SPecific besoins, en termes de longueur d'onde, la taille du spot, la densité de puissance d'excitation, le temps la durée et la fréquence des stimuli, la direction d'incidence de lumière (à partir du substrat ou du bain d'électrolyte). Comme brièvement indiqué ci-dessus, toutefois, la définition des paramètres de protocole doit tenir compte de la gamme optique polymère d'absorption et les effets possibles de dégradation, qui peut varier beaucoup d'un cas à.
La stabilité électrochimique et temporelle limitée de certains polymères sensibles à la lumière représente en fait les principales limitations de la technique. En outre, l'utilisation de polymères commerciaux sans autre purification peut conduire dans certains cas à la répétabilité limitée des résultats entre les différents lots de la matière, en raison de différents degrés de pureté.
Nous remarquons également que les mécanismes précis à la base de l'effet de phototransduction de protocoles CSPP doivent encore être élucidés et caractérisé. Thermique, électrique et chimique phenomena sont éventuellement impliqués, à des degrés divers dans les différents modèles biologiques. Une compréhension complète sera la clé pour exploiter pleinement la technique. En particulier, l'apparition de phénomènes de chaleur à médiation devrait être examiné comme une limitation de la technique, car il peut être difficilement maîtrisée, et peut conduire à des effets des surchauffes locales, en particulier dans le cas des applications in vivo. Une mise en œuvre spécifique du dispositif, visant à contrôler la diffusion de la chaleur dans l'environnement extracellulaire par bon génie de pistes conductrices de la chaleur, pourrait révéler nécessaire dans le prochain avenir pour la pleine exploitation de la technique.
Dans la littérature, différentes techniques qui utilisent des impulsions optiques pour la stimulation médiée par la température, de cellules et de tissus, à la fois in vitro et in vivo peuvent être trouvés. Dans ces études, l'absorption des infrarouges des faisceaux laser par de l'eau est habituellement utilisé comme mécanisme de transduction. 23-25 En ce qui concerne infrarougeLa stimulation neurale, le mécanisme CSPP a des avantages distincts, en particulier pour une expérimentation in vitro. CSPP est basé sur la lumière dans la plage visible et d'intensité modérée, de sorte que la stimulation peut être fourni par le trajet d'excitation de microscope à fluorescence standard. Au contraire, l'absorption de l'eau nécessite des longueurs d'onde dans l'infrarouge (notamment autour de 1,45 um et 1,93 um), qui doivent être remis à l'échantillon par l'intermédiaire de sources externes telles que des fibres optiques micromanipulés autour de la préparation, depuis le train optique d'une norme microscope peut pas être utilisé à de telles longueurs d'onde. Dans le cas d'CSPP, les motifs lumineux obtenus avec les systèmes de balayage laser, ainsi que les modulateurs spatiaux de lumière peuvent être couplés directement au train optique de la plupart des microscopes. De cette façon, la photostimulation de substrats à base de semi-conducteurs organiques, il peut être possible d'obtenir une stimulation de plusieurs cellules dans le champ de vision de façon indépendante, avec à la fois une haute temporelle résolution spatiale ème.
Une autre alternative très précieux pour la stimulation optique est offert par des méthodes génétiques, basé sur l'expression ciblage de sondes génétiquement photoactivables dans les cellules. Optogenetics nos jours, propose une résolution temporelle et spatiale sans précédent, avec des intensités d'éclairage typiques de l'ordre de quelques dizaines de mW / mm 2, peut à la fois exciter et inhiber l'activité électrique, et peut être génétiquement ciblée à des sous-populations spécifiques des régions spécifiques du cerveau d'intérêt. Cependant, il présente encore quelques problèmes qui doivent être résolus. En particulier, les préoccupations de sécurité concernant l'utilisation de virus pour l'expression génique, en particulier chez l'homme, et la réalisation de l'expression de la protéine hétérologue stable et contrôlé à long terme représentent toujours les principaux défis. CSPP technique permet de contourner la nécessité d'un transfert de gène, et tous les problèmes de sécurité connexes, qui sont particulièrement pertinentes pour des applications in vivo.
jove_content "> Dans l'ensemble, le procédé CSPP offre plusieurs avantages par rapport aux techniques de photostimulation endogènes. Comme il est non invasif, il peut être facilement couplé à une station de travail électrophysiologique existant et il ne nécessite pas de sources laser complexes ou de transfection génétique, tandis que en maintenant une haute sélectivité spatiale et temporelle. Pour ces raisons, CSPP est prometteuse pour devenir un outil complémentaire en neurosciences in vitro enquêtes, et d'ouvrir de nouvelles perspectives dans les applications in vivo. Cependant, un gros effort de la science des matériaux, la physique et l'ingénierie communautés est attendu dans les prochaines années, nécessaires pour affiner, d'optimiser et d'exploiter pleinement la technique.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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