Introduction
Möjligheten att manipulera den cellulära aktiviteten med en exakt rumslig och tidsmässig upplösning utgör en viktig strategi i neuro forskning och behandling av neurologiska och psykiatriska sjukdomar. Är 1 Traditionella metoder baserade på elektrisk stimulering av celler med hjälp av elektroder placerade i närheten eller i kontakt med den målinriktade systemet, 2, som kan vara av olika komplexitet (enda cell, cellulärt nät, hjärnsnitt, in vivo-hjärnvävnader). Under det senaste århundradet, har användningen av patch-clamp, metall och substrat integrerade elektroder en detaljerad bild av fysiologi och patofysiologi av enskilda nervceller och de fungerande mekanismer för neurala nätverk. Men lider elektrisk stimulering av viktiga begränsningar. Den första en är relaterad till en allmänt dålig spatial upplösning på grund av de fysiska dimensionerna hos elektroderna och deras fasta geometri, som inte lätt kan anpassastill komplexa organiserade system som biologiska vävnader. Dessutom kan problem i samband med elektrod impedans och av överhörning mellan stimulerings och registreringssystem försämras den slutliga signal-brusförhållande i mätningarna. 3 Å andra sidan kan användning av ljus för stimulering hjälper till att övervinna många begränsningar av den elektriska metoden. Först av allt, erbjuder oöverträffad rumslig (<1 pm) och temporal upplösning (<1 ms), vilket gör det möjligt att inrikta sig på specifika celltyper eller till och med sub-cellavdelningar. Dessutom är det mycket icke-invasiv eftersom den undviker någon fysisk kontakt med vävnaden av intresse och disentangles stimulans från inspelningen. Dessutom kan både ljusintensitet och våglängd regleras exakt och sålunda varierande stimuleringsprotokoll kan tillämpas. 3,4
Dock inte de allra flesta djurceller inte fram någon specifik ljuskänslighet. Flera strategier för optisk stimulation har sålunda föreslagits, antingen utnyttja ljuskänsliga molekylära mediatorer i närheten eller inom cellerna, eller med användning av fotoaktiva anordning placerad externt, nära cellen. Den förstnämnda kategorin avser endogena mekanismer som stimulering via synlig eller infraröd (IR) ljus, liksom användning av antingen fotoisomeriserbara / fotoklyvbar föreningar eller genetiskt uttryck av ljuskänsliga molekylära ställdon (optogenetik). Den sistnämnda klassen inkluderar tekniker för exogen stimulering uppnås med användning av oorganiska nano / mikro-partiklar eller fotokonduktiva kiselsubstrat. 5 Trots detta har alla dessa system har ljusa sidor och nackdelar. I synnerhet är endogen absorption av celler i det synliga området svaga och inte tillförlitliga, och den åtföljande genereringen av reaktiva syretyper kan vara skadliga för cellen. I allmänhet är IR används för att inducera lokal termisk uppvärmning på grund av vattenabsorption, men extinktionskoefficienten för vatten är liten, vilket således kräver stRong infrarött ljus (från tiotals till hundratals W / mm 2) som är svårt att leverera via standardmikroskopoptik och kan utgöra säkerhetsrisker för in vivo applikationer. Å andra sidan, foto omkopplingsbar placering i kasse föreningar har en tidsbegränsad verkan och kräver ofta UV-ljus som är svårt att avge på grund av begränsad genomträngning vävnad. Dessutom har de lider av diffusion problem med de aktiverade föreningarna vid fotolys utanför det belysta området. Slutligen har optogenetic verktyg får forskarna att rikta specifik cellulär subpopulation och underavdelningarna och snabbt fram som en av nyckelteknologierna i neurovetenskapliga forskningen. Men att sätta in en exogen DNA-segment via en virusvektor väcker viktiga säkerhetsfrågor, särskilt med tanke på antagandet om humanpatienter. 5,6 Av dessa skäl är forskning om nya material och anordningar som kan cell optisk manipulation en extremt hett ämne.
Nyligen, en romanstrategi som bygger på användning av ljuskänsliga konjugerade polymerer, som kan effektivt omvandla en optisk stimulans i en modulering av cell elektrisk aktivitet, har föreslagits. Cell Stimulering av Polymer fotoexcitation (CSPP) teknik utnyttjar många viktiga aktivera funktioner typiska för organiska halvledare: de är i sig känslig för ljus i det synliga området, 7 de är biokompatibla, mjuk och formbar och deras mekaniska flexibilitet gör en intim gränssnitt med vävnad både in vitro och in vivo 8-10. Bortsett från detta, kan de lätt funktion att bättre anpassa sig till gränssnittet med levande celler, och att aktivera det specifika excitation, sondering och avkänning kapacitet. 11,12 dessutom de stöder elektronisk liksom jontransport, vilket gör dem idealiska för kombinationen elektronik annons biologi. 13,14 Intressant, kan de arbeta i solceller läge, undvika behovet av att tillämpa en extern förspänning feller effektiv cell optisk stimulering. 15
Tillförlitligheten hos CSPP teknik har tidigare visats i flera system, inklusive primär neuroner, 15,16 astrocyter, 17 sekundära cellinjer 18 och explanterade retinala vävnader. 16 I detta arbete, alla nödvändiga åtgärder för att tillverka en ljuskänslig bio-polymer gränssnitt 19 för optisk stimulering av in vitro-system beskrivs i detalj. Som en studie fall en proto organisk solceller blandning av region regelbundna poly (3-hexyltiofen) (rr-P3HT), som fungerar som elektrondonator, och fenyl-C61-smörsyra-syra metylester (PCBM), i egenskap av elektronacceptor användes. Eftersom det biologiska systemet, är humana embryonala njur (HEK-293-celler) används. Ett exempel på en fotostimulering protokoll med den relativa registrering av cellaktivitet via elektrofysiologiska mätningar tillhandahålls.
Den beskrivna plattformenär dock en allmän giltighet, och det kan lätt utvidgas till användningen av andra konjugerade polymerer (genom att justera lösningen förberedelseprocessen och deponerings parametrar), olika celltyper (med rätt att ändra cellodlings protokollet, plätering förfarande och begärd tid för cellsådd och spridning) och olika stimuleringsprotokoll (ljusvåglängd, stimuli frekvens och varaktighet, fotoexcitation densitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Fotoaktiva substrat
- Förbered en P3HT: PCBM-lösning (1: 1 vikt / vikt) i klorbensen vid en P3HT koncentration av 20 g / I. Blanda lösningen med en magnetisk omrörare under minst 4 h vid 60 ° C. Betrakta en volym av 150 | il av lösningen för varje substrat som skall framställas.
- Rena ITO-belagda objektglas (R s = 10 Ω / kvm, 18x18 mm 2, tjocklek 170 pm) med varandra bad avjoniserat vatten, aceton och isopropanol i en sonikator (10 min för varje steg). Torka de täckglas med en kvävespruta. Placera proven i en plasma renare vid 100 W effekt under 10 min.
- Deponera en tunn film av det aktiva skiktet på de rengjorda substraten via rotationsbeläggning.
- Med en diamantspets, skär ett mikroskopglas, (tjocklek ≈ 1 mm) till samma laterala dimensionerna hos ITO-belagda substrat. Ta bort P3HT: PCBM lösningen från plattan och låt den svalna till rumstemperatur.
- Ställ in en två-steps spin-beläggnings program: i) 30 sekunder vid 800 varv per minut; ii) 30 sekunder vid 1600 rpm. Placera bilden på chuck spinnbeläggnings och starta vakuum för att fixa det. Sätt en droppe aceton på bilden och sedan rensade substratet, med ITO-belagda sidan uppåt. Starta spinnbeläggnings rotation för att bli av med överskott av aceton.
- Sätt 150 pl P3HT: PCBM lösningen på substraten och börja om igen av spinnbeläggaren (använd samma protokoll som beskrivits i 1.3.2).
- Efter spinnbeläggnings är klar, ta bort provet och försiktigt loss belagda substratet från objektglaset. Rengör baksidan av substratet med en renrumsstuss doppad i aceton.
Anmärkning: De fotoaktiva substraten kan lagras under några dagar i en mörk låda fram till användning. För längre perioder, förvara dem på ett handskfack med inert gas.
2. Beredning av cellodlingsmedium och Elektrofysiologi Solutions
- Förbered komplett tillväxtmedium (CGM) förHEK-293-celler: Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) inte värmeinaktiverat, 100 U / ml penicillin och 100 | ig / ml streptomycin. Sterilisera medium med en 0,2 | im filtreringssystem och förvara vid 4 ° C.
- Förbered extracellulära lösningen i ultrarent vatten (koncentrationer i mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 glukos, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2. Justera pH till 7,4 med NaOH. Sterilisera lösningen med en 0,2 | im filtreringssystem och förvara vid 4 ° C.
- Förbered intracellulära lösningen i ultrarent vatten (koncentrationer i mM): 12 KCl, 125 K-glukonat, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Observera att ATP-Na 2 är värmekänsligt och lägga till den sista. Justera pH till 7,4 med NaOH. Sterilisera lösningen med en 0,2 | im filtreringssystem, alikvot i 1 ml-rör och förvaras vid -20 ° C.
3. Plating HEK-293-cellerpå Active substrat
- Placera den fotoaktiva substratet i en glasbägare täckt med aluminiumfolie eller en stängd petriskål och sattes i en ugn vid 120 ° C under 2 h för sterilisering. Från detta ögonblick och framåt, utföra alla operationer i sterila förhållanden. Placera proven i en steril huva och låt dem svalna.
- Coat den fotoaktiva substratet med ett vidhäftningsskikt för att minska ytan hydrofobicitet och att främja celladhesion.
- Placera de aktiva substrat i en P35 petriskål eller ett 6 flerkällsplatta. Med tanke på hydrofobiciteten av den konjugerade polymerskiktet, göra en polydimetylsiloxan (PDMS) väl för att fixera provet och begränsa lösningarna.
- Blanda PDMS och katalysator i en 10: 1 förhållande med en glasstav för erhållande av en viskös uppslamning.
- Häll uppslamningen i en 6 flerkällsplatta, dispensering en mängd tillräcklig för att täcka halv av varje brunn.
- Vänta PDMS polymerisationen vid RT.
- Skär härdade PDMS i mitten för obtaining en fyrkantig form med samma dimension polymerprovet.
- Sterilisera PDMS brunnarna genom nedsänkning i en blandning 70% etanol-vatten i minst 30 minuter.
- Vid användning av PDMS väl, skrapa den fotoaktiva skiktet längs hela gränsen av brunnen med spetsiga pincett, för att undvika frigöring av hela skiktet vid borttagning PDMS väl efter cellodling.
- Täcka hela ytan hos varje prov med en fibronektin-lösning (2 mg / l i PBS). En volym mellan 500 till 750 pl per prov är oftast tillräckligt om en PDMS väl används (klar yta av brunnen: 15x15 mm 2). Utan PDMS väl, ca 2 ml av fibronektinlösningen är nödvändiga för att fullständigt nedsänka provet; uppmärksamma att underlaget inte flyter under tillsats av lösningen. Inkubera proverna vid 37 ° C under minst en timme.
- Avlägsna fibronektinlösningen med en glaspipett och tvätta en gång med 2 ml PBS.
- Placera de aktiva substrat i en P35 petriskål eller ett 6 flerkällsplatta. Med tanke på hydrofobiciteten av den konjugerade polymerskiktet, göra en polydimetylsiloxan (PDMS) väl för att fixera provet och begränsa lösningarna.
- Plåt HEK-293-celler på fibronektin-behandlade prover med en täthet av 15.000 celler / cm 2 i fullständigt tillväxtmedium. Använd en volym av 750-1,000 il CGM för varje prov om en PDMS väl används, annars 2-3 ml CGM är nödvändiga. Inkubera cellerna vid 37 ° C och 5% CO2 under 24-48 timmar.
4. Optisk Stimulering Protokollet och Elektro Mätningar
- Sätt den extracellulära lösningen i ett vattenbad vid 37 ° C för att thermalize; tina intracellulära lösningen, lägga den i en 1 ml spruta med en 34 gauge nål och hålla den i kontakt med is för att undvika nedbrytning av ATP.
- Ta en cellbelagda substratet från inkubatorn, försiktigt avlägsna PDMS väl om den är närvarande. Avlägsna odlingsmediet med en glaspipett och skölj provet med extracellulär lösning. Fortsätt långsamt för att undvika cell lossnar.
- Sätt enheten i provhållaren av elektro station med extracellulära Solution och referenselektroden. Förbered färsk glasmikropipetter för patch-clamp med en avdragare (perfekt motstånd ligger i intervallet 2-4 MQ). Fyll hälften av pipetten med intracellulära lösning och montera den på mikromanipulator.
- Leta efter en frisk cell att lappa på enheten. För att undvika oönskad excitering av fotoaktiva substratet använder IR-belysning för avbildning, placera en långvågigt passfilter (till exempel, kan en nedskärning våglängd λ = 750 nm användas för polymerer som absorberar i det synliga) framför mikroskop belysningen.
- Patch den valda cellen och tillämpa önskade protokollet för optisk stimulering genom att leverera ljus till provet via fluorescensexcitation väg mikroskop (Figur 1). En detaljerad beskrivning av patch-clamp-protokollet kan hittas i referens 20.
- Placera fläckpipetten i omedelbar närhet till cellmembranet med en mikrometer manipulator. Under positioneringen, applicera overpressure till pipetten för att undvika smuts fastnar på spetsen. Pipetten bör vara några mikrometer över cellen.
- Börja sänka pipetten mot cellmembranet samtidigt som du styr pipetten motståndet på plåstret styrprogram. När pipetten motståndet har ökat ungefär 1 MQ, ta bort övertrycket från pipetten samtidigt som en skonsam sugkraft för att bilda gigatätning mellan pipetten och cellmembranet (dvs den uppmätta resistansen ska öka på värden som är större än 1 GΩ) .
- Applicera en negativ potential till pipetten nära den förväntade cell vilopotential (för HEK293 cell en potential -40 mV kan användas) för att hjälpa till att stabilisera tätningen. Kompensera de kapacitiva transienter på grund av pipetten kapacitans med de relativa kommandon på plåstret förstärkare och / eller plåstret styrmjukvaran.
- Bryt membranet för att medge elektrisk åtkomst till cellcytoplasman genom att tillämpa en kort och intensiv sugpulsentill pipetten. Ställ plåstret förstärkaren till strömtång läge (I = 0, det vill säga, med ingen ström injiceras i cellen) för att spåra cellmembranpotentialen. Vänta några minuter för att se om cellpotentialen är stabil.
- Applicera den önskade belysningen protokollet till cellen och spela effekten på membranpotentialen.
Obs: Belysningen kan levereras till provet antingen från botten eller från ovansidan, beroende på mikroskopet arkitekturen.- Välj en excitationsvåglängd som är väl absorberas av det aktiva materialet; för P3HT: PCBM blandning, kan användas en våglängd inom 450-600 nm-området. Lämpliga fotoexcitation tätheter ligger inom intervallet 10-100 mW / mm 2.
Obs: Korta ljuspulser (under 10-20 ms) resulterar i en övergående depolarisering av cellen, medan med långvarig belysning (hundra millisekunder eller längre pulser) en ihållande hyperpolarisation observeras tills lampan släcks.
- Välj en excitationsvåglängd som är väl absorberas av det aktiva materialet; för P3HT: PCBM blandning, kan användas en våglängd inom 450-600 nm-området. Lämpliga fotoexcitation tätheter ligger inom intervallet 10-100 mW / mm 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler kan lätt odlas på P3HT: PCBM substrat, under förutsättning att ett lämpligt vidhäftningsskikt deponeras (som fibronektin användes i steg 3,2 av det beskrivna protokollet). P3HT: PCBM optisk absorptionstoppar i den gröna delen av det synliga spektrumet, men andra ljuskänsliga konjugerade polymerer kan väljas, enligt den föredragna fotostimulering våglängder intervall (Figur 2). Biokompatibilitet av dessa substrat har visats inte bara med cellinjer 18,21 som HEK-293, men också med primära kulturer av neuroner 15 och astrocyter 17 En typisk mikrofotografi av friska HEK-293-celler odlade på en P3HT:. PCBM filmen visas i figur 3. Optisk stimulering av celler förmedlas av de fotoaktiva substrat kan resultera i olika effekter på cellmembranet, beroende på hur länge den Ijusstimulus. 18 Vid starten av ljuspulsen, ensnabb spik (med en intensitet av ca 3 mV och en varaktighet på ca 1 ms) kan observeras i cellmembranet potentiella inspelningar (Figur 4). Denna signal beror på en kapacitiv laddning av polymer / elektrolyt vid laddningsgenerering i det aktiva materialet.
Efter denna första snabb spiking, är en övergående depolarisation (med en intensitet av ca 1 mV och en varaktighet i storleksordningen tiotals millisekunder) observerades i cellen (Figur 4). För korta ljuspulser, som ljuset är avstängd, är en motsatt beteende observerats. Dessa signaler har tillskrivits en variation i membran kapacitans på grund av lokal uppvärmning efter Ijusabsorption.
Vid långvarig belysning, men den initiala depolarisering under de ljuspulser förvandlas till en cell hyperpolarisation (Figur 5). Detta fenomen har enfå en termisk ursprung, men i detta fall det är relaterat till en variation av membranjämviktspotential på grund av en ändring i de jonkanaler konduktiviteter som induceras av den ökade temperaturen.
Figur 1. Skiss av den fotoaktiva substratet. De fotoaktiva gränssnitt som används för cellulär optisk stimulering är gjorda av en tunn film av organiska halvledare avsatta på ett ITO-belagt glassubstrat. Celler kan odlas direkt på enheten ytor efter den har behandlats med ett lämpligt vidhäftningsskikt (t.ex. fibronektin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Absorp tionsspektra för olika konjugerade polymerer. Användning av tunna filmer av organiska halvledare kan tillåta stor avstämbarhet i exciteringsvåglängd samtidigt som en partiell transparens av substratet. Som ett exempel, absorptionsspektra olika konjugerade polymerer som normalt används i solceller redovisas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. HEK-293-celler odlas på ett fotoaktiv substrat. Typiska mikrofoto av HEK-293-celler odlade på ytan av en fotoaktiv substratet efter 24 h av inkubation. Skala bar, 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Optisk stimulering av HEK-293-celler med 20 ms ljuspulser. Variation av membranpotentialen hos en HEK-293-cell som framkallas av en 20 ms puls av ljus. En initial snabb spik vid början av ljuset följs av en depolarisering av cellen under pulsen. När ljuset släcks, en motsatt beteende observeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Optisk stimulering av HEK-293-celler med 200 ms ljuspulser. Variation i membranpotentialen hos en HEK-293-cell som framkallas av en 200 ms puls av ljus. Den initiala depolarisation observeras för kort Illumnering är bara en övergående fenomen, som efter några tiotals millisekunder längre belysning förvandlas till en hyperpolarisering av cellen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i den rapporterade protokollet för in vitro optisk stimulering av celler avser främst valet av ljuskänsliga polymer, de termiska steriliseringsparametrar, intensiteten och varaktigheten av ljusstimuli. En P3HT: PCBM tunn film valdes här, eftersom det garanterar god tids och elektrokemisk stabilitet. Man bör dock notera att inte alla ljuskänsliga polymerer kan erbjuda analoga föreställningar, 22 närmare bestämt vid belysning. Dessutom, i detta fall valt värmesterilisering parametrar inte leder till betydande försämring av polymer optoelektroniska egenskaper; meddelande dock att, om steriliseringsmetoden eller de termiska behandlingsparametrar ändras, eventuella effekter på polymeregenskaperna bör noga utvärderas. Det är känt, till exempel, leder till att UV-exponering snabbt till irreversibel polymer blekning och nedbrytning, på grund av konjugering förlust. Dessutom, olika glödgningtemperaturer och varaktigheten kan leda till olika morfologiska ordning polymerytan, med negativa effekter på den elektriska laddningen transportegenskaper. Parametrarna för fotoexcitation protokollet bör utvärderas noggrant liksom: exciterings densiteter över 100 mW / cm 2, och / eller långvarig stimuli, kan lätt leda till polymernedbrytning och fel på fotostimulering protokollet. Ett annat kritiskt steg i protokoll består i användningen av ett protein vidhäftningsskikt, beroende på den höga hydrofobiciteten graden av P3HT: PCBM yta. Om ingen adhesionsskikt används i förverkligandet av bio-polymergränsytan, cellsådd och proliferation kan allvarligt äventyras.
Inom de ovan nämnda kritiska steg och begränsningar, men den rapporterade protokollet kan rakt ändras, i enlighet med de särskilda experimentella behov och mål. Andra stabila, ljuskänsliga polymerer kan hittas, 7 från flera comkommersiell leverantörer eller genom att på lämpligt syntetisera nya föreningar. Detta möjliggör användning av olika exciteringsvåglängder, som spänner från blått till rött och NIR-området. Dessutom är polymeravsättningstekniken inte begränsad till spinnbeläggning används. I själva verket kan andra metoder som säkerställer god homogenitet och lämplig skikttjocklek övervägas, såsom bläckstråleutskrift, sprutbeläggning, eller skridskoåkning Effekterna av långvarig kontakt med cellväxtmedier och steriliseringsmetoden bör utvärderas för varje nytt material beaktas. Även om är nödvändigt att använda proteinvidhäftningslager för att få bra cellkulturer ovanpå polymerytor, den specifika användningen av fibronektin, som redovisas här är inte obligatoriskt. Olika vidhäftningsprotein skikt kan användas, även i enlighet med cellinjen att växa, 21 till exempel, neuronala celler är vanligtvis odlas på en poly-L-lysin-skiktet. Slutligen kan belysnings protokollen ändras och anpassas till specific behov när det gäller våglängd, punktstorlek, effekt excitation täthet, tid stimuli varaktighet och frekvens, ljusinfall riktning (från substratet eller från elektrolytbadet). Som kortfattat ovan, dock bör definitionen av protokollparametrar beakta polymeren optiska absorption räckvidd och eventuella nedbrytningseffekter, som kan variera mycket från fall till fall.
Den begränsade tidsmässiga och elektrokemisk stabilitet vissa ljuskänsliga polymerer faktiskt representerar de viktigaste begränsningarna av tekniken. Dessutom kan användning av kommersiella polymerer utan någon ytterligare rening bly i vissa fall till begränsad repeterbarhet av resultaten mellan olika partier av materialet, på grund av olika renhetsgrad.
Vi märker också att de exakta mekanismerna vid basen av ljusöverledningen effekt i CSPP protokoll som fortfarande behöver belysas ytterligare och karakteriseras. Termiska, elektriska och kemiska phenomena är möjligen inblandade, vid olika utsträckning i olika biologiska modeller. En fullständig förståelse kommer att vara avgörande för att till fullo utnyttja tekniken. Framför allt bör förekomsten av värmemedierade fenomen ses som en begränsning av tekniken, eftersom det kan knappast kontrolleras, och kan leda till lokal överhettning effekter, särskilt när det gäller tillämpningar in vivo. Ett specifikt genomförande av enheten, som syftar till att reglera värme diffusion i den extracellulära miljön genom korrekt konstruktion av värmeledande vägar, kan avslöja nödvändiga inom den närmaste framtiden för fullt utnyttjande av tekniken.
I litteraturen, olika tekniker som använder optiska pulser för temperatur-medierad stimulering av celler och vävnader, både in vitro och in vivo kan hittas. I dessa studier, är absorptionen av IR laserstrålar av vatten som vanligtvis används som en transduktionsmekanism. 23-25 När det gäller IRNeural Stimulering har CSPP mekanismen distinkta fördelar, särskilt för in-vitro-experiment. CSPP baseras på ljus i det synliga området och av måttlig intensitet, så att stimulering kan åstadkommas genom exciteringsbanan för en standardfluorescensmikroskop. Tvärtom kräver vattenabsorption våglängder i IR (främst kring 1,45 pm och 1,93 pm), som måste levereras till provet via externa källor som optiska fibrer micromanipulated i närheten av preparatet, eftersom den optiska tåget av en standard mikroskop kan inte användas vid sådana våglängder. I fallet med CSPP kan ljussmönstren som erhölls med laseravsökningssystem samt de spatiala Ijusmodulatorer vara direkt kopplad till den optiska serien av de flesta mikroskop. På detta sätt kan den fotostimulering av substrat på basis av organiska halvledare gör det möjligt att erhålla stimulering av flera celler i synfältet oberoende, med både hög temporal en nd rymdupplösning.
En annan mycket värdefullt alternativ för optisk stimulering erbjuds av genetiska metoder, baserat på inriktningsbar uttryck av genetiskt fotoaktiverbara prober i celler. Optogenetik erbjuder numera motstycke temporal och spatial upplösning, med typiska belysningsnivåer i området av några tiotal mW / mm 2, kan både excitera och inhibera elektrisk aktivitet, och kan genetiskt riktas till specifika delpopulationer av specifika delar av hjärnan är av intresse. Men fortfarande presenterar den vissa frågor som måste lösas. I synnerhet säkerhet oro över användningen av virus för genuttryck, särskilt hos människor, och att uppnå en stabil och kontrollerad långsiktigt heterologt proteinuttryck utgör fortfarande stora utmaningar. CSPP teknik gör det möjligt att kringgå behovet av genöverföring, och alla relaterade säkerhetsfrågor, som är särskilt relevant för in vivo applikationer.
jove_content "> Sammantaget erbjuder CSPP metoden flera fördelar med avseende på endogena photostimulation teknik. Eftersom det är inte invasiva, kan det vara lätt kopplas till befintliga elektro arbetsstation och det kräver inte komplexa laserkällor eller genetisk transfektion, medan upprätthålla en hög spatial och temporal selektivitet. Av dessa skäl har CSPP lovar att bli en kompletterande verktyg inom neurovetenskap in-vitro-undersökningar, och att öppna nya perspektiv in vivo applikationer. Men en stor insats från materialvetenskap, fysik och teknik samhällen väntas under de kommande åren, som behövs för att förbättra, optimera och fullt utnyttja tekniken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
