Introduction
Muligheden for at manipulere den cellulære aktivitet med en præcis rumlig og tidsmæssig opløsning repræsenterer en vigtig strategi i neurovidenskabelig forskning og behandling af neurologiske og psykiatriske lidelser. Er 1 Traditionelle metoder baseret på elektrisk stimulation af celler ved hjælp af elektroder placeret i nærhed eller i kontakt med målrettet system 2, som kan være af forskellig kompleksitet (enkelt celle, mobilnetværk, hjerneskiver, in-vivo hjernevæv). I det forløbne århundrede har brugen af patch-clamp, metal og substrat-integrerede elektroder givet et detaljeret billede af fysiologi og patofysiologi af enkelte neuroner og de fungerende mekanismer neurale netværk. Men elektrisk stimulering lider vigtige begrænsninger. Den første er forbundet med en generelt dårlig rumlig opløsning på grund af de fysiske dimensioner af elektroderne og deres faste geometri, som ikke let kan tilpassestil komplekse organiserede systemer som biologisk væv. Ligeledes kan problemer i forbindelse med elektroderne impedans og krydstale mellem stimulering og registreringssystemer forringes den endelige signal-til-støj-forholdet for målingerne. 3 På den anden side kan anvendelsen af lys til stimulering bidrage til at overvinde mange begrænsninger af den elektriske tilgang. Først og fremmest, det giver en hidtil uset rumlige (<1 um) og tidsmæssig opløsning (<1 ms), hvilket gør det muligt at målrette specifikke celletyper eller endda sub-celle rum. Desuden er det særdeles ikke-invasiv, idet den undgår fysisk kontakt med vævet af interesse og disentangles stimulation fra optagelsen. Desuden kan både lysintensiteten og bølgelængde styres nøjagtigt og dermed forskellige stimuleringsprotokoller kan anvendes. 3,4
Men langt størstedelen af dyreceller ikke nogen specifik lysfølsomhed. Adskillige strategier for optisk stimulation er således blevet foreslået, enten udnytte lysfølsomme molekylære mediatorer i nærheden eller i cellerne, eller ved hjælp af fotoaktive enhed placeret eksternt tæt til cellen. Førstnævnte kategori refererer til endogene mekanismer som stimulering via synlige eller infrarøde (IR) lys, samt anvendelse af enten fotoisomeriserbare / fotospaltelig forbindelser eller den genetiske ekspression af lysfølsomme molekylære aktuatorer (optogenetics). Sidstnævnte klasse omfatter teknikker til exogen stimulering opnås ved anvendelse af uorganiske nano / micro-partikler eller fotoledende siliciumsubstrater. 5 Alligevel alle disse systemer har lyse sider og ulemper. Navnlig er svag og ikke pålidelige endogene absorption af celler i det synlige område og den ledsagende generering af reaktive oxygenarter kan være skadeligt for cellen. Generelt er IR anvendes til at inducere lokal termisk opvarmning på grund af vandabsorption, men ekstinktionskoefficienten for vand er lille, hvilket således kræver strong infrarødt lys (fra ti til hundredvis af W / mm2), der er vanskelig at levere via standard mikroskop optik og kan udgøre sikkerhedsmæssige bekymringer for in vivo-applikationer. På den anden side, tilgængeligt omstillelige anbringelse i bur forbindelser har en tidsbegrænset handling og kræver ofte UV-lys, der er svært at levere på grund af begrænset vævspenetration. Desuden lider de diffusionsproblemer af de aktiverede forbindelser upon fotolyse uden det belyste område. Endelig har optogenetic værktøjer tilladt forskere til at målrette specifikke cellulære delpopulation og undersektioner, og er hurtigt fremstår som en af de vigtigste teknologier i neurovidenskabelig forskning. Men indsættelse af et exogent DNA-segment via en viral vektor rejser vigtige sikkerhedsspørgsmål, navnlig i betragtning af vedtagelsen den menneskelige patienter. 5,6 Af disse grunde forskning i nye materialer og apparater, som kan celle optisk manipulation er et meget varmt emne.
For nylig er en hidtil ukendttilgang baseret på anvendelsen af lysfølsomme konjugerede polymerer, i stand til effektivt at transducere et optisk stimulus i en modulering af celle elektrisk aktivitet, er blevet foreslået. The Cell Stimulering af Polymer fotoexcitering (CSPP) teknik udnytter mange vigtige-aktivere funktioner typisk af organiske halvledere: de er uløseligt følsomme over for lys i det synlige område, 7 de er biokompatible, blød og komfortabel og deres mekaniske fleksibilitet tillader en intim grænseflade med væv både in vitro og in vivo 8-10. Bortset fra det, kan de let funktionaliseres til bedre at tilpasse sig grænsefladen med levende celler, og for at muliggøre specifik excitation, sondering og sensing kapaciteter. 11,12 Desuden de understøtter elektroniske såvel som ionisk transport, hvilket gør dem ideelle for kombinationen af elektronik ad biologi. 13,14 interessant, kan de arbejde i solcelle-tilstand, så man undgår behovet for at anvende en ekstern skævhed feller effektiv celle optisk stimulation. 15
Pålideligheden af CSPP teknik er tidligere blevet påvist i flere systemer, herunder primære neuroner, 15,16 astrocytter, 17 sekundære cellelinier 18 og eksplanterede retinale væv. 16. I dette arbejde, alle de nødvendige skridt til at fabrikere en lysfølsom bio-polymer grænseflade 19 til optisk stimulering af in vitro-systemer er beskrevet i detaljer. Som en undersøgelse tilfælde en prototypisk organisk solcelle blanding af region-regelmæssig poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), fungerer som elektron donor, og phenyl-C61-smørsyre-syre-methyl ester (PCBM), der fungerer som elektronacceptor anvendes. Som det biologiske system, der er menneskelige embryonale Nyre (HEK-293) celler anvendes. Et eksempel på en photostimulation protokol med den relative registrering af celleaktivitet via elektrofysiologiske målinger er tilvejebragt.
Den beskrevne platformer imidlertid af almen gyldighed, og det kan let udvides til anvendelse af andre konjugerede polymerer (ved passende justering af opløsningen fremstillingsprocessen og deposition parametre), forskellige celletyper (ved passende at ændre cellekultur-protokollen, plating procedure og ønskede tidspunkt for celle såning og spredning) samt forskellige stimulation protokoller (lys bølgelængde, stimuli hyppighed og varighed, fotoexcitering tæthed).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Fotoaktive Substrater
- Forbered en P3HT: PCBM opløsning (1: 1 vægt / vægt) i chlorbenzen ved en P3HT koncentration på 20 g / L. Bland opløsningen med en magnetomrører i mindst 4 timer ved 60 ° C. Overvej en volumen på 150 pi af opløsning for hvert substrat, der skal fremstilles.
- Ren ITO-coatede objektglas (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, tykkelse 170 um) med fortløbende bade deioniseret vand, acetone og isopropanol i en sonikator (10 min for hvert trin). Tør dækglassene med nitrogen pistol. Læg prøverne i en plasma renere ved 100 W strøm i 10 minutter.
- Deponere en tynd film af det aktive lag på de rensede substrater via spin-coating.
- Med en diamant spids, sender et mikroskop objektglas, (tykkelse ≈ 1 mm) til de samme laterale dimensioner af ITO-belagte substrater. Fjern P3HT: PCBM løsning fra varmepladen og lad det køle af til stuetemperatur.
- Sæt en to-stEPS spin-coater program: i) 30 sek ved 800 omdrejninger pr ii) 30 sekunder ved 1.600 rpm. Placer glider på patronen af spin-coater og start vakuum til at ordne det. Sætte en dråbe acetone på objektglasset og derefter renset substrat, med ITO-belagte side vender opad. Start spin-coater rotation til at slippe af med overskud af acetone.
- Sæt 150 pi P3HT: PCBM løsning på substraterne og start igen spin-coater (brug den samme protokol beskrevet i 1.3.2).
- Efter spin-coater er færdig, skal du fjerne prøven og forsigtigt frigøre substrat fra objektglasset. Rengør bagsiden af substratet med en renrum dyppet i acetone.
Bemærk: De fotoaktive substrater kan opbevares i nogle dage i en mørk boks indtil anvendelse. For længere perioder, holde dem i et handskerum med inaktiv gas.
2. Fremstilling af cellekulturmedium og Elektrofysiologiske Solutions
- Forbered komplet vækstmedium (CGM) forHEK-293-celler: Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) ikke varmeinaktiveret, 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin. Sterilisere mediet med en 0,2 um filtrering system og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered ekstracellulære opløsning i ultrarent vand (koncentrationer i mM): 135 NaCI, 5,4 KCI, 5 HEPES, 10 glucose, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2. Juster pH til 7,4 med NaOH. Sterilisere opløsningen med en 0,2 um filtrering system og opbevares ved 4 ° C.
- Forbered intracellulære opløsning i ultrarent vand (koncentrationer i mM): 12 KCI, 125 K-gluconat, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na2. Bemærk, at ATP-Na 2 er varmefølsomt og tilføje den sidste. Juster pH til 7,4 med NaOH. Sterilisere løsning med en 0,2 um filtrering system, alikvot i 1 ml rør og opbevares ved -20 ° C.
3. Plating HEK-293-cellerpå den aktive Substrater
- Placer fotoaktive substrat i et glasbæger dækket med aluminium eller en lukket petriskål og anbragt i en ovn ved 120 ° C i 2 timer til sterilisering. Fra dette øjeblik og fremefter, udføre alle operationer i sterile forhold. Læg prøverne i en steril hætte og lad dem afkøle.
- Coat den fotoaktive substrat med et klæbelag til at reducere overfladehydrofobicitet og fremme celleadhæsion.
- Placer de aktive substrater i en P35 petriskål eller en 6 flerbrøndsplade. I betragtning hydrofobiciteten af den konjugerede polymer lag, lave en polydimethylsiloxan (PDMS) og at fastsætte prøven og begrænse løsningerne.
- Bland PDMS og katalysator i en 10: 1 forhold med en glasstav til opnåelse af en viskos opslæmning.
- Hæld opslæmningen i en 6 flerbrøndsplade, dispensering en tilstrækkelig mængde til at dække halvdelen af hver brønd.
- Vente PDMS polymerisation ved stuetemperatur.
- Skær de hærdede PDMS i midten til SKAFFESlingen en kvadratisk form med samme dimension af polymeren prøven.
- Steriliser PDMS brønde ved nedsænkning i en ethanol-vand-blanding 70% i mindst 30 minutter.
- Hvis bruger PDMS godt, ridse fotoaktive lag langs hele grænsen af brønden med spidse pincet, for at undgå frigørelse af hele laget ved fjernelse PDMS godt efter celledyrkning.
- Dække hele overfladen af hver prøve med en fibronectin-opløsning (2 mg / l i PBS). Et volumen mellem 500-750 pi per prøve er normalt tilstrækkeligt, hvis en PDMS godt anvendes (klar overfladen af brønden: 15x15 mm 2). Uden PDMS godt, er det nødvendigt helt at fordybe prøven omkring 2 ml fibronektin løsning; Vær opmærksom på at underlaget ikke flyder, mens tilsætning af opløsningen. Inkuber prøverne ved 37 ° C i mindst 1 time.
- Fjern fibronectin opløsning med en glaspipette og vaskes en gang med 2 ml PBS.
- Placer de aktive substrater i en P35 petriskål eller en 6 flerbrøndsplade. I betragtning hydrofobiciteten af den konjugerede polymer lag, lave en polydimethylsiloxan (PDMS) og at fastsætte prøven og begrænse løsningerne.
- Plspiste HEK-293-celler på fibronectin-behandlede prøver ved en densitet på 15.000 celler / cm2 i komplet vækstmedium. Brug et volumen på 750-1,000 pi CGM for hver prøve, hvis en PDMS godt anvendes, ellers 2-3 ml CGM er nødvendige. Inkuber cellerne ved 37 ° C og 5% CO2 i 24-48 timer.
4. Optisk Stimulation Protocol og Elektrofysiologiske Målinger
- Sæt den ekstracellulære opløsning i et vandbad ved 37 ° C til thermalize; tø den intracellulære løsning, sætte det i en 1 ml sprøjte med en 34 gauge nål og holde det i kontakt med is for at undgå nedbrydning af ATP.
- Tag en celle-substrat fra inkubatoren, forsigtigt fjerne PDMS godt, hvis til stede. Fjern vækstmediet med et glas pipette og skylles prøven med ekstracellulære opløsning. Fortsæt langsomt for at undgå Cellefrigørelse.
- Sætte enheden i prøven-indehaveren af elektrofysiologi station med ekstracellulær opklaringn og referenceelektroden. Forbered friske glas mikropipetter til patch-clamp med en aftrækker (ideel modstand er i intervallet 2-4 MOhm). Fyld halvdelen af pipetten med intracellulære løsning, og montere den på mikromanipulator.
- Kig efter en sund celle til at lappe på enheden. For at undgå uønsket excitation af den fotoaktive substrat, anvender IR-belysning til billeddannelse, placere en lang bølgelængde pass filter (for eksempel kan et snit bølgelængde λ = 750 nm anvendes til polymerer, der absorberer i det synlige) foran mikroskopet illuminator.
- Patch den valgte celle og anvende den ønskede protokol til optisk stimulation ved at levere lys til prøven via fluorescens excitation vej i mikroskopet (figur 1). Der findes en detaljeret beskrivelse af plasteret-clamp-protokollen i henvisning 20.
- Placer patch-pipetten i umiddelbar nærhed af cellemembranen med en mikrometrisk manipulator. Under positionering, anvendelse overpressure til pipetten for at undgå snavs fast på spidsen. Pipetten bør være få mikrometer over cellen.
- Begynde at sænke pipetten mod cellemembranen, mens styring af pipetten modstand på plasteret styresoftware. Når pipetten resistens er steget omkring 1 MOhm, fjernes overtrykket fra pipetten samtidig anvende en mild sugning, med henblik på at danne gigaseal mellem pipetten og cellemembranen (dvs. bør den målte modstand øges ved værdier større end 1 GQ) .
- Påfør et negativt potentiale til pipetten tæt på den forventede celle hvilende potentiale (for HEK293 celle et potentiale på -40 mV kan anvendes) at bidrage til stabilisering forseglingen. Kompensere de kapacitive transienter som følge af pipetten kapacitans med de relative kommandoer på plasteret forstærker og / eller plasteret kontrol software.
- Bryde membranen for at tillade elektrisk adgang til cellecytoplasmaet ved at anvende en kort og intens sugning pulstil pipetten. Indstil patch forstærkeren til strømtang tilstand (I = 0, dvs. uden strøm, der føres ind i cellen) for at spore potentiale cellemembranen. Vent nogle minutter for at se, hvis den potentielle celle er stabil.
- Påfør den ønskede belysning protokol til cellen og registrere effekten på membranpotentialet.
Bemærk: Belysningen kan leveres til prøven enten fra bunden eller fra toppen, afhængigt af mikroskopet arkitektur.- Vælg en excitationsbølgelængde, som er godt absorberet af det aktive materiale; for P3HT: PCBM blanding, kan en bølgelængde i området 450-600 nm anvendes. Egnede fotoexcitering tætheder er i området 10-100 mW / mm2.
Bemærk: Korte lysimpulser (under 10-20 ms) resulterer i en forbigående depolarisering af cellen, mens med langvarig belysning (hundredvis af millisekunder eller længere impulser) er observeret en vedvarende hyperpolarisering indtil lyset slukkes.
- Vælg en excitationsbølgelængde, som er godt absorberet af det aktive materiale; for P3HT: PCBM blanding, kan en bølgelængde i området 450-600 nm anvendes. Egnede fotoexcitering tætheder er i området 10-100 mW / mm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celler kan let dyrkes på P3HT: PCBM substrater, forudsat at en passende adhæsion lag aflejres (ligesom fibronectin anvendt i trin 3.2 i den beskrevne protokol). P3HT: PCBM optisk absorptionstoppe i den grønne del af det synlige spektrum; imidlertid kan vælges andre lysfølsomme konjugerede polymerer, ifølge den foretrukne photostimulation bølgelængder område (figur 2). Biokompatibilitet disse substrater er blevet påvist ikke kun med cellelinier 18,21 som HEK-293, men også med primære kulturer af neuroner og astrocytter 15 17 En typisk mikrografi af sunde HEK-293-celler dyrket på en P3HT:. PCBM Filmen vises i figur 3. Optisk stimulering af celler medieret af fotoaktive substrater kan resultere i forskellige effekter på cellemembranen, afhængigt af varigheden af lysstimulus. 18 Ved begyndelsen af den lysimpuls, enkan observeres hurtigt spike (med en intensitet på omkring 3 mV og en varighed på ca. 1 ms) i cellemembranpotentiale optagelser (figur 4). Dette signal skyldes en kapacitiv opladning af polymer / elektrolytgrænseflade ved beregning generation i det aktive materiale.
Efter denne indledende hurtigt spiking er en forbigående depolarisering (med en intensitet på omkring 1 mV og en varighed på rækkefølgen af snesevis af millisekunder) observeret i cellen (figur 4). For korte lysimpulser, som lyset er slukket, observeres en modsat opførsel. Disse signaler er blevet tilskrevet en variation i membran kapacitans på grund af lokal opvarmning efter lysabsorption.
Ved langvarig belysning, men den oprindelige depolarisering under lysimpulser bliver til en celle hyperpolarisering (figur 5). Dette fænomen har enfå en termisk oprindelse, men i dette tilfælde det er forbundet med en variation af membranen ligevægtspotential følge af en ændring i ionkanalerne ledningsevner induceret af forøget temperatur.
Figur 1. Skitse af den fotoaktive substrat. De fotoaktive grænseflader, der anvendes til cellulære optiske stimulering er lavet af en tynd film af organiske halvledere aflejret på en ITO-overtrukket glassubstrat. Celler kan dyrkes direkte på enheden overflader, efter det er blevet behandlet med et passende friktion lag (fx fibronektin). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. suger ning spektre af forskellige konjugerede polymerer. kan Brugen af tynde film af organiske halvledere tillade stor justerbarhed i excitationsbølgelængden samtidig bevare en delvis transparens af underlaget. Som et eksempel, absorptionen spektre af forskellige konjugerede polymerer typisk anvendes i solceller er rapporteret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. HEK-293-celler dyrkes på et fotoaktivt substrat. Typisk mikrograf af HEK-293-celler dyrket på overfladen af et substrat fotoaktive efter 24 timer inkubation. Scale bar, 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Optisk stimulering af HEK-293-celler med 20 msek lysimpulser. Variation af membranpotentialet af HEK-293-celle fremkaldt af en 20 msek puls af lys. En indledende hurtig spike efter indtræden af lyset efterfølges af en depolarisering af cellen under impulsen. Da lyset er slukket, en modsat adfærd overholdes. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Optisk stimulering af HEK-293-celler med 200 msek lysimpulser. Variation i membranpotentialet af HEK-293-celle frembringes af en 200 msek puls af lys. Den oprindelige depolarisering observeret for korte Illumsøgelse er kun en forbigående fænomen, som efter par snese millisekunder af langvarig belysning bliver til en hyperpolarisering af cellen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin i den rapporterede protokol for in vitro optiske stimulering af celler vedrører primært valget af den lysfølsomme polymer, de termiske steriliseringsparametre, intensiteten og varigheden af lysstimuli. En P3HT: PCBM tynd film blev valgt her, da den sikrer god tidsmæssig og elektrokemisk stabilitet. Man bør dog bemærke, at ikke alle lysfølsomme polymerer kan tilbyde analoge forestillinger, 22 mere specifikt på belysning. Hertil kommer, i dette tilfælde valgt varmesterilisering parametre ikke fører til betydelig nedbrydning af polymeren optoelektroniske funktioner; varsel dog, at i tilfælde af, sterilisation metode eller den termiske behandling parametre ændres, mulige virkninger på de polymere egenskaber bør vurderes omhyggeligt. Det er kendt, for eksempel, at UV-eksponering fører hurtigt til irreversibel polymer blegning og nedbrydning, på grund af konjugation tab. Desuden forskellige annealingtemperaturer og varighed kan føre til forskellige morfologiske orden af polymeren overflade, med negative følger for de elektriske ladning transport egenskaber. Parametrene for fotoexcitering-protokollen bør vurderes omhyggeligt, samt: excitation tætheder over 100 mW / cm2, og / eller langvarige stimuli, kan let føre til polymer nedbrydning og svigt af photostimulation protokollen. Et andet kritisk trin i protokollen består i anvendelsen af et protein adhæsionslag, på grund af den høje hydrofobicitet graden af P3HT: PCBM overflade. Hvis der ikke vedhæftning lag er ansat i realiseringen af bio-polymer-interface, celle såning og spredning kan blive alvorligt kompromitteret.
Inden for de ovennævnte kritiske trin og begrænsninger, men den rapporterede protokol kan ligefrem ændres, efter de specifikke eksperimentelle behov og målsætninger. Andre stabile, lysfølsomme polymerer kan findes, 7 fra flere comkommercielle leverandører eller ved korrekt syntese af nye forbindelser. Dette muliggør anvendelse af forskellige excitationsbølgelængder, der spænder fra blå til rød og NIR rækkevidde. Endvidere er polymeren deposition teknikken ikke begrænset til spin-coating brug. Faktisk kan tænkes andre metoder, der sikrer god homogenitet og passende lagtykkelse, såsom inkjet-print, spray coating, eller blading Virkningerne af langvarig kontakt med celle vækstmedier og sterilisering metode bør evalueres for hvert nyt materiale tages i betragtning. Selvom det er nødvendigt at anvende protein klæbemiddellagene at opnå gode cellekulturer oven på polymere overflader, den specifikke brug af fibronektin, som rapporteret her, er ikke obligatorisk. Forskellige adhæsionsprotein lag kan anvendes, også i overensstemmelse med cellelinien at vokse; 21 fx neuronale celler er normalt dyrkes på et poly-L-lysin lag. Endelig kan belysning protokoller ændres og tilpasses til SPecific behov, i form af bølgelængde, punktstørrelse, power excitation densitet, tid stimuli varighed og frekvens, lysindfald retning (fra substratet eller fra elektrolytten bad). Som kort nævnt ovenfor, dog bør definitionen af protokolparametre tage hensyn til den polymere optiske absorption rækkevidde og mulige nedbrydningsprodukter effekter, som kan variere meget fra sag til sag.
Den begrænsede tidsmæssige og elektrokemisk stabilitet nogle lysfølsomme polymerer faktisk repræsenterer de vigtigste begrænsninger i teknikken. Endvidere kan brug af kommercielle polymerer uden yderligere rensning føre i nogle tilfælde til begrænsede repeterbarhed af resultater mellem forskellige partier af materialet, på grund af forskellig renhed grad.
Vi bemærker også, at stadig skal yderligere belyst og karakteriseret de præcise mekanismer i bunden af fototransduktion effekt i CSPP protokoller. Termiske, elektriske og kemiske phenomena er muligvis involveret, ved forskelligt omfang i forskellige biologiske modeller. En fuldstændig forståelse vil være nøglen til fuldt ud at udnytte teknikken. Især bør forekomsten af varme-medierede fænomener revideres som en begrænsning af teknikken, da det kan næppe styres, og kan føre til lokal overophedning virkninger, navnlig i tilfælde af in vivo-anvendelser. En specifik implementering af enheden, der tager sigte på at styre varmen diffusion i det ekstracellulære miljø ved korrekt konstruktion af varme-ledende stier, kan afsløre nødvendigt i den næste fremtid for den fulde udnyttelse af teknikken.
I litteraturen forskellige teknikker, der anvender optiske pulser for temperatur-medieret stimulering af celler og væv, både in vitro og in vivo kan findes. I disse undersøgelser, er absorptionen af IR laserstråler af vand normalt bruges som en transduktion mekanisme. 23-25 Med hensyn til infrarødNeural stimulering af CSPP mekanisme har tydelige fordele, især for in vitro eksperimenter. CSPP er baseret på lys i det synlige område og af moderat intensitet, således at stimulation kan tilvejebringes ved excitation vejen for en standard fluorescensmikroskop. Tværtimod vandabsorption kræver bølgelængder i IR (hovedsagelig omkring 1,45 um og 1,93 um), som skal leveres til prøven via eksterne kilder som optiske fibre micromanipulated i nærheden af præparatet, idet den optiske tog med en standard mikroskop kan ikke anvendes ved sådanne bølgelængder. I tilfælde af CSPP kan lysmønstrene opnået med laser scanning systemer samt de rumlige lysmodulatorer kobles direkte til den optiske toget fleste mikroskoper. På denne måde kan photostimulation af substrater baseret på organiske halvledere gør det muligt at opnå stimulering af flere celler i synsfeltet uafhængigt med både høj tidsmæssig a nd rumlig opløsning.
Et andet meget værdifuldt alternativ til optisk stimulering tilbydes af genetiske metoder, baseret på målrettes ekspression af genetisk fotoaktiverbare prober i celler. Optogenetics tilbyder i dag en hidtil uset tidsmæssig og rumlig opløsning, med typiske belysning intensiteter i intervallet par snese mW / mm2, kan både begejstre og hæmme elektriske aktivitet, og kan genetisk målrettes til specifikke sub-populationer af specifikke hjerneregioner af interesse. Men det er stadig præsenterer nogle problemer, der skal løses. Især sikkerhedsmæssige bekymringer vedrørende brugen af virus til genekspression, især hos mennesker, og opnåelse af en stabil og kontrolleret langsigtet heterolog proteinekspression stadig repræsenterer de store udfordringer. CSPP teknik gør det muligt at omgå behovet for genoverførsel, og alle relaterede sikkerhedsproblemer, som er særligt relevante for in vivo-applikationer.
jove_content "> Alt i alt CSPP metode giver adskillige fordele i forhold til endogene photostimulation teknikker. Da det ikke er invasiv, kan det let kobles til en eksisterende elektrofysiologisk arbejdsstation, og det ikke kræver komplekse laserkilder eller genetisk transfektion, mens opretholde en høj rumlig og tidsmæssig selektivitet. Af disse grunde CSPP holder løftet om at blive et supplerende redskab i neurovidenskab in vitro undersøgelser og til at åbne nye perspektiver i in vivo-applikationer. Men en stor indsats fra det materiale videnskab, fysik og teknik lokalsamfund forventes i de kommende år, er nødvendige for at forfine, optimere og udnytte teknikken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
