Introduction
Возможность манипулировать клеточную активность с точным пространственным и временным разрешением представляет собой ключевой стратегии в Нейрологическая исследований и в лечении неврологических и психиатрических расстройств. 1 Традиционные методы основаны на электрической стимуляцией клетки с использованием электродов, расположенных в непосредственной близости или в контакте с целевая система, 2, которые могут быть различной сложности (одной ячейке сотовой сети, срезах мозга, в естественных условиях тканях мозга). В прошлом веке, использование патч-зажим, металла и подложки интегрированных электродов обеспечили детальную картину физиологии и патофизиологии отдельных нейронов и функционирования механизмов нейронных сетей. Тем не менее, электрическая стимуляция страдает от важных ограничений. Первый из них связан с целом плохой пространственной разрешающей из-за физических размеров электродов и их фиксированной геометрии, которые не могут быть легко адаптированыдо сложных организованных систем, таких как биологические ткани. Кроме того, проблемы, связанные с сопротивлением электродов и перекрестных помех между стимуляции и записи систем может ухудшить отношения сигнал-шум измерений. 3 С другой стороны, использование света для стимуляции может помочь преодолеть многие ограничения электрической подхода. Прежде всего, это обеспечивает беспрецедентную пространственные (<1 мкм) и временным разрешением (<1 мс), что делает возможным для решения конкретных типов клеток или даже суб-клеточных отсеков. Кроме того, он обладает высокой неинвазивным, поскольку он позволяет избежать физического контакта с интересующей ткани и расчесываются стимуляции от записи. Кроме того, как интенсивность света и длина волны может быть точно регулируется и, таким образом различные протоколы стимуляции может быть применен. 3,4
Тем не менее, подавляющее большинство клеток животных не представляют какой-либо конкретной чувствительность к свету. Несколько стратегий для оптического stimulatioп Таким образом, было предложено, либо используя светочувствительные молекулярные медиаторы поблизости или в клетках, или с помощью светочувствительного устройство, размещенное снаружи, близко к клетке. Первая категория относится к эндогенным механизмам, как стимулирование через видимого или инфракрасного (ИК) света, а также использование либо photoisomerizable / действием света соединений или генетической экспрессии фоточувствительных молекул приводов (оптогенетика). Последнее класс включает методы экзогенной стимуляции достигается при использовании неорганических нано / микрочастиц или фоторезисторов кремниевых подложках. 5 Тем не менее, все эти системы имеют светлые стороны и недостатки. В частности, эндогенной поглощение клетками в видимом диапазоне слаба и не надежны, и сопутствующее образование активных форм кислорода может быть вредным для ячейки. В общем, ИК используется для индукции местного теплового нагрева из-за поглощения воды, но коэффициент экстинкции воды мало, что требует улРонг инфракрасный свет (от десятков до сотен Вт / мм 2), что трудно поставить через стандартные оптики микроскопа и могут представлять проблемы безопасности для в естественных приложений. С другой стороны, фото-переключаемые останов соединения имеют времени ограниченные меры и часто требуют УФ-света, который трудно доставить из-за ограниченного проникновения в ткани. Кроме того, они страдают от диффузии проблем активированных соединений на фотолиза за пределами освещенной области. Наконец, optogenetic инструменты позволили ученым цель специфический клеточный субпопуляции и суб-купе и быстро становится одним из ключевых технологий в Нейрологическая исследований. Тем не менее, вставив экзогенный фрагмент ДНК с помощью вирусного вектора поднимает важные вопросы безопасности, особенно в связи с принятием на больных людей. 5,6 По этим причинам, исследования новых материалов и устройств, способных клеток оптической манипуляции является чрезвычайно актуальной.
Недавно романподход, основанный на использовании светочувствительных сопряженных полимеров, способных эффективно преобразовывать оптический стимул в модуляции электрической активности клеток, было предложено. Сотовый Стимуляция Polymer фотовозбуждения (CSPP) метод использует множество ключевых включение черты, характерные для органических полупроводников: они неразрывно чувствительны к свету в видимом диапазоне; 7 они являются биологически совместимыми, мягкой и послушной, и их механическая гибкость позволяет интимную интерфейс с тканью как в пробирке и в естественных условиях 8-10. Кроме того, они могут быть легко функционализированные лучше адаптироваться к интерфейсу с живыми клетками, и для того, чтобы конкретный возбуждение, зондирующего и чувствительный возможности. 11,12 Более того, они поддерживают электронного, а также ионного транспорта, что делает их идеальными для комбинации из электроники объявления биологии. 13,14 Интересно, они могут работать в режиме фотоэлектрической, избегая необходимость применения внешнего смещения Fили эффективность ячейки оптического возбуждения. 15
Надежность CSPP техники ранее было показано, в нескольких системах, в том числе первичных нейронов, астроцитов 15,16, 17 средних клеточных линий 18 и эксплантированных сетчатки тканей. 16 В этой работе, все шаги, необходимые для изготовления светочувствительного полимера био- Интерфейс 19 для оптического стимуляции в пробирке систем описаны в деталях. В случае исследования, прототипом органического фотоэлектрических смеси региона-регулярной поли (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), функционирующего в качестве донора электронов, и фенил-C61-бутановой кислоты метиловый эфир (PCBM), выступая в качестве используется акцептор электронов. В биологической системы, используют человека эмбриональной почки (НЕК-293) клеток. Пример протокола фотостимуляции с относительной записи активности клеток через электрофизиологических измерений обеспечивается.
Описанный платформаОднако общее значение, и оно может быть легко расширена для использования других полимеров сопр (путем правильной настройки процесса Получение раствора и параметров осаждения), различные типы клеток (путем соответствующего изменения протокола для культивирования клеток, покрытие процедуру и время требуемый для посева клеток и пролиферации) и различных протоколов стимуляции (длина волны света, стимулы частота и продолжительность, плотности фотовозбуждение).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка подложек фотоактивные
- Подготовьте P3HT: решение PCBM (1: 1 / в) в хлорбензоле при концентрации P3HT 20 г / л. Смешайте раствор с помощью магнитной мешалки в течение по крайней мере 4 ч при 60 ° С. Рассмотрим объемом 150 мкл раствора субстрата для каждого быть готовым.
- Чистые ITO покрытием стеклянные пластинки (R = 10 сек Ω / кв, 18х18 мм 2, толщина 170 мкм) с последовательными ванны деионизированной водой, ацетоном и изопропанола в соникатор (10 мин на каждом этапе). Высушите покровные с ружьем азота. Положите образцы уборщицей плазмы на 100 Вт в течение 10 мин.
- Депозит тонкую пленку активного слоя на очищенные подложки через спин-покрытием.
- С наконечником алмазов, вырезать микроскоп предметное стекло, толщина (≈ 1 мм) для тех же поперечных размеров подложек Ито покрытием. Снимите P3HT: PCBM решение от плиты и дайте ему остыть до комнатной температуры.
- Установите два-йEPS программа спин-для нанесения покрытий: я) 30 сек при 800 оборотов в минуту; II) 30 сек при 1600 оборотах в минуту. Поместите слайд на патроне спин-устройства для нанесения покрытий и начать вакуум, чтобы исправить это. Нанесите каплю ацетона на слайде, а затем очищенный субстрат, с боковой МТО покрытием вверх. Начните вращение спин-напылительной машины, чтобы избавиться от лишнего ацетона.
- Положите 150 мкл P3HT: решение PCBM на подложках и начать снова спин-машины для нанесения покрытия (используйте один и тот же протокол, описанный в 1.3.2).
- После того, как спин-для нанесения покрытий закончена, удалить образец тщательно отделить и подложки с покрытием из стекло. Очистите заднюю часть подложки с чистого помещения тампоном, смоченным в ацетоне.
Примечание: фотоактивные субстраты могут быть сохранены в течение нескольких дней в темном поле до использования. Для более длительных периодов, держать их в бардачке с инертным газом.
2. Подготовка клеточной культуральной среды и электрофизиологии Solutions
- Подготовьте полный питательную среду (CGM) дляКлеток НЕК-293: Модифицированная Дульбекко Игла Medium (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), не инактивированной теплом, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Стерилизацию среду с системой фильтрации 0,2 мкм и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка внеклеточный раствор в особо чистой воды (концентрации в мм): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 глюкозы, 1,8 CaCl 2, MgCl 2 1. Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH. Стерилизовать раствор с системой фильтрации 0,2 мкм и хранят при температуре 4 ° С.
- Подготовка внутриклеточного раствора в особо чистой воды (концентрации в мм): 12 KCl, 125 К-глюконат, 1 MgCl 2, 0,1 CaCl 2, 10 ЭГТА, 10 HEPES, 10 АТФ-Na 2. Обратите внимание, что АТФ-Na 2 является термочувствительным и добавить его в прошлом. Доведения рН до 7,4 с помощью NaOH. Стерилизацию раствора с системой 0,2 мкм фильтрации, аликвоту в 1 мл пробирок и хранят при -20 ° С.
3. Покрытие клеток НЕК-293На активном субстратов
- Поместите светочувствительного субстрата в стеклянном стакане, покрытой алюминием или закрытом чашке Петри и поставить в печь при 120 ° С в течение 2 ч для стерилизации. С этого момента и далее, выполнять все операции в стерильных условиях. Положите образцы в стерильных капот и дайте им остыть.
- Шерсть светочувствительный подложка с адгезионного слоя для уменьшения гидрофобность поверхности и способствовать адгезии клеток.
- Поместите активные субстраты в P35 Петри или 6 Multiwell пластину. Учитывая гидрофобность конъюгированного полимерного слоя, чтобы полидиметилсилоксан (PDMS) и зафиксировать образец и ограничить решения.
- Смешайте PDMS и катализатор в 10: 1 пропорции с помощью стеклянной палочки и получали вязкий суспензии.
- Вылейте суспензии в 6 многоямного пластины, дозирования сумму, достаточную для покрытия половины каждую лунку.
- Подождите полимеризации PDMS при комнатной температуре.
- Вырезать вылечить PDMS в середине для obtaоцен- ками квадратную форму того же размера образца полимера.
- Стерилизовать PDMS скважин от погружения в 70% смеси этанол-вода, по крайней мере 30 мин.
- При использовании PDMS также, поцарапать светочувствительный слой вдоль всей границы скважины с заостренными пинцетом, чтобы избежать отделение всему слою при удалении PDMS и после культивирования клеток.
- Покрывать всю поверхность каждого образца с раствором фибронектина (2 мг / л в PBS). Объем между 500-750 мкл на образец, как правило, достаточно, если PDMS также используется (четкое поверхность хорошо: 15x15 мм 2). Без PDMS также, около 2 мл фибронектина растворе необходимо полностью погрузить образец; обратить внимание, что подложка не плавает при добавлении раствора. Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение по меньшей мере 1 ч.
- Удалить фибронектина решение с стеклянной пипетки и мыть один раз 2 мл PBS.
- Поместите активные субстраты в P35 Петри или 6 Multiwell пластину. Учитывая гидрофобность конъюгированного полимерного слоя, чтобы полидиметилсилоксан (PDMS) и зафиксировать образец и ограничить решения.
- Plели НЕК-293 клеток на фибронектина обработанных образцов при плотности 15000 клеток на / см 2 в полной среде роста. Использование объем 750-1000 мкл ПГС для каждого образца, если PDMS также используется, в противном случае 2-3 мл ПГС необходимо. Инкубируйте клетки при 37 ° С и 5% СО 2 в течение 24-48 часов.
4. Оптический Стимуляция протокол и Электрофизиологические измерения
- Поместите внеклеточный раствор в водяной бане при 37 ° С до термализации; оттепель внутриклеточный решение, поставить его в 1 мл шприц с иглой 34 калибра и держать его в контакте со льдом, чтобы избежать деградации АТФ.
- Возьмем клеток-подложки с покрытием из инкубатора, тщательно удаляя PDMS также если он присутствует. Удалить ростовой среды с стеклянной пипетки и промыть образца с внеклеточной решение. Действуйте медленно, чтобы избежать клеток отряд.
- Положите устройство в образец-владельца электрофизиологии станции с внеклеточной SOLUTIOп и электрод сравнения. Подготовьте свежие стеклянные микропипетки для патч-зажим с выталкивающим (идеального сопротивления находится в диапазоне 2-4 МОм). Заполните половину пипетки с внутриклеточным раствором и смонтировать его на микроманипулятора.
- Посмотрите на здоровую клетку, чтобы залатать на устройстве. Чтобы избежать нежелательного возбуждение светочувствительного субстрата, используют ИК-подсветки для визуализации, помещая фильтр длинноволновый (например, сокращение длины волны λ = 750 нм может быть использован для полимеров, поглощающих в видимой) в передней части микроскопа осветителя.
- Патч выбранную ячейку и применять нужный протокол для оптического стимуляции путем предоставления свет к образцу с помощью пути возбуждения флуоресценции микроскопа (рис 1). Подробное описание протокола патч-зажим можно найти в ссылке 20.
- Поместите патч пипетки в непосредственной близости к клеточной мембране с микрометрической манипулятора. Во время позиционирования, применять overpressurе пипетки для того, чтобы избежать прилипания грязи на кончике. Пипетка должна быть несколько микрон выше ячейки.
- Начало снижения пипетки к клеточной мембране, контролируя сопротивление пипетки на программное обеспечение управления патч. Когда сопротивление пипетки увеличилась примерно 1 МОм, удалить избыточное давление из пипетки, применяя нежное всасывание, чтобы сформировать gigaseal между пипеткой и клеточной мембраны (т.е. измеренное сопротивление должно возрастать при значениях больше, чем 1 ГОм) ,
- Применить отрицательный потенциал на пипетки близко к ожидаемому ячейки потенциал покоя (для НЕК293 клеток с потенциалом -40 мВ могут быть использованы), чтобы помочь стабилизировать печать. Компенсировать емкостные переходные из-за пипетки емкостью с относительными команд на усилителе патч и / или программного обеспечения управления исправлениями.
- Перерыв мембрану, чтобы электрический доступ к цитоплазме клеток путем применения краткий и интенсивный импульс всасыванияпипетки. Установите патч усилитель для текущего режима зажим (I = 0, т.е. с не ток, подаваемый в камеру), чтобы отслеживать клеток мембранный потенциал. Подождите несколько минут, чтобы увидеть, если клетка потенциал стабильный.
- Применение нужный протокол освещения в камере и регистрируют воздействие на мембранный потенциал.
Примечание: Подсветка может быть доставлен к образцу или от нижней или сверху, в зависимости от архитектуры микроскопа.- Выбор длины волны возбуждения, что хорошо поглощается активного материала; для P3HT: PCBM смеси, длина волны в диапазоне 450-600 нм может быть использован. Подходящие плотности фотовозбуждения находятся в диапазоне 10-100 мВт / мм 2.
Примечание: Короткие импульсы света (ниже 10-20 мс) результат в переходном деполяризации клетки, в то время как при длительном освещении (сотни миллисекунд или дольше импульсов) с замедленным гиперполяризация наблюдается, пока свет не выключается.
- Выбор длины волны возбуждения, что хорошо поглощается активного материала; для P3HT: PCBM смеси, длина волны в диапазоне 450-600 нм может быть использован. Подходящие плотности фотовозбуждения находятся в диапазоне 10-100 мВт / мм 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Клетки могут быть легко культивировали на P3HT: PCBM субстратов, при условии, что подходящая адгезионный слой осаждается (как фибронектин, используемого на стадии 3.2, описанной протокола). P3HT: PCBM пики оптического поглощения в зеленой части видимого спектра; Однако другие светочувствительные сопряженные полимеры могут быть выбраны в соответствии с предпочтительным диапазоне длин волн Фотостимуляция (Рис.2). Биологическая этих субстратов было продемонстрировано не только с клеточными линиями, как 18,21 НЕК-293, но также и с первичных культурах нейронов и астроцитов 15 17 Типичная микрофотография здоровых клеток НЕК-293, культивированных на P3HT:. PCBM пленка показано на рисунке 3. Оптическая стимуляция клеток, опосредованных светочувствительных подложек может привести к различным эффектам на клеточной мембране, в зависимости от продолжительности светового раздражителя. 18 При наступлении светового импульса, Абыстро шип (с интенсивностью около 3 мВ и длительностью около 1 мс) можно наблюдать в клеточных мембран потенциальных записей (рисунок 4). Этот сигнал из-за емкостной зарядки раздела полимер / электролит при генерации заряда в активном материале.
После этого начального быстрого всплеска, переходный деполяризации (с интенсивностью около 1 мВ и длительностью порядка десятков миллисекунд) наблюдается в клетке (рис 4). Для коротких импульсов света, а свет выключен, противоположное поведение наблюдается. Эти сигналы были отнесены к изменению мембранного емкости из-за локального нагрева после поглощения света.
При длительном освещении, однако, начальная деполяризация во время световых импульсов превращается в мобильный гиперполяризации (рис 5). Это явление имеетполучить тепловую природу, но в этом случае она связана с изменением мембранного потенциала из-за равновесия с изменением ионных каналов проводимости, вызванных повышенной температуре.
1. Схема светочувствительного субстрата. Светочувствительный интерфейсы, используемые для клеточного оптической стимуляции изготовлены из тонкой пленки органических полупроводников, нанесенных на ITO-Стекло с покрытием. Клетки могут быть выращены непосредственно на поверхности устройства после его обрабатывают подходящим адгезии слоя (например, фибронектин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Absorp Спектры различных полимеров сопр ции. Применение тонких пленок органических полупроводников может позволить большую перестройки частоты в длине волны возбуждения при сохранении прозрачности частичное подложки. В качестве примера, спектры поглощения различных сопряженных полимеров, как правило, используется в солнечной энергетике сообщается. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. НЕК-293 клетки, культивированные на светочувствительном подложке. Типичный микрофотография НЕК-293 клеток, культивируемых на поверхности светочувствительного субстрата через 24 ч инкубации. Масштаб бар, 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Оптический стимуляция клеток НЕК-293 с 20 мс импульсов света. Изменение мембранного потенциала ячейки НЕК-293, индуцированной 20 мс светового импульса. Первоначальный быстро пик при наступлении света сопровождается деполяризации клетки в течение импульса. Когда свет выключен, наблюдается противоположная поведение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Оптическая стимуляция клеток НЕК-293 с 200 мс импульсов света. Изменение мембранного потенциала ячейки НЕК-293, индуцированной 200 мс светового импульса. Начальная деполяризация наблюдается короткий Illumминации только преходящее явление, которое через несколько десятков миллисекунд длительного освещения превращается в гиперполяризации клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги отчетный протокол для в пробирке оптического стимуляция клеток, главным образом, касаются выбор светочувствительного полимера, параметры тепловых стерилизации, интенсивность и продолжительность световых раздражителей. P3HT: PCBM тонкая пленка была выбрана здесь, так как это гарантирует хорошую временную и электрохимическую стабильность. Тем не менее, следует отметить, что не все светочувствительные полимеры могут предложить аналоговые спектакли, 22, более конкретно, при освещении. Кроме того, в данном случае выбран тепловой стерилизации параметры не приведет к значительным деструкции полимера оптоэлектронных функций; Уведомление, однако, что, в случае, если способ стерилизации или тепловые параметры лечения меняются, возможные последствия свойств полимерных должны быть тщательно оценены. Известно, например, что ультрафиолетовое облучение быстро приводит к необратимым полимерной отбеливания и деградации, из-за потери сопряжения. Кроме того, различные отжигатемпература и продолжительность может привести к различным морфологическим порядка полимерной поверхности с отрицательными эффектами на электрический заряд транспортных свойств. Параметры протокола фотовозбуждения должны быть тщательно оценены, а также: плотность выше 100 мВт / см 2, и / или длительных раздражителей возбуждения, может легко привести к деградации полимера и неудачи протокола фотостимуляции. Другим важным шагом в протоколе состоит в использовании белка адгезии слоя, из-за высокой степени гидрофобности P3HT: поверхности PCBM. Если нет адгезионный слой не используется в реализации био-полимерной интерфейс, посева клеток и пролиферации может быть серьезно нарушена.
В указанных выше критических шагов и ограничений, однако, сообщает протокол может быть изменен прямо, в зависимости от конкретных экспериментальных потребностей и целей. Другие стабильные, светочувствительные полимеры могут быть найдены, 7 из нескольких COMмерческий поставщиков или путем правильной синтеза новых соединений. Это позволяет использовать с различными длинами волн возбуждения, охватывая от синего до красного и NIR диапазоне. Кроме того, этот метод осаждения полимера не ограничивается использованием нанесения покрытия. Действительно, другие методы, обеспечивающие хорошую однородность и подходящую толщину пленки могут быть предусмотрены, например, струйной печати, напыления, или проточной последствий длительного контакта с растущими средах клеток и метода стерилизации должны быть оценены для каждого нового материала принимая во внимание. Хотя использование белковых адгезионных слоев необходимо получить хорошие клеточных культур в верхней части поверхности полимера, конкретного использования фибронектина, как сообщалось здесь, не является обязательным. Различные слои адгезии белка могут быть использованы, также в соответствии с клеточной линией для выращивания; 21, например, нервные клетки, как правило, культивируют на слое поли-L-лизин. Наконец, протоколы освещения может быть изменена и адаптирована к SPecific потребности, с точки зрения длины волны, размер пятна, плотность мощности возбуждения, времени стимулов продолжительности и частоты, направление света падения (из субстрата или из ванны электролита). Как заявил кратко выше, однако, определение параметров протоколов следует учитывать полимерного оптического диапазона поглощения и возможные последствия деградации, которая может изменяться много от случая к случаю.
Ограниченная временная и электрохимическая устойчивость некоторых светочувствительных полимеров на самом деле представляет основные ограничения метода. Кроме того, использование коммерческих полимеров без дополнительной очистки может привести в некоторых случаях к ограниченной повторяемости результатов среди различных партий материала, из-за разной степени чистоты.
Мы также заметили, что точные механизмы на базе эффекта фототрансдукции в протоколах CSPP все еще должны быть выяснены и дальше характеризуется. Тепловых, электрических и химических телenomena, возможно, являются участие, в различной степени в различных биологических моделей. Полное понимание будет ключевым в полной мере использовать технику. В частности, возникновение тепла опосредованного явлений должны быть рассмотрены как ограничение техники, так как он может быть едва управляется, и может привести к локальному перегреву эффектов, в частности, в случае применения в естественных условиях. Конкретной реализации устройства, в целях контроля рассеивание тепла в окружающую среду за счет внеклеточного надлежащего проектирования теплопроводных путей, может выявить необходимо в ближайшем будущем для полного использования техники.
В литературе различные методы, использующие оптические импульсы для измерения температуры опосредованной стимуляции клеток и тканей, как в пробирке и в естественных могут быть найдены. В этих исследованиях, поглощение лазерного луча ИК водой, как правило, используется в качестве механизма трансдукции. 23-25 В отношении к инфракрасномуНервного возбуждения, механизм CSPP имеет явные преимущества, особенно для в пробирке экспериментов. CSPP основан на свету в видимом диапазоне и умеренной интенсивности, так что стимуляция может быть обеспечена пути возбуждения стандартной флуоресцентной микроскопии. Напротив, водопоглощение требует длин волн в ИК (в основном вокруг 1,45 мкм и 1,93 мкм), который должен быть доставлен к образцу через внешние источники, такие как оптические волокна micromanipulated в непосредственной близости от препарата, поскольку оптическая поезде стандарта микроскоп не может быть использован в таких длинах волн. В случае CSPP, световые узоры, полученные с лазерного сканирования системы, а также от пространственных модуляторов света может быть непосредственно соединен с оптическим поезда большинства микроскопов. Таким образом, то фотостимуляция субстратов на основе органических полупроводников может сделать возможным получение стимуляцию нескольких ячеек в поле зрения независимо, как с высоким временным а й пространственное разрешение.
Другим весьма ценной альтернативой для оптической стимуляции предлагается генетическими методами, на основе выражения для ориентации генетически фотоактивируемых зондов в клетках. Оптогенетика предлагает в настоящее время беспрецедентную временное и пространственное разрешение, с типичными интенсивности освещения в диапазоне от нескольких десятков мВт / мм 2, оба могут возбуждать и ингибирует электрическую активность, и могут быть генетически направлены на определенных групп населения конкретных регионов мозга, представляющих интерес. Тем не менее, он по-прежнему представляет некоторые проблемы, которые должны быть решены. В частности, проблемы безопасности в отношении использования вирусов для экспрессии генов, особенно у людей, и достижение стабильного и контролируемого долгосрочной экспрессии гетерологичных белков-прежнему представляют собой серьезные проблемы. CSPP методика позволяет обойти необходимость переноса генов, и все связанные с проблемы безопасности, которые особенно актуальны для в естественных приложений.
jove_content "> В общем, способ CSPP предлагает несколько преимуществ по сравнению с эндогенными методами Фотостимуляция. Так как это не инвазивная, он может быть легко соединен с любой существующей электрофизиологического рабочей станции, и это не требует сложных лазерных источников или генетического трансфекции, а поддержание высокого пространственного и временного селективности. По этим причинам, CSPP держит обещание стать дополнительным инструментом в неврологии в пробирке исследований, и открыть новые перспективы в в естественных условиях применения. Тем не менее, большие усилия от материаловедения, физики и техники общины, как ожидается, в ближайшие годы, необходимых для уточнения, оптимизировать и полностью использовать технику.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
