Introduction
La posibilidad de manipular la actividad celular con una resolución espacial y temporal precisa representa una estrategia clave en la investigación neurocientífica y en el tratamiento de trastornos neurológicos y psiquiátricos. 1 Los métodos tradicionales se basan en la estimulación eléctrica de las células utilizando electrodos colocados en la proximidad o en contacto con el sistema de destino, 2 que puede ser de diferente complejidad (una sola célula, red celular, rodajas de cerebro, in vivo tejidos cerebrales). Durante el siglo pasado, el uso de patch-clamp, metal y electrodos de sustrato integrado han proporcionado una imagen detallada de la fisiología y la fisiopatología de las neuronas individuales y de los mecanismos de funcionamiento de las redes neuronales. Sin embargo, la estimulación eléctrica sufre de limitaciones importantes. La primera de ellas está relacionada con una generalmente pobre resolución espacial debido a las dimensiones físicas de los electrodos y su geometría fija, que no se pueden adaptar fácilmentea los sistemas organizados complejos como los tejidos biológicos. Además, los problemas relacionados con la impedancia de los electrodos y de la diafonía entre los sistemas de estimulación y de registro se pueden deteriorar la relación final de señal a ruido de las mediciones. 3 Por otro lado, el uso de la luz para la estimulación puede ayudar a superar muchas limitaciones del enfoque eléctrica. En primer lugar, ofrece espacial sin precedentes (<1 m) y la resolución temporal (<1 ms), por lo que es posible dirigir tipos de células específicas e incluso compartimentos de células sub. Además, es altamente no invasivo ya que evita cualquier contacto físico con el tejido de interés y desenreda la estimulación de grabación. Además, tanto la intensidad de luz de longitud de onda y se pueden regular con precisión y por lo tanto diversos protocolos de estimulación se pueden aplicar. 3,4
Sin embargo, la gran mayoría de las células animales no presentan ninguna sensibilidad específica a la luz. Varias estrategias para stimulatio óptican por lo tanto se han propuesto, ya sea explotando mediadores moleculares sensibles a la luz cerca o dentro de las células, o el uso de dispositivo de fotoactivo colocado externamente, cerca de la célula. La primera categoría se refiere a los mecanismos endógenos como el estímulo a través de (IR) de luz visible o infrarroja, así como el uso de cualquiera de los compuestos fotoisomerizables / fotoescindible o la expresión genética de los actuadores moleculares fotosensibles (optogenética). La última clase incluye técnicas para la estimulación exógena logrado con el uso de nano / micro-partículas inorgánicas o sustratos de silicio fotoconductores. 5 Sin embargo, todos estos sistemas tienen lados brillantes e inconvenientes. En particular, la absorción endógena de las células en el rango visible es débil y no fiable, y la generación concomitante de especies reactivas de oxígeno puede ser perjudicial para la célula. En general, IR se utiliza para inducir el calentamiento térmico local debido a la absorción de agua, pero el coeficiente de extinción de agua es pequeño, por lo que requiere stluz infrarroja rong (de decenas a cientos de W / mm 2), que es difícil de administrar a través de la óptica del microscopio estándar y puede plantear problemas de seguridad para aplicaciones en vivo. Por otra parte, los compuestos de introducción en jaulas foto-conmutable tienen una acción limitada en el tiempo y, a menudo requieren de luz UV que es difícil de entregar debido a la penetración de tejido limitado. Además sufren de problemas de difusión de los compuestos activados sobre la fotólisis fuera de la zona iluminada. Por último, las herramientas de optogenética han permitido a los científicos para apuntar subpoblación celular específica y sub-compartimientos y están emergiendo rápidamente como una de las tecnologías clave en la investigación neurocientífica. Sin embargo, la inserción de un segmento de ADN exógeno a través de un vector viral plantea problemas de seguridad importantes, sobre todo en vista de la adopción en pacientes humanos. 5,6 Por estas razones, la investigación sobre nuevos materiales y dispositivos capaces de manipulación óptica celular es un tema muy caliente.
Recientemente, una novela, se ha propuesto enfoque basado en el uso de polímeros conjugados sensibles a la luz, capaces de transducir eficientemente un estímulo óptico en una modulación de la actividad eléctrica celular. La estimulación de células por Polymer fotoexcitación (CSPP) técnica explota muchas características clave que permite típica de los semiconductores orgánicos: son intrínsecamente sensible a la luz en el rango visible; 7 que son biocompatibles, suave y conformable, y su flexibilidad mecánica permite una interfaz íntimo con el tejido tanto in vitro e in vivo 8-10. Aparte de eso, pueden ser fácilmente funcionalizados para adaptarse mejor a la interfaz con las células vivas, y para permitir la excitación específica, sondeo y detección de capacidades. 11,12 Además, soporte electrónico, así como el transporte iónico, lo que es ideal para la combinación del anuncio de la electrónica de la biología. 13,14 Curiosamente, pueden trabajar en modo fotovoltaico, evitando la necesidad de aplicar un sesgo f exterioro la estimulación óptica celular eficiente. 15
La fiabilidad de la técnica CSPP se ha demostrado previamente en varios sistemas, incluyendo las neuronas primarias, 15,16 astrocitos, 17 líneas de células secundarias 18 y los tejidos de la retina explantadas. 16 En este trabajo, todas las medidas necesarias para fabricar un bio-polímero sensible a la luz interfaz 19 para la estimulación óptica de los sistemas in vitro se describen en detalle. Como caso de estudio, una mezcla fotovoltaica orgánica prototípico de la región regulares poli (3-hexiltiofeno) (rr-P3HT), que funciona como el donador de electrones, y éster fenil-C61-butírico-ácido-metilo (PCBM), que actúa como el se emplea aceptor de electrones. A medida que el sistema biológico, se usan células embrionarias humanas de riñón (HEK-293). Se proporciona un ejemplo de un protocolo fotoestimulación con la grabación relativa de la actividad celular a través de mediciones electrofisiológicas.
La plataforma descritaSin embargo, es de validez general, y se puede extender fácilmente a la utilización de otros polímeros conjugados (ajustando correctamente el proceso de solución de la preparación y los parámetros de deposición), diferentes tipos de células (cambiando adecuadamente el protocolo de cultivo celular, procedimiento y tiempo solicitado chapado para la siembra y la proliferación celular) y diferentes protocolos de estimulación (longitud de onda de luz, de frecuencia estímulos y duración, densidad fotoexcitación).
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Protocol
1. Preparación de fotoactivos Sustratos
- Preparar una P3HT: PCBM solución (1: 1 w / w) en clorobenceno a una concentración de 20 g P3HT / L. Mezclar la solución con un agitador magnético durante al menos 4 horas a 60 ° C. Considere un volumen de 150 l de solución para cada sustrato que se preparó.
- Limpiar los portaobjetos de vidrio recubiertos con ITO (R = 10 Ω s / sq, 18x18 mm 2, el espesor de 170 micras) con baños consecutivos de agua desionizada, acetona e isopropanol en un aparato de ultrasonidos (10 min para cada paso). Seque el cubreobjetos con una pistola de nitrógeno. Poner las muestras en un limpiador de plasma a 100 W de potencia durante 10 min.
- Deposita una fina capa de la capa activa en los sustratos limpios a través de spin-coating.
- Con una punta de diamante, corte un portaobjetos de vidrio de microscopio, (espesor ≈ 1 mm) para las mismas dimensiones laterales de los sustratos recubiertos de ITO. Retire la P3HT: solución PCBM de la placa de cocción y deje que se enfríe a temperatura ambiente.
- Set de dos-steps programa spin-revestidor: i) 30 segundos a 800 rpm; ii) 30 segundos a 1.600 rpm. Posicionar el cursor en el mandril de la escisión revestidor e iniciar el vacío para arreglarlo. Ponga una gota de acetona en la diapositiva y, a continuación el sustrato limpiado, con la cara recubierta con ITO hacia arriba. Inicie el giro spin-recubridora para deshacerse del exceso de acetona.
- Poner 150 ml de P3HT: solución PCBM sobre los sustratos y empezar de nuevo el spin-revestidor (usar el mismo protocolo descrito en 1.3.2).
- Después de la escisión revestidor ha terminado, retire la muestra y separar cuidadosamente el sustrato revestido de la lámina de vidrio. Limpiar la parte posterior del sustrato con un hisopo de sala limpia por inmersión en acetona.
Nota: Los sustratos fotoactivos se pueden almacenar durante algunos días en una caja oscura hasta su uso. Para períodos más largos, los mantienen en una guantera con gas inerte.
2. Preparación de cultivos celulares de media y Electrofisiología Soluciones
- Preparar el medio de crecimiento completo (CGM) paraHEK-293 células: Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor no, 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina. Esterilizar el medio de un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C.
- Preparar la solución extracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 glucosa, 1,8 CaCl 2, 1 de MgCl 2. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración y se almacena a 4 ° C.
- Preparar la solución intracelular en agua ultrapura (concentraciones en mM): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl2, 0,1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Tenga en cuenta que la ATP-Na 2 es sensible al calor y agregarlo pasado. Ajustar el pH a 7,4 con NaOH. Esterilizar la solución con un sistema de 0.2 micras de filtración, la alícuota en 1 ml tubos y almacenar a -20 ° C.
3. Revestimiento HEK-293 célulassobre los sustratos activos
- Coloque el sustrato fotoactivo en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con aluminio o un plato Petri cerrada y poner en un horno a 120 ° C durante 2 hr para la esterilización. Desde este momento en adelante, realizar todas las operaciones en condiciones estériles. Poner las muestras en una campana estéril y dejar enfriar.
- Revestir el sustrato fotoactivo con una capa de adhesión para reducir la hidrofobicidad de la superficie y para promover la adhesión celular.
- Coloque los sustratos activos en un P35 placa Petri o una placa de múltiples pocillos 6. Dada la hidrofobicidad de la capa de polímero conjugado, hacer un polidimetilsiloxano (PDMS) para fijar bien la muestra y confinar las soluciones.
- Mezclar PDMS y el catalizador en un 10: 1 proporción con una varilla de vidrio para obtener una suspensión viscosa.
- Se vierte la suspensión en una placa de múltiples pocillos 6, dispensando una cantidad suficiente para cubrir la mitad de cada pocillo.
- Espere a que la polimerización PDMS a RT.
- Cortar las PDMS curados en el centro para obtanando una forma cuadrada de la misma dimensión de la muestra de polímero.
- Esterilizar el PDMS pozos por inmersión en una mezcla de etanol-agua 70% durante al menos 30 min.
- Si bien el uso de los PDMS, rayar la capa fotoactiva a lo largo de toda la frontera del pozo con pinzas puntiagudas, con el fin de evitar el desprendimiento de toda la capa cuando la eliminación de los PDMS bien después de cultivo de células.
- Cubrir toda la superficie de cada muestra con una solución de fibronectina (2 mg / L en PBS). Un volumen de entre 500 a 750 l por muestra suele ser suficiente si un PDMS también se utiliza (superficie transparente del pozo: 15x15 mm 2). Sin los PDMS así, alrededor de 2 ml de solución de fibronectina son necesarios para sumergir completamente la muestra; prestar atención a que el sustrato no flota, mientras que la adición de la solución. Incubar las muestras a 37 ° C durante al menos 1 hr.
- Eliminar la solución de fibronectina con una pipeta de vidrio y lavar una vez con 2 ml de PBS.
- Coloque los sustratos activos en un P35 placa Petri o una placa de múltiples pocillos 6. Dada la hidrofobicidad de la capa de polímero conjugado, hacer un polidimetilsiloxano (PDMS) para fijar bien la muestra y confinar las soluciones.
- Plcomió HEK-293 células en las muestras tratadas con fibronectina a una densidad de 15.000 células / cm2 en medio de crecimiento completo. Use un volumen de 750-1.000 l de CGM para cada muestra si un PDMS también se utiliza, en caso contrario 2-3 ml de CGM son necesarios. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO2 durante 24 a 48 horas.
4. protocolo de estimulación óptica y electrofisiológicos mediciones
- Ponga la solución extracelular en un baño de agua a 37 ° C a termalizar; descongelar la solución intracelular, lo puso en una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 34 y mantenerlo en contacto con el hielo para evitar la degradación del ATP.
- Tome un sustrato celular recubierto de la incubadora, retirando cuidadosamente los PDMS bien si está presente. Retire el medio de cultivo con una pipeta de vidrio y enjuague la muestra con solución extracelular. Proceda lentamente para evitar el desprendimiento de células.
- Ponga el dispositivo en la muestra-titular de la estación de electrofisiología con solutio extracelularn y el electrodo de referencia. Preparar micropipetas de vidrio frescos para patch-clamp con un extractor (resistencia ideal es en el rango de 2-4 mO). Llene la mitad de la pipeta con solución intracelular y montarlo en el micromanipulador.
- Busque una célula sana parchear en el dispositivo. Para evitar la excitación no deseada del sustrato fotoactivo, utilice iluminación IR para formación de imágenes, la colocación de un filtro de paso de longitud de onda larga (por ejemplo, un corte de longitud de onda λ = 750 nm se puede utilizar para los polímeros que absorben en el visible) en frente de la iluminador de microscopio.
- Parche la celda seleccionada y aplicar el protocolo deseado para la estimulación óptica mediante la entrega de la luz a la muestra a través de la trayectoria de excitación de fluorescencia del microscopio (Figura 1). Una descripción detallada del protocolo de patch-clamp se puede encontrar en la referencia 20.
- Coloque el parche pipeta en estrecha proximidad a la membrana celular con un manipulador micrométrica. Durante el posicionamiento, aplicar overpressure para la pipeta con el fin de evitar que se pegue la suciedad en la punta. La pipeta debe ser pocas micras por encima de la célula.
- Empezar a bajar la pipeta hacia la membrana celular mientras se controla la resistencia de la pipeta en el software de control de parche. Cuando la resistencia de la pipeta se ha incrementado aproximadamente 1 MW, eliminar la sobrepresión de la pipeta mientras se aplica una succión suave, con el fin de formar el gigaseal entre la pipeta y la membrana celular (es decir, la resistencia medida debe aumentar a valores mayores que 1 GΩ) .
- Aplicar un potencial negativo de la pipeta cerca de la celda esperada potencial de reposo (por HEK293 célula un potencial de -40 mV se puede utilizar) para ayudar a estabilizar el sello. Compensar los transitorios capacitivos debido a la capacitancia pipeta con los comandos relativos sobre el amplificador de parches y / o el software de control de parches.
- Romper la membrana para permitir el acceso eléctrico a la citoplasma de la célula mediante la aplicación de una breve e intensa del pulso de succióna la pipeta. Ajuste el amplificador de patch al modo de pinza de corriente (I = 0, es decir, sin corriente inyectada en la célula) para realizar el seguimiento del potencial de la membrana celular. Esperar unos minutos para ver si el potencial de la pila es estable.
- Aplicar el protocolo de iluminación deseada a la célula y registrar el efecto sobre el potencial de membrana.
Nota: La iluminación puede ser entregado a la muestra ya sea desde la parte inferior o desde la parte superior, dependiendo de la arquitectura microscopio.- Seleccione una longitud de onda de excitación que es bien absorbido por el material activo; para la P3HT: PCBM mezcla, una longitud de onda en el intervalo de 450-600 nm se puede utilizar. Fotoexcitación densidades adecuadas están en el rango de 10-100 mW / mm 2.
Nota: pulsos cortos de luz (por debajo de 10 a 20 ms) resultan en una despolarización transitoria de la célula, mientras que con la iluminación prolongada (cientos de milisegundos o pulsos más largos) se observa una hiperpolarización sostenida hasta que la luz se apaga.
- Seleccione una longitud de onda de excitación que es bien absorbido por el material activo; para la P3HT: PCBM mezcla, una longitud de onda en el intervalo de 450-600 nm se puede utilizar. Fotoexcitación densidades adecuadas están en el rango de 10-100 mW / mm 2.
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Representative Results
Las células pueden ser fácilmente cultivadas en P3HT: PCBM sustratos, siempre que una capa de adhesión se deposita adecuada (como la fibronectina utilizado en la etapa 3.2 del protocolo descrito). P3HT: PCBM picos de absorción óptica en la parte verde del espectro visible; Sin embargo, otros polímeros conjugados sensibles a la luz se pueden seleccionar, de acuerdo con el rango de longitudes de onda de fotoestimulación preferida (Figura 2). Biocompatibilidad de estos sustratos se ha demostrado no sólo con líneas de células HEK-18,21 como 293, pero también con cultivos primarios de neuronas y astrocitos 17 15 Una micrografía típica de HEK-293 células sanas cultivadas en un P3HT:. PCBM película se muestra en la Figura 3. estimulación óptica de las células mediadas por los sustratos fotoactivas puede dar lugar a diferentes efectos sobre la membrana celular, dependiendo de la duración del estímulo luminoso. 18 Tras la aparición del pulso de luz, unapico rápida (con una intensidad de alrededor de 3 mV y una duración de alrededor de 1 mseg) se puede observar en las grabaciones potenciales de membrana celular (Figura 4). Esta señal se debe a una carga capacitiva de la interfaz polímero / electrolito sobre la generación de carga en el material activo.
Después de este rápido aumento rápido inicial, una despolarización transitoria (con una intensidad de aproximadamente 1 mV y una duración del orden de decenas de milisegundos) se observa en la célula (Figura 4). Para pulsos cortos de luz, como la luz se apaga, se observa un comportamiento opuesto. Estas señales se han atribuido a una variación en la capacitancia de la membrana debido al calentamiento local después de absorción de luz.
Para la iluminación prolongada, sin embargo, la despolarización inicial durante los pulsos de luz se convierte en una hiperpolarización celular (Figura 5). Este fenómeno tiene unaobtener un origen térmico, pero en este caso se relaciona con una variación del potencial de equilibrio de membrana debido a un cambio en las conductividades canales iónicos inducidos por el aumento de la temperatura.
Figura 1. Esquema del sustrato fotoactivo. Las interfaces fotoactivos utilizados para la estimulación óptica celular están hechas de una película delgada de semiconductores orgánicos depositados sobre un sustrato de vidrio recubierta con ITO. Las células pueden ser cultivadas directamente sobre las superficies de dispositivos después de haber sido tratado con una capa de adhesión adecuado (por ejemplo, fibronectina). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. ABSORCIÓN la espectros de diferentes polímeros conjugados. El uso de películas delgadas de semiconductores orgánicos puede permitir gran capacidad de ajuste en longitud de onda de excitación al tiempo que conserva una transparencia parcial del sustrato. A modo de ejemplo, los espectros de absorción de los diferentes polímeros conjugados típicamente usado en la energía fotovoltaica se informó. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. HEK-293 células cultivadas sobre un sustrato fotoactivo. Micrografía típica de HEK-293 células cultivadas en la superficie de un sustrato después de 24 hr fotoactiva de incubación. Barra de escala, 20 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. estimulación óptica de las células HEK-293 con 20 pulsos de luz mseg. Variación del potencial de membrana de una célula HEK-293 provocada por un pulso de 20 mseg de la luz. Un pico rápido inicial a la aparición de la luz es seguido por una despolarización de la célula durante el pulso. A medida que la luz se apaga, se observa un comportamiento opuesto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. estimulación óptica de células HEK-293 con 200 pulsos de luz mseg. La variación en el potencial de membrana de una célula HEK-293 provocada por un pulso de 200 mseg de la luz. La despolarización inicial observado por sus siglas illuminación es sólo un fenómeno transitorio, que después de unas decenas de milisegundos de iluminación prolongada se convierte en una hiperpolarización de la célula. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los pasos críticos del protocolo reportado para in vitro estimulación óptica de células concierne principalmente la elección del polímero sensible a la luz, los parámetros de esterilización térmica, la intensidad y la duración de los estímulos luminosos. Un P3HT: película delgada PCBM fue seleccionado aquí, ya que garantiza una buena estabilidad temporal y electroquímica. Sin embargo, hay que notar que no todos los polímeros sensibles a la luz pueden ofrecer interpretaciones analógicas, 22 más específicamente sobre la iluminación. Además, en este caso seleccionado esterilización térmica parámetros no conducen a la degradación considerable de las características optoelectrónicas de polímero; aviso sin embargo, que, en caso de que se cambian el método de esterilización o los parámetros de tratamiento térmico, los posibles efectos sobre las propiedades del polímero debe ser evaluado cuidadosamente. Se sabe, por ejemplo, que la exposición UV conduce rápidamente a la decoloración y la degradación del polímero irreversible, debido a la pérdida de conjugación. Además, diferente de recocidotemperaturas y la duración pueden conducir a distinto orden morfológico de la superficie del polímero, con efectos negativos en las propiedades de transporte de carga eléctrica. Los parámetros del protocolo fotoexcitación deben ser cuidadosamente evaluados, así: densidades de excitación por encima de 100 mW / cm 2, y / o estímulos prolongados, pueden fácilmente conducir a la degradación del polímero y el fracaso del protocolo fotoestimulación. Otro paso crítico en el protocolo consiste en el uso de una capa de adhesión de proteínas, debido al alto grado de hidrofobicidad de la P3HT: PCBM superficie. Si no hay ninguna capa de adhesión se emplea en la realización de la interfaz de bio-polímero, la siembra de células y la proliferación podría verse seriamente comprometida.
Dentro de los pasos y limitaciones críticos antes mencionados, sin embargo, el protocolo registrada puede modificarse sin rodeos, de acuerdo con las necesidades y objetivos experimentales específicas. Otros polímeros estables, sensibles a la luz se pueden encontrar, 7 de varios comcomercial proveedores o sintetizando adecuadamente nuevos compuestos. Esto permite el uso de longitudes de onda de excitación diferentes, que abarca desde el azul al rojo y el rango NIR. Por otra parte, la técnica de deposición de polímero no se limita a la utilización de revestimiento por rotación. De hecho, otros métodos que garanticen una buena homogeneidad y espesor de película adecuado se pueden prever, como impresión por chorro de tinta, revestimiento por pulverización, o Blading Los efectos del contacto prolongado con los medios de cultivo de la célula y del método de esterilización deben ser evaluados para cada nuevo material tomado en consideración. A pesar de que es necesario el uso de capas de adhesión de proteínas para obtener cultivos de células buenas en la parte superior de las superficies de polímero, el uso específico de la fibronectina, como se informa aquí, no es obligatoria. Diferentes capas de proteína de adhesión se pueden usar, también de acuerdo con la línea de células para crecer; 21 por ejemplo, las células neuronales son generalmente cultivadas en una capa de poli-L-lisina. Por último, los protocolos de iluminación se pueden cambiar y adaptarse a SPecific necesidades, en términos de longitud de onda, el tamaño del punto, la densidad de excitación de potencia, tiempo de duración y la frecuencia de los estímulos, luz dirección de incidencia (desde el sustrato o del baño de electrolito). Como se ha dicho brevemente, sin embargo, la definición de los parámetros del protocolo debería tener en cuenta el rango de polímero óptico de absorción y los posibles efectos de degradación, que puede variar mucho de un caso a otro.
La estabilidad limitada temporal y electroquímica de algunos polímeros sensibles a la luz en realidad representa las principales limitaciones de la técnica. Además, el uso de polímeros comerciales sin purificación adicional puede llevar en algunos casos a la repetibilidad limitado de resultados entre los diferentes lotes de material, debido al diferente grado de pureza.
También notamos que todavía tienen que ser estudiada posteriormente y caracterizado los mecanismos precisos en la base del efecto fototransducción en los protocolos CSPP. Thermal, ph eléctrica y químicaenomena son posiblemente implicados, en diferentes grados en diferentes modelos biológicos. Una comprensión completa será la clave para aprovechar al máximo la técnica. En particular, la aparición de fenómenos mediada por calor debe ser revisado como una limitación de la técnica, ya que puede ser apenas controlada, y puede llevar a efectos sobrecalentamiento local, en particular en el caso de aplicaciones in vivo. Una aplicación específica del dispositivo, dirigido a controlar la difusión del calor en el ambiente extracelular por la ingeniería adecuada de caminos conductores de calor, podría revelar necesario en el futuro próximo para la plena explotación de la técnica.
En la literatura, las diferentes técnicas que utilizan pulsos ópticos para la estimulación mediada por la temperatura de las células y los tejidos, tanto in vitro e in vivo se pueden encontrar. En estos estudios, la absorción de rayos láser IR por el agua se utiliza generalmente como un mecanismo de transducción de 23-25. Con respecto a infrarrojosEstimulación Neural, el mecanismo de CSPP tiene claras ventajas, especialmente para la experimentación in vitro. CSPP se basa en la luz en el rango visible y de intensidad moderada, por lo que la estimulación puede ser proporcionada por el camino de excitación de un microscopio de fluorescencia estándar. Por el contrario, la absorción de agua requiere longitudes de onda en el IR (principalmente alrededor de 1,45 micras y 1,93 micras), que tienen que ser entregados a la muestra a través de fuentes externas como fibras ópticas micromanipulados en la proximidad de la preparación, ya que el tren óptico de una norma microscopio no se puede utilizar en tales longitudes de onda. En el caso de CSPP, los patrones de luz obtenidos con sistemas de escaneo láser, así como los moduladores espaciales de luz pueden ser acoplados directamente al tren óptico de la mayoría de los microscopios. De esta manera, la fotoestimulación de sustratos basados en semiconductores orgánicos puede hacer que sea posible la obtención de la estimulación de varias células en el campo de visión de forma independiente, tanto con un alto temporal resolución espacial nd.
Otra alternativa muy valiosa para la estimulación óptica es ofrecido por métodos genéticos, basados en la expresión targetable de sondas genéticamente fotoactivables en las células. Optogenética ofrece hoy en día la resolución temporal y espacial sin precedentes, con intensidades de iluminación típicas en el rango de pocas decenas de mW / mm 2, puede tanto excitar e inhibir la actividad eléctrica, y puede ser dirigido genéticamente para subpoblaciones específicas de regiones cerebrales específicas de interés. Sin embargo, todavía presenta algunos problemas que tienen que ser resueltos. En particular, los problemas de seguridad en relación con el uso de virus para la expresión de genes, especialmente en los seres humanos y el logro de largo plazo estable y controlada expresión de la proteína heteróloga siguen representando los principales desafíos. Técnica CSPP permite eludir la necesidad de la transferencia de genes, y todos los problemas de seguridad relacionados, que son particularmente relevantes para aplicaciones en vivo.
jove_content "> Con todo, el método CSPP ofrece varias ventajas con respecto a las técnicas de fotoestimulación endógenos. Dado que no es invasivo, se puede acoplar fácilmente a cualquier estación de trabajo electrofisiológico existente y no requiere fuentes de láser complejos o transfección genética, mientras el mantenimiento de una alta selectividad espacial y temporal. Por estas razones, CSPP es una promesa para convertirse en una herramienta complementaria en la neurociencia in vitro investigaciones, y para abrir nuevas perspectivas en las aplicaciones in vivo. Sin embargo, un gran esfuerzo por parte de la ciencia de los materiales, la física y la ingeniería las comunidades se espera que en los próximos años, necesarios para refinar, optimizar y aprovechar al máximo la técnica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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