Introduction
إمكانية للتلاعب في النشاط الخلوي مع القرار المكانية والزمانية الدقيق تمثل استراتيجية رئيسية في البحث العلمي العصبي وعلاج الاضطرابات العصبية والنفسية. وتستند 1 الأساليب التقليدية على التحفيز الكهربائي للخلايا باستخدام أقطاب المتمركزة في القرب أو في اتصال مع النظام المستهدف، (2) الذي يمكن أن يكون من تعقيد مختلفة (وحيدة الخلية، الشبكة الخلوية، شرائح الدماغ، في الجسم الحي أنسجة المخ). خلال القرن الماضي، وقد وفرت استخدام التصحيح، المشبك، والمعادن وأقطاب متكاملة الركيزة صورة مفصلة عن علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية من الخلايا العصبية واحدة وآليات عمل الشبكات العصبية. ومع ذلك، التحفيز الكهربائي يعاني من القيود الهامة. يرتبط أول من القرار المكانية الفقراء عموما بسبب الأبعاد المادية من الأقطاب الكهربائية والهندسة بهم ثابتة، والتي لا يمكن تكييفه بسهولةنظم نظم معقدة مثل الأنسجة البيولوجية. أيضا، المشاكل المتصلة مقاومة الأقطاب وعبر الحديث بين نظم التحفيز وتسجيل قد تتدهور نسبة النهائية للقياسات إشارة إلى الضوضاء. 3 ومن ناحية أخرى، فإن استخدام الضوء لتحفيز يمكن أن يساعد على التغلب على الكثير من القيود من نهج الكهربائية. أولا وقبل كل شيء، فإنه يوفر المكاني لم يسبق لها مثيل (<1 ميكرون)، والقرار الزماني (<1 ميللي ثانية)، مما يجعل من الممكن لاستهداف أنواع معينة من الخلايا أو حتى حجرات خلية فرعية. وبالإضافة إلى ذلك فمن غاية غير الغازية لأنه يتجنب أي اتصال جسدي مع الأنسجة من الاهتمام والتحفيز disentangles من التسجيل. وعلاوة على ذلك، سواء شدة الضوء والطول الموجي يمكن أن تنظم بدقة وبروتوكولات التحفيز بالتالي المتنوعة يمكن تطبيقها. 3،4
ومع ذلك، فإن الغالبية العظمى من الخلايا الحيوانية لا تقدم أي حساسية معينة للضوء. عدة استراتيجيات لstimulatio البصريةن وبالتالي تم اقتراح، إما استغلال الوسطاء الجزيئية الحساسة للضوء في مكان قريب أو داخل الخلايا، أو باستخدام جهاز متفاعل وضعها خارجيا، على مقربة من الخلية. تشير الفئة الأولى إلى الآليات الذاتية مثل التحفيز عن طريق مرئية أو الأشعة تحت الحمراء (IR) الضوء، فضلا عن استخدام أي مركبات photoisomerizable / photocleavable أو التعبير الجيني للالمحركات الجزيئية للضوء (optogenetics). وتشمل الفئة الأخيرة التقنيات لتحفيز خارجي يتحقق مع استخدام غير العضوية نانو / الجسيمات الدقيقة أو ركائز السيليكون ضوئية. 5 ومع ذلك، كل هذه النظم والجوانب المشرقة وعيوب. على وجه الخصوص، وامتصاص الذاتية للخلايا في المدى المنظور ضعيفة ولا يمكن الاعتماد عليها، والجيل يصاحب ذلك من أنواع الاكسجين التفاعلية قد تكون ضارة إلى الخلية. بشكل عام، يتم استخدام الأشعة تحت الحمراء لإحداث التسخين الحراري المحلية بسبب امتصاص الماء، ولكن معامل انقراض المياه الصغيرة، مما يتطلب الحاديرونغ ضوء الأشعة تحت الحمراء (من عشرات إلى مئات W / مم 2) يصعب تسليم عبر البصريات المجهر القياسية ويمكن أن تشكل مخاوف تتعلق بالسلامة للتطبيقات في الجسم الحي. من ناحية أخرى، مركبات حبس-صور للتحويل لديها إجراءات محدودة الوقت، وغالبا ما تتطلب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التي يصعب تسليم نظرا لاختراق الأنسجة محدودة. إضافة إلى أنها تعاني من مشاكل انتشار المركبات تفعيلها على التحلل الضوئي خارج المنطقة المضاءة. وأخيرا، قد سمحت أدوات optogenetic العلماء لاستهداف الفئات السكانية الخلوية محددة ومحصورة الفرعية والناشئة بسرعة باعتبارها واحدة من التكنولوجيات الرئيسية في البحث العلمي العصبي. ومع ذلك، وإدراج شريحة الحمض النووي الخارجية عبر ناقلات فيروسية يثير قضايا هامة تتعلق بالسلامة، لا سيما في ضوء اعتماد على المرضى من البشر. 5،6 لهذه الأسباب، والبحث عن المواد والأجهزة الجديدة قادرة على خلية التلاعب البصري هو موضوع ساخن للغاية.
في الآونة الأخيرة، رواية، وقد اقترح النهج القائم على استخدام البوليمرات مترافق حساسة للضوء، وقادرة على تنبيغ حافزا البصرية بكفاءة في التشكيل من النشاط الكهربائي الخلية. وتحفيز الخلية التي كتبها بوليمر Photoexcitation (CSPP) تقنية تستغل العديد من الميزات تمكين مفتاح نموذجية من أشباه الموصلات العضوية: فهي حساسة في جوهرها إلى النور في المدى المرئي (7)؛ فهي حيويا، لينة ومطابق ومرونتها الميكانيكية يسمح واجهة الحميمة مع النسيج على حد سواء في المختبر والمجراة 10/08. بغض النظر عن ذلك، فإنها يمكن أن functionalized بسهولة إلى التكيف بشكل أفضل مع واجهة مع الخلايا الحية، وتمكين الإثارة محددة، تحقق والاستشعار القدرات. 11،12 وعلاوة على ذلك، فإنها تدعم الإلكترونية وكذلك النقل الأيونية، مما يجعلها مثالية لمزيج البيولوجيا الإعلانية الإلكترونية. 13،14 ومن المثير للاهتمام، وأنها يمكن أن تعمل في وضع الضوئية، وتجنب الحاجة إلى تطبيق التحيز و الخارجية15 أو التحفيز البصري خلية فعالة.
وقد موثوقية تقنية CSPP سابقا تظاهروا في العديد من النظم، بما في ذلك الخلايا العصبية الأولية، 15،16 النجمية، 17 خطوط الخلايا الثانوية 18 والأنسجة الشبكية explanted. 16 في هذا العمل، وجميع الخطوات اللازمة لافتعال حساسة للضوء والحيوية والبوليمر ووصف واجهة 19 لتحفيز البصري نظم في المختبر بالتفصيل. كحالة دراسة، والعضوية مزيج الضوئية نموذج أولي من الإقليم العادية بولي (3-hexylthiophene) (ص ص-P3HT)، يعمل بوصفه المانحة الإلكترون، واستر فينيل-C61-زبدي، حمض الميثيل (PCBM)، بوصفها ويعمل متقبل الإلكترون. كما النظام البيولوجي، وتستخدم الجنينية البشرية الكلى (HEK-293) الخلايا. وأعطى مثالا على بروتوكول ضوئي مع تسجيل النسبي للنشاط الخلايا عن طريق القياسات الكهربية.
منصة وصفغير أنه من صحة العامة، وأنها يمكن أن تمتد بسهولة إلى استخدام البوليمرات مترافق أخرى (عن طريق ضبط عملية الحل إعداد والمعلمات ترسب بشكل صحيح)، وأنواع مختلفة من الخلايا (عن طريق تغيير بشكل صحيح بروتوكول زراعة الخلايا، والطلاء الداخلي والوقت المطلوب لبذر الخلايا وانتشار) والبروتوكولات التحفيز المختلفة (ضوء الطول الموجي والتردد محفزات ومدة وكثافة photoexcitation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد متفاعل ركائز
- إعداد P3HT: PCBM الحل (1: 1 ث / ث) في الكلوروبنزن بتركيز P3HT من 20 جرام / لتر. مزيج الحل مع محرك مغناطيسي لمدة 4 على الأقل ساعة على 60 درجة مئوية. النظر في حجم 150 ميكرولتر من محلول لكل الركيزة لتكون مستعدة.
- نظيفة الشرائح الزجاجية المغلفة ايتو (R ق = 10 Ω / متر مربع، 18x18 مم 2، سمك 170 ميكرون) مع حمامات متتالية من الماء منزوع الأيونات، والأسيتون والأيزوبروبانول في sonicator (10 دقيقة لكل خطوة). تجفيف coverslips بمسدس النيتروجين. وضع العينات في نظافة البلازما في 100 واط لمدة 10 دقيقة.
- إيداع طبقة رقيقة من الطبقة النشطة على ركائز تنظيفها عن طريق تدور طلاء.
- مع طرف الماس، وقطع شريحة زجاجية المجهر، (سمك ≈ 1 مم) لنفس الأبعاد الجانبية للركائز ITO المغلفة. إزالة P3HT: حل PCBM من موقد واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
- تعيين سانت اثنينEPS البرنامج تدور المغطي: ط) 30 ثانية في 800 دورة في الدقيقة. ب) 30 ثانية في 1600 دورة في الدقيقة. وضع الشريحة على تشاك لتدور المغطي والبدء في الفراغ لإصلاحه. وضعت قطرة من الأسيتون على الشريحة ثم الركيزة تنظيفها، مع الجانب ITO المغلفة متجهة لأعلى. بدء دوران تدور المغطي للتخلص من الأسيتون الزائد.
- وضع 150 ميكرولتر من P3HT: حل PCBM على ركائز والبدء من جديد لتدور المغطي (استخدام نفس البروتوكول هو موضح في 1.3.2).
- بعد انتهاء تدور المغطي، وإزالة عينة وفصل بعناية الركيزة المغلفة من شريحة زجاجية. تنظيف الجزء الخلفي من الركيزة مع مسحة غرف الأبحاث مغموسة في الأسيتون.
ملاحظة: يمكن تخزين ركائز متفاعل لبضعة أيام في مربع الظلام حتى استخدامها. لفترات أطول، والاحتفاظ بها في صندوق قفازات مع غاز خامل.
2. إعداد خلية ثقافة متوسطة والكهربية حلول
- إعداد المتوسطة النمو الكامل (CGM) لHEK-293 الخلايا: Dulbecco التعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) لا الحرارة المعطل، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تعقيم المتوسطة مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد الحل خارج الخلية في الماء عالى النقاء (تركيزات مم): 135 كلوريد الصوديوم، 5.4 بوكل، 5 HEPES، 10 الجلوكوز، 1.8 CaCl 2، 1 MgCl 2. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم الحل مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد الحل داخل الخلايا في الماء عالى النقاء (تركيزات مم): 12 بوكل، 125 K-غلوكونات، 1 MgCl 2، 0.1 CaCl 2، 10 EGTA، 10 HEPES، 10 ATP-نا 2. لاحظ أن ATP-نا 2 حساسة للحرارة وإضافته آخر. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم. تعقيم الحل مع نظام 0.2 ميكرون الترشيح، وقسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C.
3. طلاء HEK-293 الخلاياعلى ركائز النشطة
- وضع الركيزة متفاعل في كوب زجاجي مغطاة الألومنيوم أو طبق بتري مغلقة ووضعها في الفرن على 120 درجة مئوية لمدة 2 ساعة للتعقيم. من هذه اللحظة فصاعدا، تنفيذ جميع العمليات في ظروف معقمة. وضع العينات في غطاء العقيمة والسماح لهم يبرد.
- معطف الركيزة متفاعل مع طبقة التصاق للحد من للا مائية السطحية وتعزيز التصاق الخلية.
- وضع ركائز النشطة في طبق بتري P35 أو لوحة 6 multiwell. ونظرا لللا مائية طبقة البوليمر مترافق، وجعل polydimethylsiloxane (PDMS) جيد لإصلاح العينة وحصر الحلول.
- مزيج PDMS ومحفز في 10: نسبة 1 بقضيب الزجاج للحصول على الطين اللزج.
- صب الطين في لوحة 6 multiwell، الاستغناء مبلغ يكفي لتغطية نصف كل بئر.
- انتظر PDMS البلمرة في RT.
- قطع PDMS الشفاء في منتصف لobtaining شكل مربع من نفس البعد من العينة البوليمر.
- تعقيم الآبار PDMS عن طريق الغمر في 70٪ خليط الماء الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل.
- في حالة استخدام PDMS جيدا، خدش طبقة متفاعل على طول الحدود من البئر مع ملاقط مدببة، من أجل تجنب انفصال طبقة بأكملها عند إزالة PDMS جيدا بعد زراعة الخلايا.
- تغطية كامل سطح كل عينة مع الحل فبرونيكتين (2 ملغم / لتر في PBS). وحدة تخزين بين 500-750 ميكرولتر لكل عينة وعادة ما يكفي إذا كان PDMS كذلك يستخدم (السطحية واضح من البئر: 15x15 مم 2). دون PDMS جيدا، حوالي 2 مل من محلول فبرونيكتين ضرورية لتزج تماما العينة. الانتباه إلى أن الركيزة لا تطفو في حين اضاف الحل. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
- إزالة الحل فبرونيكتين مع ماصة الزجاج ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من برنامج تلفزيوني.
- وضع ركائز النشطة في طبق بتري P35 أو لوحة 6 multiwell. ونظرا لللا مائية طبقة البوليمر مترافق، وجعل polydimethylsiloxane (PDMS) جيد لإصلاح العينة وحصر الحلول.
- ررأكل HEK-293 الخلايا على العينات المعالجة فبرونيكتين في كثافة 15000 خلية / سم 2 في كامل متوسطة النمو. استخدام حجم 750-1،000 ميكرولتر من CGM لكل عينة إذا كان PDMS كذلك يستخدم، وإلا 2-3 مل من CGM اللازمة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24-48 ساعة.
4. بروتوكول تحفيز الضوئية والكهربية القياسات
- وضع حل خارج الخلية في حمام مائي عند 37 ° C إلى thermalize. ذوبان الجليد الحل داخل الخلايا، ووضعها في حقنة 1 مل مع إبرة قياس 34 والاحتفاظ بها في اتصال مع الثلج لتجنب تدهور ATP.
- اتخاذ الركيزة المغلفة خلية من الحاضنة، وإزالة بعناية PDMS جيدا إذا كان موجودا. إزالة المتوسطة النمو مع ماصة الزجاج وشطف العينة مع حل خارج الخلية. المضي قدما ببطء لتجنب انفصال الخلية.
- وضع الجهاز في صاحب العينة للمحطة الكهربية مع solutio خارج الخليةن والقطب المرجعية. إعداد بال micropipettes الزجاج جديدة لالتصحيح، المشبك مع مجتذب (مقاومة مثالية في نطاق 2-4 MΩ). ملء نصف ماصة مع الحل داخل الخلايا وتركيبها على micromanipulator.
- بحث عن الخلية الصحيحة لرأب الصدع على الجهاز. لتجنب الإثارة غير المرغوب فيها من الركيزة متفاعل، واستخدام الإضاءة الأشعة تحت الحمراء للتصوير، وضع مرشح تمرير الطول الموجي الطويل (على سبيل المثال، خفض الطول الموجي λ = 750 نانومتر يمكن استخدامها للبوليمرات امتصاص في الظاهر) أمام للإضاءة المجهر.
- تصحيح الخلية المحددة وتطبيق البروتوكول المطلوب لتحفيز البصري من خلال توفير الضوء على عينة عبر مسار مضان الإثارة المجهر (الشكل 1). وصف مفصل للبروتوكول التصحيح، المشبك يمكن العثور في اشارة 20.
- ضع ماصة التصحيح على مقربة من غشاء الخلية مع مناور المصغر. خلال تحديد المواقع، تطبيق overpressurه إلى ماصة من أجل تجنب التصاق الأوساخ على معلومات سرية. يجب أن تكون ماصة بضعة ميكرونات فوق الخلية.
- بدء تخفيض ماصة نحو غشاء الخلية في حين تسيطر على المقاومة ماصة على برنامج حاسوبي لمراقبة التصحيح. عندما المقاومة ماصة زاد حوالي 1 MΩ، وإزالة الزائد من ماصة أثناء تطبيق طيف الامتصاص، من أجل تشكيل gigaseal بين ماصة وغشاء الخلية (أي ينبغي أن تزيد المقاومة تقاس بقيمتها أكبر من 1 GΩ) .
- تطبيق السلبية المحتملة لماصة على مقربة من خلية المتوقعة المحتملة يستريح (لHEK293 الخلية لإمكانات -40 بالسيارات يمكن استخدامها) للمساعدة في استقرار الختم. تعويض العابرين بالسعة بسبب السعة ماصة مع الأوامر النسبية على مكبر للصوت التصحيح و / أو برنامج حاسوبي لمراقبة التصحيح.
- كسر الغشاء للسماح بالوصول الكهربائية إلى السيتوبلازم الخلية عن طريق تطبيق شفط نبضة قصيرة ومكثفةلماصة. تعيين مكبر للصوت التصحيح لوضع المشبك الحالي (I = 0، أي مع عدم وجود حقنها في الخلايا الحالية) لتعقب إمكانات غشاء الخلية. انتظر بضع دقائق لمعرفة ما إذا كان احتمال خلية مستقرة.
- تطبيق بروتوكول الإضاءة المطلوبة إلى الخلية وتسجيل تأثير على غشاء المحتملة.
ملاحظة: يمكن أن يتم تسليم الإضاءة على عينة إما من أسفل أو من أعلى، اعتمادا على بنية المجهر.- تحديد الطول الموجي الإثارة أن يمتص جيدا من المواد الفعالة؛ لP3HT: PCBM مزيج، الطول الموجي في نطاق 450-600 نانومتر يمكن استخدامها. الكثافة photoexcitation مناسبة هي في حدود 10-100 ميغاواط / مم 2.
ملاحظة: نبضات قصيرة من الضوء (أقل من 10-20 مللي ثانية) النتيجة في الاستقطاب عابرة للخلية، بينما مع الإضاءة لفترات طويلة (مئات ميلي ثانية أو نبضات أطول) لوحظ فرط الاستقطاب المستمر إلى أن يتم تشغيل ضوء قبالة.
- تحديد الطول الموجي الإثارة أن يمتص جيدا من المواد الفعالة؛ لP3HT: PCBM مزيج، الطول الموجي في نطاق 450-600 نانومتر يمكن استخدامها. الكثافة photoexcitation مناسبة هي في حدود 10-100 ميغاواط / مم 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا يمكن أن يكون مثقف بسهولة على P3HT: ركائز PCBM، شريطة أن يكون طبقة التصاق مناسبة وتودع (مثل فبرونيكتين المستخدمة في الخطوة 3.2 من بروتوكول صفها). P3HT: PCBM قمم امتصاص البصرية في الجزء الأخضر من الطيف المرئي. ومع غيرها من البوليمرات مترافق الحساسة للضوء يمكن اختيار، وفقا لمجموعة موجات ضوئي المفضل (الشكل 2). وقد تجلى توافق مع الحياة من هذه ركائز ليس فقط مع خطوط الخلايا 18،21 مثل HEK-293، ولكن أيضا مع الثقافات الأولية من الخلايا العصبية 15 و 17 النجمية A صورة مجهرية النموذجية صحية HEK-293 الخلايا المستزرعة على P3HT: يتم عرض فيلم PCBM في الشكل (3). التحفيز البصري من الخلايا بوساطة ركائز متفاعل يمكن أن يؤدي إلى تأثيرات مختلفة على غشاء الخلية، وهذا يتوقف على مدة التحفيز خفيفة. 18 عند بداية نبض الضوء،ارتفاع سريع (مع كثافة حوالي 3 بالسيارات ومدة حوالي 1 مللي ثانية) ويمكن ملاحظة في غشاء الخلية التسجيلات المحتملة (الشكل 4). ويرجع ذلك إلى الشحن بالسعة واجهة البوليمر / بالكهرباء على توليد المسؤول في المواد النشطة هذه الإشارة.
بعد هذه ارتفاعه سريع الأولي، لوحظ الاستقطاب عابر (مع كثافة حوالي 1 بالسيارات ومدة بناء على أمر من عشرات الالف) في الخلية (الشكل 4). لنبضات قصيرة من الضوء، كما تحول ضوء قبالة، لوحظ حدوث السلوك المعاكس. وقد نسبت هذه الإشارات إلى الاختلاف في السعة الغشاء بسبب التدفئة المحلية التالية امتصاص الضوء.
للإضاءة في الهواء لفترات طويلة، ومع ذلك، فإن الاستقطاب الأولي خلال نبضات الضوء يتحول إلى فرط الاستقطاب الخلية (الشكل 5). هذه الظاهرة لهاالحصول على أصل الحرارية، ولكن في هذه الحالة يرتبط ذلك إلى اختلاف الإمكانات توازن الغشاء بسبب تغيير في التوصيلات القنوات الأيونية الناجمة عن ارتفاع درجات الحرارة.
مصنوعة الشكل 1. رسم الركيزة متفاعل. واجهات متفاعل تستخدم لتحفيز البصري الخلوي للطبقة رقيقة من أشباه الموصلات العضوية المودعة على ركيزة الزجاج ITO المغلفة. يمكن زراعة الخلايا مباشرة على السطوح الجهاز بعد أن تم التعامل مع طبقة التصاق مناسبة (على سبيل المثال، فبرونيكتين). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. قياس الامتصاص نشوئها أطياف البوليمرات مترافق مختلفة. إن استخدام أفلام رقيقة من أشباه الموصلات العضوية قد تسمح tunability كبير في الطول الموجي الإثارة مع الحفاظ على الشفافية جزئية من الركيزة. وكمثال على ذلك، يتم الإبلاغ عن أطياف الامتصاص من البوليمرات مترافق المختلفة المستخدمة عادة في الخلايا الكهروضوئية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. HEK-293 الخلايا المستزرعة على ركيزة متفاعل. مجهرية النموذجية لHEK-293 الخلايا المستزرعة على سطح الركيزة متفاعل بعد 24 ساعة من الحضانة. شريط النطاق، 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. التحفيز البصري من HEK-293 الخلايا مع 20 نبضة ضوء ميللي ثانية. الاختلاف من إمكانات غشاء خلية كلوة-293 التي تسببها 20 نبض مللي ثانية من النور. ويتبع لارتفاع سريع الأولي على ظهور ضوء من الاستقطاب الخلية خلال النبض. كما تحول ضوء قبالة، لوحظ حدوث السلوك المعاكس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. التحفيز البصري من HEK-293 الخلايا مع 200 البقول ضوء ميللي ثانية. تباين في إمكانات غشاء خلية كلوة-293 التي تسببها 200 نبضة مللي ثانية من النور. الاستقطاب الأولي لوحظت في illum قصيرةination هو مجرد ظاهرة عابرة، والتي بعد بضع عشرات من ميلي ثانية من الإضاءة لفترات طويلة يتحول إلى فرط الاستقطاب الخلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
خطوات حاسمة من البروتوكول ذكرت لتحفيز البصري للخلايا تتعلق بشكل رئيسي في المختبر اختيار البوليمر حساسة للضوء، والمعلمات التعقيم الحراري، وشدة ومدة المنبهات الخفيفة. تم اختيار الفيلم PCBM رقيقة هنا، لأنه يضمن الاستقرار الزماني والكهروكيميائية جيدة: A P3HT. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن تلاحظ أن ليس كل البوليمرات الحساسة للضوء يمكن أن تقدم عروضا التماثلية، 22 بشكل أكثر تحديدا على الإضاءة. بالإضافة إلى ذلك، في هذه الحالة اختيار التعقيم الحراري المعلمات لا تؤدي إلى تدهور كبير من الميزات الضوئية البوليمر. إشعار لكن ذلك، في حال غيرت طريقة التعقيم أو المعلمات المعالجة الحرارية، والآثار المحتملة على خصائص البوليمر ينبغي تقييمها بعناية. فمن المعروف، على سبيل المثال، أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يؤدي بسرعة إلى تبييض البوليمر لا رجعة فيه والتدهور، بسبب فقدان الاقتران. وعلاوة على ذلك، الصلب مختلفةدرجات الحرارة ومدة قد يؤدي إلى النظام الصرفي مختلفة من سطح البوليمر، مع آثار سلبية على خصائص النقل تهمة الكهربائية. المعلمات من بروتوكول photoexcitation ينبغي تقييمها بعناية أيضا: كثافة الإثارة فوق 100 ميغاواط / سم 2، و / أو المحفزات لفترات طويلة، قد تؤدي بسهولة إلى تدهور البوليمر وفشل بروتوكول ضوئي. آخر خطوة حاسمة في البروتوكول تتمثل في استخدام طبقة البروتين التصاق، ويرجع ذلك إلى درجة للا مائية عالية من P3HT: سطح PCBM. في حالة استخدام أي طبقة التصاق في تحقيق واجهة الحيوي البوليمر، زرع الخلايا وانتشار قد تتعرض للخطر على محمل الجد.
ضمن الخطوات والقيود الهامة المذكورة أعلاه، ومع ذلك، فإن بروتوكول أفادت يمكن تعديلها بشكل مباشر، وفقا لاحتياجات وأهداف تجريبية محددة. مستقرة، حساسة للضوء البوليمرات الأخرى يمكن العثور على 7 من عدة كومالتجارية التي تشجع الموردين أو عن طريق تجميع صحيح مركبات جديدة. هذا يسمح باستخدام موجات الإثارة المختلفة، والتي تمتد من الأزرق إلى الأحمر ومجموعة الجرد الوطني. وعلاوة على ذلك، لا يقتصر على تقنية ترسيب البوليمر إلى استخدام طلاء تدور. في الواقع، وأساليب أخرى ضمان التجانس الجيد وسماكة الفيلم مناسب يمكن تصور مثل الطباعة بالحبر النفاث، رذاذ الطلاء، أو blading الآثار المترتبة على اتصال لفترة طويلة مع الخلية الإعلامية المتزايدة وطريقة التعقيم ينبغي تقييم لكل مادة جديدة تم أخذه بعين الإعتبار. على الرغم من أن استخدام البروتين طبقات التصاق ضروري للحصول على مزارع الخلايا جيدة على أعلى الأسطح البوليمر، واستخدام محددة من فبرونيكتين، كما ذكرت هنا، ليست إلزامية. ويمكن استخدام مختلف طبقات البروتين التصاق، أيضا وفقا لخط الخلية في النمو، و 21 على سبيل المثال، الخلايا العصبية وعادة ما تكون تربيتها على طبقة بولي-L-يسين. وأخيرا، بروتوكولات الإضاءة يمكن أن تتغير وتتكيف مع SPاحتياجات ecific، من حيث الطول الموجي، حجم البقعة، والكثافة الإثارة السلطة، والمدة الزمنية المحفزات والتردد والتوجيه الإصابة خفيفة (من الركيزة أو من الحمام بالكهرباء). وكما ذكر أعلاه لفترة وجيزة، ومع ذلك، فإن تعريف المعلمات البروتوكول ينبغي أن تأخذ بعين الاعتبار مجموعة البوليمر الضوئي امتصاص وآثار تدهور المحتملة، والتي قد تختلف كثيرا من حالة إلى أخرى.
استقرار الزمانية والكهروكيميائية المحدود لبعض البوليمرات الحساسة للضوء في الواقع يمثل القيود الرئيسية لهذه التقنية. بالإضافة إلى ذلك، استخدام البوليمرات تجارية بدون أي مزيد من تنقية قد تؤدي في بعض الحالات إلى تكرار محدودة النتائج بين دفعات مختلفة من المواد، ويرجع ذلك إلى درجة نقاء مختلفة.
نلاحظ أيضا أن الآليات الدقيقة عند قاعدة تأثير phototransduction في بروتوكولات CSPP لا تزال بحاجة إلى مزيد من توضيح وتتميز. الحرارية، ودرجة الحموضة الكهربائية والكيميائيةenomena هي ربما تشارك في بدرجات متفاوتة في النماذج البيولوجية المختلفة. وهناك فهم كامل سيكون عاملا رئيسيا في الاستفادة الكاملة من تقنية. على وجه الخصوص، ينبغي إعادة النظر في حدوث ظواهر بوساطة الحرارة وجود قيود على التقنية، نظرا لأنه يمكن بالكاد تسيطر عليها، ويمكن أن يؤدي إلى آثار ارتفاع درجة الحرارة المحلية، ولا سيما في حالة التطبيقات في الجسم الحي. A التنفيذ المحدد للجهاز، تهدف إلى السيطرة على انتشار الحرارة في البيئة خارج الخلية عن طريق الهندسة السليمة للمسارات موصل للحرارة، قد تكشف الضروري في المستقبل القادم لاستغلال كامل للتقنية.
في الأدب، والتقنيات المختلفة التي تستخدم النبضات الضوئية لتحفيز بوساطة درجة حرارة الخلايا والأنسجة، سواء في المختبر والمجراة يمكن العثور عليها. في هذه الدراسات، وعادة ما تستخدم في امتصاص أشعة الليزر تحت الحمراء عن طريق المياه كآلية تنبيغ 23-25 وفيما يتعلق الأشعة تحت الحمراءالعصبية التحفيز، آلية CSPP ديها مزايا واضحة، وخاصة لإجراء التجارب في المختبر. ويستند CSPP على ضوء في المدى المنظور وكثافة معتدلة، بحيث يمكن شريطة أن التحفيز من قبل مسار الإثارة المجهر مضان القياسية. على العكس من ذلك، امتصاص الماء يتطلب موجات في IR (أساسا حول 1.45 ميكرون و 1.93 ميكرون)، والتي يجب أن يتم تسليمها إلى عينة عن طريق مصادر خارجية مثل الألياف البصرية micromanipulated في القرب من إعداد ومنذ القطار الضوئية على مستوى لا يمكن استخدام المجهر في هذه الأطوال الموجية. في حالة CSPP، وأنماط الضوء التي تم الحصول عليها مع أنظمة المسح الضوئي ليزر فضلا عن جهري ضوء المكانية يمكن أن يقترن مباشرة إلى القطار البصرية من معظم المجاهر. في هذه الطريقة، يمكن للضوئي من ركائز بناء على أشباه الموصلات العضوية تجعل من الممكن الحصول على التحفيز من عدة خلايا في مجال الرؤية بشكل مستقل، مع كل زمنية عالية ل القرار المكانية الثانية.
وتقدم آخر بديلا قيما للغاية لتحفيز البصري الأساليب الوراثية، على أساس التعبير للاستهداف من تحقيقات photoactivatable وراثيا في الخلايا. Optogenetics تقدم في الوقت الحاضر القرار الزماني والمكاني لم يسبق له مثيل، مع شدة الإضاءة النموذجية في حدود بضع عشرات من ميغاواط / مم 2، يمكن على حد سواء الإثارة وتمنع النشاط الكهربائي، ويمكن أن تستهدف وراثيا للسكان فرعية محددة من مناطق محددة في الدماغ من الفائدة. ومع ذلك، فإنه لا يزال يعرض بعض القضايا التي يتعين حلها. على وجه الخصوص، مخاوف تتعلق بالسلامة فيما يتعلق باستخدام الفيروسات للتعبير الجينات، خصوصا في البشر، وتحقيق الاستقرار وتسيطر على المدى الطويل البروتين مغاير التعبير لا تزال تمثل تحديات كبرى. تقنية CSPP تسمح للتحايل على الحاجة إلى نقل الجينات، وجميع المخاوف المتعلقة بالسلامة، والتي هي ذات أهمية خاصة للتطبيقات في الجسم الحي.
jove_content "> جميع في كل شيء، وطريقة CSPP يقدم العديد من المزايا فيما يتعلق بتقنيات ضوئي الذاتية. وبما أنه ليس الغازية، فإنه يمكن أن يقترن بسهولة إلى أي محطة عمل الكهربية الموجودة وأنها لا تحتاج إلى مصادر الليزر معقدة أو ترنسفكأيشن الجيني، في حين الحفاظ عالية الانتقائية المكانية والزمانية. ولهذه الأسباب، CSPP يحمل وعدا لتصبح أداة تكميلية في علم الأعصاب في المختبر التحقيقات، وفتح آفاق جديدة في داخل الجسم الحي التطبيقات. ومع ذلك، جهدا كبيرا من علوم المواد والفيزياء والهندسة ومن المتوقع في السنوات المقبلة، تحتاج إلى صقل وتحسين والاستفادة الكاملة من تقنية المجتمعات.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M.
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G.
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G.
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
