Introduction
एक सटीक स्थानिक और लौकिक संकल्प के साथ सेलुलर गतिविधि में हेरफेर करने की संभावना neuroscientific अनुसंधान के क्षेत्र में और तंत्रिका विज्ञान और मानसिक विकारों के उपचार में एक महत्वपूर्ण रणनीति का प्रतिनिधित्व करता है। एक पारंपरिक तरीकों निकटता में या के साथ संपर्क में तैनात इलेक्ट्रोड का उपयोग कोशिकाओं की बिजली की उत्तेजना के आधार पर कर रहे हैं (इन विवो मस्तिष्क के ऊतकों, एकल कोशिका, सेलुलर नेटवर्क, मस्तिष्क के स्लाइस) अलग जटिलता का हो सकता है, जो लक्षित प्रणाली, 2। पिछली सदी के दौरान, पैच दबाना, धातु और सब्सट्रेट एकीकृत इलेक्ट्रोड का उपयोग शरीर विज्ञान और एकल न्यूरॉन्स की और तंत्रिका नेटवर्क के कामकाज तंत्र के pathophysiology की एक विस्तृत चित्र प्रदान की है। हालांकि, बिजली की उत्तेजना महत्वपूर्ण सीमाओं से ग्रस्त है। पहले एक कारण आसानी से अनुकूलित नहीं किया जा सकता है, जो इलेक्ट्रोड और अपने निर्धारित ज्यामिति के भौतिक आयाम, एक आम तौर पर गरीब स्थानिक संकल्प से संबंधित हैजैविक ऊतकों की तरह जटिल संगठित प्रणाली के लिए। इसके अलावा, इलेक्ट्रोड प्रतिबाधा के लिए और उत्तेजना और रिकॉर्डिंग सिस्टम के बीच परस्पर बात की समस्याओं से संबंधित माप के अंतिम संकेत करने वाली शोर अनुपात खराब हो सकता है। 3 दूसरी ओर, उत्तेजना के लिए प्रकाश के उपयोग के कई सीमाओं को पार करने के लिए मदद मिल सकती है बिजली के दृष्टिकोण की। सबसे पहले, यह संभव विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं या यहां तक कि उप-सेल के डिब्बों को लक्षित करने के लिए कर रही है, अभूतपूर्व स्थानिक (<1 माइक्रोन) और अस्थायी समाधान (<1 मिसे) प्रदान करता है। यह ब्याज के ऊतकों के साथ किसी भी शारीरिक संपर्क से बचा जाता है और रिकॉर्डिंग से उत्तेजना disentangles के बाद से इसके अलावा यह अत्यधिक गैर इनवेसिव है। इसके अलावा, प्रकाश की तीव्रता और तरंग दैर्ध्य दोनों ठीक विनियमित किया जा सकता है और इस तरह विविध उत्तेजना प्रोटोकॉल लागू किया जा सकता है। 3,4
हालांकि, पशु कोशिकाओं के विशाल बहुमत के प्रकाश के लिए किसी भी विशिष्ट संवेदनशीलता मौजूद नहीं है। ऑप्टिकल stimulatio के लिए कई रणनीतियोंएन इस प्रकार, या तो पास या कोशिकाओं के भीतर प्रकाश के प्रति संवेदनशील आणविक मध्यस्थों का शोषण, या सेल के करीब बाहर रखा प्रकाश सक्रिय डिवाइस का उपयोग करते हुए प्रस्ताव किया गया है। पूर्व श्रेणी दृश्य या अवरक्त (आईआर) प्रकाश के माध्यम से उत्तेजना, साथ ही photocleavable / photoisomerizable यौगिकों या सहज आणविक प्रवर्तक (optogenetics) की आनुवंशिक अभिव्यक्ति या तो के उपयोग की तरह अंतर्जात तंत्र को दर्शाता है। उत्तरार्द्ध वर्ग अकार्बनिक नैनो / सूक्ष्म कणों या photoconductive सिलिकॉन substrates के उपयोग से प्राप्त बहिर्जात उत्तेजना के लिए तकनीक भी शामिल है। 5 फिर भी, इन सभी प्रणालियों उज्ज्वल पक्ष और कमियां हैं। विशेष रूप से, दिखाई रेंज में कोशिकाओं की अंतर्जात अवशोषण कमजोर और विश्वसनीय नहीं है, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के सहवर्ती पीढ़ी सेल के लिए हानिकारक हो सकता है। सामान्य तौर पर, आईआर की वजह से पानी के अवशोषण के लिए स्थानीय थर्मल हीटिंग उत्प्रेरण के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन पानी के विलुप्त होने के गुणांक इस प्रकार सेंट की आवश्यकता होती है, छोटा हैमानक माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी के माध्यम से वितरित करने के लिए और इन विवो अनुप्रयोगों के लिए सुरक्षा चिंताओं खड़ी हो सकती है मुश्किल है कि (दसियों से W / 2 मिमी के सैकड़ों करने के लिए) रोंग अवरक्त प्रकाश। दूसरी ओर, फोटो switchable caging यौगिकों एक समय सीमित कार्रवाई की है और अक्सर कारण सीमित ऊतक प्रवेश करने के लिए वितरित करने के लिए कठिन है कि पराबैंगनी प्रकाश की आवश्यकता होती है। इसके अलावा वे प्रबुद्ध क्षेत्र के बाहर photolysis पर सक्रिय यौगिकों के प्रसार की समस्याओं से ग्रस्त हैं। अंत में, optogenetic उपकरण विशिष्ट सेलुलर उप-जनसंख्या और उप डिब्बों को लक्षित करने के लिए वैज्ञानिकों की अनुमति दी है और तेजी से neuroscientific अनुसंधान के क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रौद्योगिकियों में से एक के रूप में उभर रहे हैं। हालांकि, एक वायरल वेक्टर के माध्यम से एक exogenous डीएनए खंड डालने विशेष रूप से मानव रोगियों पर गोद लेने के विचार में, महत्वपूर्ण सुरक्षा मुद्दों को उठाती है। इन कारणों के लिए 5,6, सेल ऑप्टिकल हेरफेर करने में सक्षम नई सामग्री और उपकरणों पर अनुसंधान के एक अत्यंत गर्म विषय है।
हाल ही में, एक उपन्यासकुशलतापूर्वक सेल बिजली की गतिविधि का एक मॉडुलन में एक ऑप्टिकल प्रोत्साहन transduce करने में सक्षम प्रकाश के प्रति संवेदनशील संयुग्मित पॉलिमर, के उपयोग पर आधारित दृष्टिकोण, प्रस्ताव किया गया है। 7 वे biocompatible मुलायम और पक्षधर रहे हैं और उनके यांत्रिक लचीलापन ऊतक के साथ एक अंतरंग इंटरफेस की अनुमति देता है, और वे दिखाई रेंज में रोशनी करने के लिए आंतरिक रूप से संवेदनशील हैं: पॉलिमर photoexcitation द्वारा सेल उत्तेजना (CSPP) तकनीक ठेठ जैविक अर्धचालकों के कई महत्वपूर्ण: सक्षम सुविधाओं का लाभ उठाते इन विट्रो में और इन विवो 8-10 दोनों। इसके अलावा, वे आसानी से बेहतर जांच और क्षमताओं संवेदन, विशिष्ट उत्तेजना सक्षम करने के लिए जीवित कोशिकाओं के साथ इंटरफेस के लिए अनुकूल है, और करने के लिए क्रियाशील किया जा सकता है। 11,12 इसके अलावा, वे संयोजन के लिए आदर्श बना, आयनिक परिवहन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इलेक्ट्रॉनिक का समर्थन इलेक्ट्रॉनिक्स विज्ञापन जीव विज्ञान की। दिलचस्प बात यह 13,14, वे एक बाहरी पूर्वाग्रह च लागू करने के लिए जरूरत से बचने, फोटोवोल्टिक मोड में काम कर सकते हैंया कुशल सेल ऑप्टिकल उत्तेजना। 15
CSPP तकनीक की विश्वसनीयता पहले से प्राथमिक न्यूरॉन्स, 15,16 astrocytes, 17 माध्यमिक सेल लाइनों 18 और explanted रेटिना के ऊतकों सहित कई प्रणालियों में प्रदर्शन किया गया है। इस काम में 16, सभी आवश्यक कदम एक प्रकाश के प्रति संवेदनशील जैव बहुलक निर्माण करने के लिए इन-विट्रो प्रणालियों के ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए इंटरफेस 19 में विस्तार से बताया गया है। के रूप में अभिनय एक इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में कार्य अध्ययन के मामले में, क्षेत्र-नियमित पाली (3-hexylthiophene) के एक प्रोटोटाइप जैविक फोटोवोल्टिक मिश्रण (RR-P3HT), और फिनाइल-C61-ब्यूटीरिक एसिड मिथाइल एस्टर (PCBM), के रूप में इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता कार्यरत है। जैविक प्रणाली के रूप में, मानव भ्रूण गुर्दे (HEK-293) कोशिकाओं का इस्तेमाल कर रहे हैं। Electrophysiological माप के माध्यम से सेल गतिविधि के रिश्तेदार रिकॉर्डिंग के साथ एक photostimulation प्रोटोकॉल का एक उदाहरण प्रदान की जाती है।
वर्णित मंचहालांकि सामान्य वैधता की है, और यह आसानी से ठीक से, सेल संस्कृति प्रोटोकॉल को बदलने का अनुरोध प्रक्रिया और समय चढ़ाना द्वारा, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं ((ठीक से समाधान तैयार करने की प्रक्रिया और बयान मापदंडों का समायोजन करके) अन्य संयुग्मित पॉलिमर का उपयोग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है सेल बोने और प्रसार) और विभिन्न उत्तेजना प्रोटोकॉल (प्रकाश की तरंग दैर्ध्य, उत्तेजनाओं आवृत्ति और अवधि, photoexcitation घनत्व) के लिए।
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Protocol
प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित Substrates के 1. तैयारी
- एक P3HT तैयार: PCBM समाधान: chlorobenzene में (1 डब्ल्यू डब्ल्यू / 1) 20 जी / एल के एक P3HT एकाग्रता में। 60 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 4 घंटे के लिए एक चुंबकीय उत्तेजक के साथ समाधान मिलाएं। प्रत्येक सब्सट्रेट तैयार रहने के लिए के लिए समाधान के 150 μl की मात्रा पर विचार करें।
- स्वच्छ आईटीओ लेपित गिलास स्लाइड एक sonicator में विआयनीकृत पानी, एसीटोन और isopropanol की लगातार स्नान के साथ (आर एस = 10 Ω / वर्ग, 18x18 मिमी 2, मोटाई 170 माइक्रोन) (प्रत्येक चरण के लिए 10 मिनट)। एक नाइट्रोजन बंदूक के साथ coverslips सूखी। 10 मिनट के लिए 100 डब्ल्यू शक्ति पर एक प्लाज्मा क्लीनर में नमूने रखो।
- स्पिन कोटिंग के माध्यम से साफ substrates पर सक्रिय परत की एक पतली फिल्म जमा।
- एक हीरे की टिप के साथ, आईटीओ लेपित substrates के एक ही पार्श्व आयाम के लिए एक खुर्दबीन गिलास स्लाइड, (मोटाई ≈ 1 मिमी) काटा। Hotplate से PCBM समाधान और यह परिवेश के तापमान को शांत करते हैं: P3HT निकालें।
- एक दो सेंट सेटईपीएस स्पिन coater कार्यक्रम: मैं) 800 rpm पर 30 सेकंड; द्वितीय) 1600 rpm पर 30 सेकंड। स्पिन coater के चक पर स्लाइड प्लेस और इसे ठीक करने के लिए वैक्यूम शुरू करते हैं। आईटीओ लेपित ओर ऊपर की तरफ का सामना करना पड़ के साथ स्लाइड पर एसीटोन की एक बूंद और फिर साफ सब्सट्रेट, रखो। अतिरिक्त एसीटोन से छुटकारा पाने के स्पिन coater रोटेशन शुरू।
- Substrates पर PCBM समाधान और फिर स्पिन coater (1.3.2 में वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करें) शुरू: P3HT के 150 μl रखो।
- स्पिन coater समाप्त हो जाने के बाद, नमूना हटाने और ध्यान से गिलास स्लाइड से लेपित सब्सट्रेट अलग। एसीटोन में डूबा हुआ एक cleanroom झाड़ू के साथ सब्सट्रेट के पीछे साफ।
नोट: जब तक इस्तेमाल किया प्रकाश सक्रिय substrates के एक अंधेरे बॉक्स में कुछ दिनों के लिए भंडारित किया जा सकता है। लंबी अवधि के लिए, अक्रिय गैस के साथ एक glovebox में उन्हें रखने के लिए।
सेल संस्कृति माध्यम इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी समाधान की 2. तैयारी
- पूरा मध्यम विकास (सीजीएम) के लिए तैयारHEK 293 कोशिकाओं: Dulbecco ईगल मध्यम गर्मी निष्क्रिय नहीं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक (DMEM) के संशोधित। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन निस्पंदन सिस्टम और दुकान के साथ मध्यम जीवाणुरहित।
- 135 सोडियम क्लोराइड, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 ग्लूकोज, 1.8 CaCl 2, 1 2 MgCl: ultrapure पानी (मिमी में सांद्रता) में कोशिकी समाधान तैयार है। NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन निस्पंदन सिस्टम और दुकान के साथ समाधान जीवाणुरहित।
- (मिमी में सांद्रता) इंट्रासेल्युलर ultrapure पानी में घोल तैयार करें: 12 KCl, 125 कश्मीर Gluconate, 1 2 MgCl, 0.1 2 CaCl, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 एटीपी ना 2। एटीपी ना 2 गर्मी के प्रति संवेदनशील है कि नोट और आखिरी जोड़ें। NaOH के साथ 7.4 पीएच को समायोजित करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर 0.2 माइक्रोन निस्पंदन प्रणाली के साथ समाधान, विभाज्य 1 मिलीलीटर ट्यूबों में और दुकान जीवाणुरहित।
3. चढ़ाना HEK-293 कोशिकाओंसक्रिय substrates पर
- एक गिलास बीकर एल्यूमीनियम या एक बंद पेट्री डिश के साथ कवर किया और नसबंदी के लिए 2 घंटे के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में डाल में प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट रखें। उसके बाद इस पल से, बाँझ परिस्थितियों में सभी आपरेशनों प्रदर्शन करते हैं। एक बाँझ हुड में नमूने रखो और उन्हें ठंडा होने दें।
- कोट एक आसंजन परत के साथ प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट सतह hydrophobicity कम करने के लिए और कोशिका आसंजन बढ़ावा देने के लिए।
- एक P35 पेट्री डिश में सक्रिय substrates या एक 6 multiwell थाली रखें। संयुग्मित बहुलक परत के hydrophobicity को देखते हुए, एक polydimethylsiloxane (PDMS) अच्छी तरह से नमूना ठीक करने और समाधान सीमित करने के लिए बनाते हैं।
- एक चिपचिपा घोल प्राप्त करने के लिए एक गिलास छड़ी के साथ 1 अनुपात: एक 10 में PDMS और उत्प्रेरक मिलाएं।
- अच्छी तरह से प्रत्येक से आधे को कवर करने के लिए पर्याप्त एक राशि वितरण, एक 6 multiwell थाली में घोल डालो।
- आरटी पर PDMS polymerization के लिए प्रतीक्षा करें।
- Obta के लिए बीच में ठीक PDMS कटबहुलक नमूने की ही आयाम का एक चौकोर आकार ining।
- कम से कम 30 मिनट के लिए एक 70% इथेनॉल पानी के मिश्रण में विसर्जन से PDMS कुओं जीवाणुरहित।
- अच्छी तरह से PDMS का उपयोग करते हैं, अच्छी तरह से सेल संवर्धन के बाद PDMS हटाने जब पूरे परत की टुकड़ी से बचने के क्रम में बताया चिमटी के साथ अच्छी तरह से की पूरी सीमा पर प्रकाश सक्रिय परत खरोंच।
- एक फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान (पीबीएस में 2 मिलीग्राम / एल) के साथ प्रत्येक नमूने की पूरी सतह को कवर किया। एक PDMS अच्छी तरह से (: 15x15 मिमी 2 अच्छी तरह से साफ सतह) का इस्तेमाल किया जाता है, तो नमूना प्रति 500-750 μl के बीच एक मात्रा आमतौर पर पर्याप्त है। अच्छी तरह से PDMS के बिना, फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान के बारे में 2 मिलीलीटर पूरी तरह से नमूना विसर्जित करने के लिए आवश्यक हैं; समाधान को जोड़ते समय सब्सट्रेट नाव नहीं है कि ध्यान देते हैं। कम से कम 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
- एक गिलास पिपेट साथ फ़ाइब्रोनेक्टिन समाधान निकालें और पीबीएस के 2 मिलीलीटर के साथ एक बार धो लें।
- एक P35 पेट्री डिश में सक्रिय substrates या एक 6 multiwell थाली रखें। संयुग्मित बहुलक परत के hydrophobicity को देखते हुए, एक polydimethylsiloxane (PDMS) अच्छी तरह से नमूना ठीक करने और समाधान सीमित करने के लिए बनाते हैं।
- पी एल15,000 कोशिकाओं / पूरा मध्यम विकास में 2 सेमी के घनत्व पर फ़ाइब्रोनेक्टिन इलाज के नमूने पर HEK 293 कोशिकाओं खा लिया। एक प्रयोग किया जाता है अच्छी तरह से PDMS यदि अन्यथा 2-3 मिलीलीटर सीजीएम के लिए आवश्यक हैं, प्रत्येक नमूना के लिए सीजीएम की 750-1,000 μl की मात्रा का प्रयोग करें। 24-48 घंटे के लिए सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं और 5%।
4. ऑप्टिकल उत्तेजना प्रोटोकॉल और electrophysiological माप
- Thermalize करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में कोशिकी समाधान रखो; , intracellular समाधान पिघलना एक 34 गेज सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में डाल दिया और एटीपी की गिरावट से बचने के लिए बर्फ के साथ संपर्क में रहते हैं।
- ध्यान से PDMS हटाने अच्छी तरह से करता है, तो वर्तमान इनक्यूबेटर से एक सेल लेपित सब्सट्रेट ले लो। एक गिलास विंदुक के साथ विकास के माध्यम से निकालें और बाह्य समाधान के साथ नमूना कुल्ला। सेल टुकड़ी से बचने के लिए धीरे-धीरे आगे बढ़ें।
- बाह्य समाधान के साथ इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी स्टेशन का नमूना धारक में डिवाइस रखोn और संदर्भ इलेक्ट्रोड। एक खींचने के साथ पैच दबाना के लिए ताजा कांच micropipettes तैयार (आदर्श प्रतिरोध रेंज 2-4 MΩ में है)। Intracellular समाधान के साथ पिपेट का आधा भरें और यह micromanipulator पर माउंट।
- डिवाइस पर पैच करने के लिए एक स्वस्थ कोशिका के लिए देखो। प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट के अवांछित उत्तेजना से बचने के लिए, माइक्रोस्कोप प्रकाशक के सामने एक लंबी तरंग दैर्ध्य पास फिल्टर (उदाहरण के लिए, एक कट तरंग दैर्ध्य λ = 750 एनएम दृश्यमान में अवशोषित पॉलिमर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है) रखने, इमेजिंग के लिए आईआर रोशनी का उपयोग करें।
- चयनित सेल पैच और माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) के प्रतिदीप्ति उत्तेजना पथ के माध्यम से नमूने के प्रकाश देने से ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए वांछित प्रोटोकॉल लागू होते हैं। पैच दबाना प्रोटोकॉल का एक विस्तृत विवरण संदर्भ 20 में पाया जा सकता है।
- एक micrometric जोड़तोड़ साथ कोशिका झिल्ली के करीब निकटता में पैच पिपेट स्थिति। स्थिति के दौरान, overpressur लागूआदेश में पिपेट करने के लिए ई नोक पर गंदगी चिपके से बचने के लिए। पिपेट सेल के ऊपर कुछ माइक्रोन होना चाहिए।
- पैच नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर पिपेट प्रतिरोध को नियंत्रित करते हुए कोशिका झिल्ली की ओर पिपेट कम करने शुरू करो। पिपेट प्रतिरोध के बारे में 1 MΩ बढ़ गया है जब पिपेट और कोशिका झिल्ली के बीच gigaseal फार्म के क्रम में, एक सज्जन सक्शन आवेदन करते समय, पिपेट से उच्च्दाबाव हटाने के लिए (यानी, मापा प्रतिरोध 1 GΩ से अधिक से अधिक मूल्यों पर वृद्धि करनी चाहिए) ।
- सील स्थिर करने में मदद करने के लिए संभावित (HEK293 -40 का एक संभावित सेल के लिए एम वी इस्तेमाल किया जा सकता है) आराम कर उम्मीद सेल के करीब पिपेट के लिए एक नकारात्मक संभावित लागू करें। कारण पैच एम्पलीफायर और / या पैच नियंत्रण सॉफ्टवेयर पर रिश्तेदार आदेशों के साथ पिपेट समाई को कैपेसिटिव यात्रियों क्षतिपूर्ति।
- एक संक्षिप्त और तीव्र सक्शन नाड़ी लगाने से सेल कोशिका द्रव्य को बिजली के उपयोग की अनुमति झिल्ली तोड़पिपेट करने के लिए। सेल झिल्ली क्षमता को ट्रैक करने के लिए (सेल में इंजेक्शन कोई वर्तमान के साथ, यानी मैं = 0), वर्तमान दबाना मोड के लिए पैच एम्पलीफायर सेट करें। सेल संभावित स्थिर है देखने के लिए अगर कुछ मिनट प्रतीक्षा करें।
- सेल करने के लिए वांछित रोशनी प्रोटोकॉल लागू करें और झिल्ली क्षमता पर प्रभाव रिकॉर्ड है।
नोट: रोशनी माइक्रोस्कोप वास्तुकला पर निर्भर करता है, नीचे से या ऊपर से या तो नमूना करने के लिए दिया जा सकता है।- अच्छी तरह से सक्रिय सामग्री द्वारा अवशोषित कर लेता है कि एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का चयन करें; P3HT के लिए: PCBM मिश्रण, 450-600 एनएम रेंज में एक तरंग दैर्ध्य इस्तेमाल किया जा सकता है। उपयुक्त photoexcitation घनत्व रेंज 10-100 मेगावाट / 2 मिमी में हैं।
नोट: परिणाम (10-20 मिसे के नीचे) प्रकाश दालों की कमी सेल के एक क्षणिक विध्रुवण में, लंबे समय तक रोशनी के साथ, जबकि प्रकाश बंद है जब तक एक निरंतर hyperpolarization मनाया जाता है (मिलीसेकेंड या लंबे समय तक दालों की सैकड़ों)।
- अच्छी तरह से सक्रिय सामग्री द्वारा अवशोषित कर लेता है कि एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य का चयन करें; P3HT के लिए: PCBM मिश्रण, 450-600 एनएम रेंज में एक तरंग दैर्ध्य इस्तेमाल किया जा सकता है। उपयुक्त photoexcitation घनत्व रेंज 10-100 मेगावाट / 2 मिमी में हैं।
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Representative Results
प्रकोष्ठों P3HT पर आसानी से संवर्धित किया जा सकता है: PCBM substrates, (वर्णित प्रोटोकॉल का 3.2 चरण में इस्तेमाल किया फ़ाइब्रोनेक्टिन) की तरह एक उपयुक्त आसंजन परत जमा है कि प्रदान की है। P3HT: दृश्य स्पेक्ट्रम के हरे भाग में PCBM ऑप्टिकल अवशोषण चोटियों; हालांकि अन्य प्रकाश के प्रति संवेदनशील संयुग्मित पॉलिमर वरीय photostimulation तरंग दैर्ध्य रेंज (चित्रा 2) के अनुसार, का चयन किया जा सकता है। । PCBM फिल्म में दिखाया गया है: इन substrates के biocompatibility न केवल सेल लाइनों न्यूरॉन्स 15 और astrocytes के प्राथमिक संस्कृतियों के साथ भी HEK-293 की तरह 18,21, लेकिन 17 एक P3HT पर संवर्धित स्वस्थ HEK 293 कोशिकाओं का एक विशिष्ट माइक्रोग्राफ़ के साथ प्रदर्शन किया गया है चित्रा 3 में। प्रकाश सक्रिय substrates के द्वारा मध्यस्थता कोशिकाओं के ऑप्टिकल उत्तेजना प्रकाश प्रोत्साहन की अवधि पर निर्भर करता है, कोशिका झिल्ली पर अलग अलग प्रभाव में परिणाम कर सकते हैं। 18 प्रकाश नाड़ी की शुरुआत करने पर, एक(लगभग 3 एम वी की तीव्रता और लगभग 1 मिसे की अवधि के साथ) तेजी से कील कोशिका झिल्ली संभावित रिकॉर्डिंग (चित्रा 4) में देखा जा सकता है। यह संकेत सक्रिय सामग्री में आरोप पीढ़ी पर बहुलक / इलेक्ट्रोलाइट इंटरफेस की एक capacitive चार्ज की वजह से है।
इस प्रारंभिक तेजी से spiking के बाद, (लगभग 1 एम वी की तीव्रता और मिसे के दसियों के आदेश पर एक अवधि के साथ) एक क्षणिक विध्रुवण सेल (चित्रा 4) में मनाया जाता है। प्रकाश बंद है के रूप में प्रकाश दालों की कमी के लिए, एक विपरीत व्यवहार मनाया जाता है। इन संकेतों को प्रकाश के अवशोषण निम्नलिखित कारण स्थानीय हीटिंग के लिए झिल्ली समाई में एक बदलाव के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है।
लंबे समय तक रोशनी के लिए, तथापि, प्रकाश दालों के दौरान प्रारंभिक विध्रुवण एक सेल hyperpolarization (चित्रा 5) में बदल जाता है। यह घटना है एकएक थर्मल मूल हासिल है, लेकिन इस मामले में यह वृद्धि की वजह से तापमान से प्रेरित आयन चैनल चालकता में बदलाव के लिए झिल्ली संतुलन क्षमता के विभिन्नता से संबंधित है।
प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट की चित्रा 1. स्केच। सेलुलर ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए इस्तेमाल प्रकाश सक्रिय इंटरफेस एक आईटीओ लेपित गिलास सब्सट्रेट पर जमा जैविक अर्धचालकों की एक पतली फिल्म बना रहे हैं। यह एक उपयुक्त आसंजन परत (जैसे, फ़ाइब्रोनेक्टिन) के साथ इलाज किया गया है के बाद कोशिकाओं डिवाइस सतहों पर सीधे उगाया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2. absorp सब्सट्रेट के एक आंशिक transparence बनाए रखते हुए विभिन्न संयुग्मित पॉलिमर के tion के स्पेक्ट्रा। कार्बनिक अर्धचालकों की पतली फिल्मों के उपयोग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में महान tunability अनुमति दे सकता है। एक उदाहरण के रूप में, आम तौर पर photovoltaics में प्रयुक्त विभिन्न संयुग्मित पॉलिमर के अवशोषण स्पेक्ट्रा रिपोर्ट कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा एक प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट पर 3. HEK 293 कोशिकाओं सुसंस्कृत। ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद एक प्रकाश द्वारा सहज प्रभावित सब्सट्रेट की सतह पर सुसंस्कृत HEK 293 कोशिकाओं की विशिष्ट माइक्रोग्राफ़। स्केल बार, 20 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
20 मिसे प्रकाश दालों के साथ HEK 293 कोशिकाओं की चित्रा 4. ऑप्टिकल उत्तेजना। प्रकाश की एक 20 मिसे नाड़ी द्वारा हासिल एक HEK-293 सेल की झिल्ली क्षमता का रूपांतर। प्रकाश की शुरुआत पर एक प्रारंभिक तेज कील नाड़ी के दौरान सेल की एक विध्रुवण द्वारा पीछा किया जाता है। प्रकाश बंद है के रूप में, एक विपरीत व्यवहार मनाया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
200 मिसे प्रकाश दालों के साथ HEK 293 कोशिकाओं की चित्रा 5. ऑप्टिकल उत्तेजना। रूपांतर प्रकाश की एक 200 मिसे नाड़ी द्वारा हासिल एक HEK-293 सेल की झिल्ली क्षमता में। कम आज के लिए मनाया प्रारंभिक विध्रुवणination केवल लंबे समय तक रोशनी की मिसे के कुछ दसियों के बाद सेल के एक hyperpolarization में बदल जाता है, जो एक क्षणिक घटना है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कोशिकाओं के ऑप्टिकल उत्तेजना मुख्य रूप से प्रकाश के प्रति संवेदनशील बहुलक की पसंद, थर्मल नसबंदी मापदंडों, तीव्रता और प्रकाश उत्तेजनाओं की अवधि को चिंता में इन विट्रो के लिए सूचना प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम। एक P3HT: यह अच्छा लौकिक और विद्युत स्थिरता की गारंटी देता है के बाद से PCBM पतली फिल्म, यहां चयनित किया गया था। हालांकि, एक नहीं सभी प्रकाश के प्रति संवेदनशील पॉलिमर रोशनी पर अधिक विशेष रूप से, 22 अनुरूप प्रदर्शन की पेशकश कर सकते हैं कि ध्यान देना चाहिए। इसके अलावा, इस मामले में पैरामीटर बहुलक Optoelectronic सुविधाओं की काफ़ी बड़ी गिरावट के लिए नेतृत्व नहीं है थर्मल नसबंदी चयनित; नोटिस हालांकि मामले में नसबंदी विधि या थर्मल उपचार मापदंडों बदल रहे हैं, वह है, बहुलक गुणों पर संभावित प्रभावों को ध्यान से मूल्यांकन किया जाना चाहिए। यह जाना जाता है, उदाहरण के लिए, कि यूवी जोखिम तेजी की वजह से विकार घटाने के लिए, अपरिवर्तनीय बहुलक विरंजन और गिरावट की ओर जाता है। इसके अलावा, विभिन्न annealingतापमान और अवधि बिजली के प्रभारी परिवहन संपत्तियों पर नकारात्मक प्रभाव के साथ, बहुलक सतह के विभिन्न रूपात्मक आदेश को जन्म दे सकती है। photoexcitation प्रोटोकॉल के मापदंडों को ध्यान के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन किया जाना चाहिए: 100 मेगावाट / 2 सेमी, और / या लंबे समय तक उत्तेजनाओं ऊपर उत्तेजना घनत्व, आसानी से बहुलक गिरावट और photostimulation प्रोटोकॉल की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। PCBM सतह: प्रोटोकॉल में एक और महत्वपूर्ण कदम के कारण P3HT की उच्च hydrophobicity डिग्री करने के लिए, एक प्रोटीन आसंजन परत के उपयोग में होते हैं। कोई आसंजन परत जैव बहुलक इंटरफेस, सेल बोने और प्रसार की प्राप्ति में कार्यरत है तो गंभीरता से समझौता किया जा सकता है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख महत्वपूर्ण कदम है और बाधाओं के भीतर, तथापि, सूचना प्रोटोकॉल सीधी विशिष्ट प्रयोगात्मक आवश्यकताओं और उद्देश्यों के अनुसार संशोधित किया जा सकता है। अन्य स्थिर, प्रकाश के प्रति संवेदनशील पॉलिमर कई कॉम से, 7 पाया जा सकता हैतौर पर वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं या ठीक से नए यौगिकों synthesizing द्वारा। यह लाल और NIR श्रृंखला के लिए नीले रंग से फैले, अलग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के उपयोग की अनुमति देता है। इसके अलावा, बहुलक बयान तकनीक स्पिन कोटिंग का उपयोग करने के लिए सीमित नहीं है। दरअसल, अच्छा एकरूपता और उपयुक्त फिल्म मोटाई सुनिश्चित अन्य तरीकों ऐसी स्याही जेट मुद्रण, स्प्रे कोटिंग, या सेल बढ़ रहा है मीडिया के साथ और नसबंदी विधि के लंबे समय तक संपर्क के प्रभाव blading के रूप में परिकल्पित किया जा सकता प्रत्येक नई सामग्री के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए विचार में लिया। प्रोटीन आसंजन परतों के उपयोग यहाँ रिपोर्ट के रूप में, बहुलक सतहों, फ़ाइब्रोनेक्टिन की विशिष्ट उपयोग के शीर्ष पर अच्छा सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, भले ही अनिवार्य नहीं है। विभिन्न आसंजन प्रोटीन परतों को भी विकसित करने के लिए सेल लाइन के अनुसार, इस्तेमाल किया जा सकता है, 21, उदाहरण के लिए neuronal कोशिकाओं को आम तौर पर एक पाली एल Lysine परत पर सुसंस्कृत हैं। अंत में, रोशनी प्रोटोकॉल बदल गया है और सपा के लिए अनुकूलित किया जा सकताecific की जरूरत है, तरंग दैर्ध्य, स्थान आकार, बिजली उत्तेजना घनत्व, समय उत्तेजनाओं अवधि और आवृत्ति, प्रकाश घटना दिशा के संदर्भ में (सब्सट्रेट से या इलेक्ट्रोलाइट स्नान से)। संक्षेप में ऊपर कहा गया है, हालांकि, प्रोटोकॉल मापदंडों की परिभाषा खाते में मामले में एक बहुत भिन्न हो सकते हैं जो बहुलक ऑप्टिकल अवशोषण रेंज और संभव गिरावट प्रभाव, ले जाना चाहिए।
कुछ प्रकाश के प्रति संवेदनशील पॉलिमर के सीमित लौकिक और विद्युत स्थिरता वास्तव में तकनीक का मुख्य सीमाओं का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, किसी भी आगे की शुद्धि के बिना वाणिज्यिक पॉलिमर के उपयोग की वजह से विभिन्न पवित्रता की डिग्री करने के लिए सामग्री के विभिन्न बैचों, बीच परिणामों की सीमित repeatability के लिए कुछ मामलों में हो सकता है।
हम यह भी CSPP प्रोटोकॉल में phototransduction प्रभाव के आधार पर सटीक तंत्र अभी भी आगे स्पष्ट और विशेषता है कि जरूरत होने की सूचना है। थर्मल, बिजली और रासायनिक पीएचसंभवतः अलग जैविक मॉडल में विभिन्न विस्तार में, शामिल enomena हैं। पूरी समझ पूरी तरह तकनीक का फायदा उठाने के लिए महत्वपूर्ण होगा। इन विवो आवेदनों के मामले में विशेष रूप से, यह शायद ही नियंत्रित किया जा सकता है, क्योंकि विशेष रूप से, गर्मी की मध्यस्थता घटना की घटना, तकनीक की एक सीमा के रूप में समीक्षा की जानी चाहिए, और स्थानीय overheating प्रभाव पैदा कर सकते हैं। गर्मी प्रवाहकीय रास्तों की उचित इंजीनियरिंग द्वारा बाह्य वातावरण में गर्मी प्रसार को नियंत्रित करने के उद्देश्य से इस उपकरण का एक विशिष्ट कार्यान्वयन, तकनीक का पूरा दोहन करने के लिए अगले भविष्य में आवश्यक प्रकट हो सकता है।
साहित्य में, कोशिकाओं और ऊतकों के तापमान की मध्यस्थता उत्तेजना के लिए ऑप्टिकल दालों का उपयोग करने वाले विभिन्न तकनीकों, इन विट्रो में और इन विवो दोनों पाया जा सकता है। इन अध्ययनों में, पानी से आईआर लेजर बीम का अवशोषण आमतौर पर एक पारगमन तंत्र के रूप में प्रयोग किया जाता है। 23-25 इन्फ्रारेड करने के लिए सम्मान के साथतंत्रिका उत्तेजना, CSPP तंत्र विशेष रूप से इन-विट्रो प्रयोगों के लिए, अलग फायदे हैं। कि उत्तेजना के लिए एक मानक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी की उत्तेजना पथ द्वारा प्रदान किया जा सकता है तो CSPP, दिखाई रेंज में और मध्यम तीव्रता के प्रकाश पर आधारित है। इसके विपरीत, जल अवशोषण, तैयारी की निकटता में micromanipulated ऑप्टिकल फाइबर जैसे बाहरी स्रोतों के माध्यम से नमूना के लिए दिया जाना है, जो (मुख्य रूप से चारों ओर 1.45 माइक्रोन और 1.93 माइक्रोन) आईआर, में तरंग दैर्ध्य की आवश्यकता है एक मानक के ऑप्टिकल ट्रेन के बाद से माइक्रोस्कोप ऐसी तरंग दैर्ध्य में इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है। CSPP के मामले में, लेजर स्कैनिंग सिस्टम के साथ ही स्थानिक प्रकाश माड्युलेटर्स के साथ प्राप्त प्रकाश पैटर्न सीधे सबसे सूक्ष्मदर्शी ऑप्टिकल प्रशिक्षित करने के लिए मिलकर किया जा सकता है। इस तरह से, जैविक अर्धचालकों के आधार पर substrates के photostimulation यह संभव दोनों उच्च अस्थायी एक साथ स्वतंत्र रूप से देखने के क्षेत्र में कई कोशिकाओं की उत्तेजना प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं एन डी स्थानिक संकल्प।
ऑप्टिकल उत्तेजना के लिए एक और अत्यधिक मूल्यवान विकल्प कोशिकाओं में आनुवंशिक रूप से photoactivatable जांच के लक्षित अभिव्यक्ति पर आधारित है, आनुवंशिक विधियों द्वारा की पेशकश की है। Optogenetics दोनों उत्तेजित और बिजली की गतिविधि को बाधित, और आनुवंशिक रूप से हित के विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की विशिष्ट उप आबादी को लक्षित किया जा सकता कर सकते हैं, मेगावाट / 2 मिमी की कुछ दसियों की रेंज में ठेठ रोशनी तीव्रता के साथ, आजकल अभूतपूर्व अस्थायी और स्थानिक संकल्प प्रदान करता है। हालांकि, यह अभी भी हल किया जाना है कि कुछ मुद्दों को प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से, सुरक्षा जीन अभिव्यक्ति के लिए वायरस के उपयोग के संबंध में चिंताओं, विशेष रूप से मानव में, और स्थिर और नियंत्रित लंबी अवधि heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति की उपलब्धि अभी भी प्रमुख चुनौतियों का प्रतिनिधित्व करते हैं। CSPP तकनीक जीन स्थानांतरण के लिए की जरूरत है, और इन विवो अनुप्रयोगों के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक हैं, जो सभी संबंधित सुरक्षा चिंताओं को दरकिनार करने के लिए अनुमति देता है।
jove_content "> सभी के सभी, CSPP विधि यह आक्रामक नहीं है, जबकि यह आसानी से किसी भी मौजूदा electrophysiological काम स्टेशन के लिए मिलकर किया जा सकता है और यह जटिल लेजर स्रोतों या आनुवंशिक अभिकर्मक की आवश्यकता नहीं है। अंतर्जात photostimulation तकनीकों के संबंध में कई लाभ प्रदान करता है उच्च स्थानिक और लौकिक चयनात्मकता को बनाए रखने। इन कारणों के लिए, CSPP वादा धारण इन विट्रो जांच तंत्रिका विज्ञान में एक पूरक उपकरण बनने के लिए, और इन विवो अनुप्रयोगों में नए दृष्टिकोण को खोलने के लिए। हालांकि, भौतिक विज्ञान, भौतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग से एक बड़ा प्रयास समुदायों, निखारने का अनुकूलन और पूरी तरह से तकनीक का फायदा उठाने की जरूरत आगामी वर्ष में होने की उम्मीद है।Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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