Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Published: January 28, 2016 doi: 10.3791/53494
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Center for Nano Science and Technology @PoliMi, Istituto Italiano di Tecnologia, 2Dipartimento di Fisica, Politecnico di Milano

Introduction

האפשרות לתפעל את הפעילות הסלולר עם רזולוציה מרחב ובזמן מדויקת מייצגת אסטרטגיה מרכזית במחקר נירולוגית מדעי ובטיפול בהפרעות נוירולוגיות ופסיכיאטריות. 1 שיטות מסורתיות מבוססות על גירוי חשמלי של תאים באמצעות אלקטרודות הממוקמים בקרבה או במגע עם המערכת ממוקדת, 2 אשר יכול להיות שונות של מורכבות (תא בודד, רשת סלולרית, פרוסות מוח, ב- vivo רקמות מוח). במאות השנים האחרונות, השימוש בתיקון מהדק, מתכת ואלקטרודות משולבות מצע סיפק תמונה מפורטת של הפיסיולוגיה ופתופיזיולוגיה של נוירונים בודדים ושל מנגנוני התפקוד של רשתות עצביות. עם זאת, גירוי חשמלי סובל ממגבלות חשובות. הראשון קשורה לרזולוציה מרחבית ירודה בדרך כלל עקב ממדיו הפיזיים של אלקטרודות והגיאומטריה הקבועה שלהם, שלא ניתן להתאים בקלותלמערכות מאורגנות מורכבות כמו רקמות ביולוגיות. כמו כן, בעיות הקשורות לעכבת אלקטרודות ודיבורים צולבים בין מערכות גירוי והקלטה עלולות להידרדר יחס אות לרעש הסופי של המדידות. 3 מצד השני, השימוש באור לגירוי עשוי לעזור להתגבר על מגבלות רבות של גישת החשמל. קודם כל, היא מציעה מרחבי חסרי תקדים (<1 מיקרומטר) ורזולוציה של זמן (אלפיות שנייה <1), מה שמאפשר למקד סוגי תאים ספציפיים או אפילו תאים תת-תא. בנוסף זה מאוד לא פולשנית שכן הוא נמנע מכל מגע פיזי עם הרקמה של עניין ומתיר גירוי מהקלטה. יתר על כן, שתי עוצמת אור באורך גל ויכולים להיות מוסדר דווקא וניתן ליישם פרוטוקולי גירוי כך מגוונים. 3,4

עם זאת, הרוב המכריע של תאים של בעלי חיים אינו מציג שום רגישות ספציפית לאור. כמה אסטרטגיות לstimulatio אופטיn יש לי כך הוצע, או ניצול מתווכים מולקולריים רגיש לאור סמוך או בתוך התאים, או באמצעות מכשיר photoactive להציב חיצוני, קרוב לתא. הקטגוריה לשעבר מתייחסת למנגנונים אנדוגניים כמו הגירוי באמצעות אור נראה או אינפרא אדום (IR), כמו גם השימוש בשני תרכובות photoisomerizable / photocleavable או הביטוי הגנטי של מפעילים רגישים מולקולריים (optogenetics). הכיתה האחרונה כוללת טכניקות לגירוי אקסוגני שהושג עם השימוש של ננו / מיקרו-חלקיקים אורגניים או מצעי סיליקון photoconductive. 5 עם זאת, יש את כל המערכות הללו צדדים וחסרונות בהירים. בפרט, קליטת אנדוגני של תאים בטווח הנראה לעין היא חלשה ולא אמינה, והדור הנלווה של מיני חמצן מגיבים עלולה להזיק לתא. באופן כללי, IR משמש לגרימת חימום תרמי מקומי עקב ספיגת מים, אבל מקדם ההכחדה של מים הוא קטן, ולכן דורש stאור אינפרא אדום רונג (מעשרות עד מאות W / 2 מ"מ) שקשה לספק באמצעות אופטיקה מיקרוסקופ הרגילה ועלולים להוות חששות בטיחות עבור יישומים ב- vivo. מצד השני, יש לי תרכובות כליאת צילום החלפה מוגבלת פעולה בזמן ולעתים קרובות דורשות אור UV שקשה לספק בשל חדירת רקמה מוגבלת. בנוסף הם סובלים מבעיות דיפוזיה של התרכובות מופעלות על photolysis מחוץ לאזור המואר. לבסוף, כלים optogenetic אפשרו למדענים לכוון תת-אוכלוסייה סלולרית ספציפית ותת-תאים והם מתפתחים במהירות כאחת הטכנולוגיות המרכזיות במחקר נירולוגית מדעי. עם זאת, החדרת מקטע DNA אקסוגני באמצעות וקטור ויראלי מעלה סוגיות בטיחות חשובות, במיוחד לאור האימוץ בחולים אנושיים. 5,6 מסיבות אלה, מחקר על חומרים ומכשירים חדשים מסוגלים מניפולציה אופטית תא הוא נושא חם מאוד.

לאחרונה, רומןהגישה מבוססת על השימוש בפולימרים מצומדות רגיש לאור, יוכלו transduce גירוי אופטי ביעילות לאפנון של פעילות החשמלית של תאים, הוצעה. גירוי התא על ידי פולימר Photoexcitation (CSPP) טכניקה מנצלת תכונות רבות המאפשרים מפתח האופייני של מוליכים למחצה אורגניים: הם מהותי רגישים לאור בטווח הנראה לעין; 7 הם ביולוגית, רכים וconformable והגמישות המכנית שלהם מאפשרת ממשק אינטימי עם רקמה גם במבחנה וב- vivo 8-10. חוץ מזה, הם יכולים להיות פונקציונליות בקלות טובה יותר להסתגל לממשק עם תאי חיים, ולאפשר לעירור ספציפי, חיטוט וחישת יכולות. 11,12 יתר על כן, הם תומכים אלקטרוניים, כמו גם תחבורה יונית, שהופך אותם אידיאליים לשילוב ביולוגיה מודעת אלקטרוניקה. 13,14 מעניין, הם יכולים לעבוד במצב פוטו, למנוע את הצורך ליישם F הטיה חיצוניאו גירוי אופטי תא יעיל. 15

האמינות של טכניקת CSPP כבר הוכיחה בעבר בכמה מערכות, כוללים נוירונים עיקריים, 15,16 האסטרוציטים, 17 קווים משניים תא 18 ורקמות רשתית explanted. 16 בעבודה זו, בכל הצעדים הדרושים כדי להמציא ביו-פולימר רגיש לאור ממשק 19 לגירוי אופטי של מערכות ב- מבחנה מתואר בפירוט. כמקרה מבחן, תערובת פוטו אורגנית טיפוסית של האזור-רגיל פולי (3-hexylthiophene) (RR-P3HT), מתפקד כתורם אלקטרונים, ואסתר פניל-C61-butyric-חומצה-מתיל (PCBM), הפועל כ מקבל אלקטרונים הוא מועסק. כמערכת הביולוגית, תאי כליה העוברית אנושי (HEK-293) משמשים. דוגמא לפרוטוקול photostimulation עם ההקלטה היחסית של פעילות תאים באמצעות מדידות אלקטרו מסופקת.

הפלטפורמה תיארהעם זאת תוקף כללי, וניתן להאריכה בקלות לשימוש בפולימרים מצומדות אחרים (על ידי התאמת תהליך פתרון ההכנה ופרמטרי התצהיר כראוי), תאים מסוגים שונים (על ידי שינוי כראוי פרוטוקול תרבית תאים, ציפוי הליך ושעה רצוי לזריעת תאים והתפשטות) ופרוטוקולים שונים גירוי (אורך גל אור, תדירות ומשך זמן גירויים, צפיפות photoexcitation).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת מצעי photoactive

  1. הכן P3HT: פתרון PCBM (1: 1 w / w) בchlorobenzene בריכוז P3HT של 20 גרם / ליטר. מערבבים את הפתרון עם בוחש מגנטי לפחות 4 שעות ב 60 ° C. שקול נפח של 150 μl של פתרון לכל מצע להיות מוכן.
  2. שקופיות נקיות מצופה איטו זכוכית (ים R = 10 Ω / מ"ר, 18x18 מ"מ 2, 170 מיקרומטר העובי) עם אמבטיות רצופות של מים ללא יונים, אצטון וisopropanol בsonicator (10 דקות לכל שלב). יבש coverslips עם אקדח חנקן. שים את הדגימות בשואב פלזמה ב 100 כוח W במשך 10 דקות.
  3. להפקיד סרט דק של השכבה הפעילה במצעים ניקו באמצעות ספין ציפוי.
    1. עם טיפ יהלום, לחתוך שקופיות זכוכית מיקרוסקופ, (עובי ≈ 1 מ"מ) לאותו ממדי רוחב של מצעים מצופים איטו. הסר את P3HT: פתרון PCBM מהפלטה החשמלית ולתת לו להתקרר לטמפרטורת סביבה.
    2. להגדיר שני-stתכנית eps ספין coater: i) 30 שניות ב 800 סל"ד; ii) 30 שניות ב1,600 סל"ד. מניחים את השקף על צ'אק של הספין-coater ולהתחיל הוואקום כדי לתקן את זה. לשים טיפה של אצטון בשקופית ולאחר מכן המצע ניקה, עם הצד מצופה איטו יפנה כלפי מעלה. התחל את סיבוב הספין coater להיפטר מעודף אצטון.
    3. שים 150 μl של P3HT: פתרון PCBM על מצעים ולהתחיל שוב את הספין-coater (משתמש באותו הפרוטוקול מתואר ב1.3.2).
    4. לאחר הספין-coater סיים, להסיר את המדגם ולנתק את המצע המצופה משקופיות הזכוכית בזהירות. נקה את החלק האחורי של המצע עם ספוגית חדר נקי הטבולה באצטון.
      הערה: מצעי photoactive יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים בקופסא חשוכה עד שימוש. לתקופות ארוכות יותר, לשמור אותם בתא כפפות עם גז אינרטי.

2. הכנת פתרונות תרבית תאים בינוניים ואלקטרופיזיולוגיה

  1. הכן את המדיום מלא צמיחה (CGM) לHEK-293 תאים: השתנה Dulbecco בינוני של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) לא לחמם מומת, 100 U / פניצילין מיליליטר ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין. לעקר בינוני עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן את הפתרון תאי במי ultrapure (ריכוזים במ"מ): 135 NaCl, 5.4 KCl, 5 HEPES, 10 גלוקוז, 1.8 CaCl 2, 1 MgCl 2. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת סינון 0.2 מיקרומטר וחנות על 4 מעלות צלזיוס.
  3. הכן את הפתרון תאיים במי ultrapure (ריכוזים במ"מ): 12 KCl, 125 K-Gluconate, 1 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. שים לב שה- ATP-Na 2 הוא רגיש לחום ולהוסיף אותו אחרון. התאם ל- pH 7.4 עם NaOH. לעקר את הפתרון עם מערכת 0.2 מיקרומטר סינון, aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C.

3. HEK-293 תאי ציפויעל מצעים הפעילים

  1. מניחים את מצע photoactive בכוס זכוכית מכוסה באלומיניום או בצלחת פטרי סגורה ולשים בתנור על 120 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 לעיקור. מרגע זה ואילך, לבצע את כל הפעולות בתנאים סטריליים. שים את הדגימות במנדף סטרילי ולתת להם להתקרר.
  2. מעיל מצע photoactive עם שכבת הדבקה כדי להפחית את הידרופוביות פני השטח ולקדם הידבקות תא.
    1. מניחים את מצעים הפעילים בצלחת פטרי P35 או צלחת multiwell 6. בהתחשב בהידרופוביות של שכבת הפולימר מצומדות, לעשות polydimethylsiloxane (PDMS) גם כדי לתקן את המדגם ולהגביל את הפתרונות.
      1. מערבבים PDMS וזרז ב- 10: חלק 1 עם מוט זכוכית להשיג slurry צמיג.
      2. יוצקים את slurry בצלחת multiwell 6, מחלק כמות מספקת לכיסוי מחצית מכל הטוב.
      3. חכה לפילמור PDMS ב RT.
      4. חותך את PDMS נרפא באמצע לobtaining צורת ריבוע של אותו הממד של מדגם הפולימר.
      5. לעקר את בארות PDMS על ידי טבילה בתערובת של 70% אתנול-מים לפחות 30 דקות.
    2. אם באמצעות PDMS גם, לגרד את שכבת photoactive לאורך כל הגבול של היטב עם פינצטה המחודדת, על מנת להימנע מניתוק של כל השכבה בעת הסרת PDMS גם לאחר culturing התא.
    3. מכסה את כל פני השטח של כל דגימה עם פתרון פיברונקטין (2 מ"ג / ליטר בPBS). נפח בין 500-750 μl לדגימה הוא בדרך כלל מספיק אם PDMS גם משמש (משטח ברור של באר: מ"מ 15x15 2). ללא PDMS גם, על 2 מיליליטר של פתרון פיברונקטין נחוץ כדי לטבול את המדגם לחלוטין; לשים לב שהמצע לא לצוף תוך הוספת הפתרון. דגירה הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה לפחות 1.
    4. הסר את פתרון פיברונקטין עם טפטפת זכוכית ולשטוף פעם אחת עם 2 מיליליטר של PBS.
  3. Plאכלתי HEK-293 תאים בדגימות שטופל פיברונקטין בצפיפות של 15,000 תאים / 2 סנטימטר במדיום גידול שלם. השתמש בנפח של 750-1,000 μl של CGM עבור כל דגימה אם PDMS גם משמש, אחרת 2-3 מיליליטר של CGM נחוצים. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 ל24-48 שעות.

4. מדידות אופטיות גירוי פרוטוקול ואלקטרו

  1. שים את הפתרון תאי באמבט מים ב 37 ° C לthermalize; להפשיר את הפתרון תאיים, לשים אותו במזרק 1 מיליליטר עם מחט 34 מד ולשמור אותו במגע עם קרח, כדי למנוע השפלה של ATP.
  2. קח מצע מצופה תא מן החממה, הסרת PDMS בזהירות גם אם קיימים. הסר את מדיום גידול עם טפטפת זכוכית ולשטוף את המדגם עם פתרון תאי. להתקדם לאט, כדי למנוע ניתוק תא.
  3. להעביר את המכשיר לדוגמה-בעל תחנת אלקטרופיזיולוגיה עם solutio תאיn ואת האלקטרודה ההתייחסות. הכן micropipettes זכוכית הטרי לתיקון מהדק עם חולץ (התנגדות אידיאלית הוא בטווח 2-4 MΩ). מלא חצי של פיפטה עם פתרון תאיים ולהעלות אותו על micromanipulator.
  4. חפש תא בריא לתיקון במכשיר. כדי להימנע מעירור לא רצוי של מצע photoactive, להשתמש תאורת IR עבור הדמיה, הצבת מסנן ארוך גל לעבור (לדוגמא, λ = 750 ננומטר אורך גל חתך יכול לשמש לקליטת פולימרים בגלוי) מול נורת מיקרוסקופ.
  5. תיקון התא הנבחר ולהחיל את הפרוטוקול הרצוי לגירוי אופטי על ידי מתן אור למדגם דרך השביל עירור הקרינה של מיקרוסקופ (איור 1). ניתן למצוא תיאור מפורט של פרוטוקול תיקון מהדק בהתייחסות 20.
    1. מקם את פיפטה התיקון בקרבת קרום התא עם מניפולטור מיקרומטרי. במהלך המיצוב, להחיל overpressurדואר לפיפטה כדי למנוע הידבקות לכלוך על הקצה. פיפטה צריכה להיות כמה מיקרונים מעל התא.
    2. התחל הורדת פיפטה לעבר קרום התא תוך שליטה על התנגדות פיפטה בתוכנת שליטת תיקון. כאשר התנגדות פיפטה גדלה על 1 MΩ, להסיר את לחץ היתר מפיפטה תוך יישום שאיבה עדינה, כדי ליצור את gigaseal בין פיפטה וקרום התא (כלומר, ההתנגדות הנמדדת צריכה להגדיל בערכים גדולים מ -1 GΩ) .
    3. החל פוטנציאל שלילי לפיפטה הקרובה לתא הצפוי פוטנציאל מנוחה (לHEK293 תא פוטנציאל של -40 יכול לשמש mV) כדי לעזור לייצב את החותם. לפצות ארעיים קיבולי בשל קיבול פיפטה עם פקודות יחסי על מגבר התיקון ו / או תוכנת שליטת תיקון.
    4. לשבור את הקרום כדי לאפשר גישת חשמל לציטופלסמה התא על ידי החלת דופק יניקה קצרה ואינטנסיבילפיפטה. הגדר את מגבר התיקון למצב הנוכחי מהדק (אני = 0, כלומר, ללא נוכחית מוזרק לתוך התא) כדי לעקוב אחר פוטנציאל קרום תא. חכה כמה דקות כדי לראות אם פוטנציאל התא הוא יציב.
    5. החל פרוטוקול התאורה הרצויה לתא ולהקליט את ההשפעה על פוטנציאל הממברנה.
      הערה: התאורה יכולה להיות מועברת למדגם או מלמטה או מלמעלה, בהתאם לארכיטקטורת מיקרוסקופ.
      1. בחר גל עירור שנספג היטב על ידי החומר הפעיל; לP3HT: תערובת PCBM, ניתן להשתמש באורך גל בטווח 450-600 ננומטר. צפיפות photoexcitation מתאימה נמצאות ב10-100 mW / מ"מ הטווח 2.
        הערה: פולסים קצרים של אור (להלן 10-20 אלפיות שנייה) תוצאה בשלילת קוטביות חולפת של התא, ואילו עם תאורה ממושכת (מאות אלפיות שנייה או פולסים ארוכים יותר) hyperpolarization מתמשך הוא ציין עד האור כבוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תאים יכולים להיות בקלות בתרבית על P3HT: מצעי PCBM, ובלבד ששכבת הדבקה מתאימה מופקדת (כמו פיברונקטין משמש בשלב 3.2 של הפרוטוקול המתואר). פסגות קליטה אופטי PCBM בחלק הירוק של הספקטרום הנראה;: P3HT עם זאת ניתן לבחור פולימרים מצומדות רגישים לאור אחרים, בהתאם לטווח אורכי גל photostimulation המועדף (איור 2). התאמה ביולוגית של מצעים אלה כבר הוכיחה לא רק עם שורות תאים 18,21 כמו HEK-293, אבל גם עם תרבויות עיקריות של נוירונים 15 והאסטרוציטים 17 מיקרוסקופ אופייני של HEK-293 תאים בריאים בתרבית על P3HT:. סרט PCBM מוצג באיור 3. גירוי אופטי של תאים בתיווכו של מצעי photoactive יכול לגרום להשפעות שונות על קרום התא, תלוי בזמן של גירוי האור. 18 עם תחילתה של דופק האור,ספייק המהיר (בעוצמה של mV על 3 ומשך של כ 1 אלפיות שני) ניתן לצפות בהקלטות קרום תא הפוטנציאליות (איור 4). אות זאת בשל טעינת קיבולי של ממשק הפולימר / אלקטרוליט על דור תשלום בחומר הפעיל.

לאחר spiking המהיר הראשוני זה, שלילת קוטביות חולפת (בעוצמה של כ 1 mV ומשך בסדר הגודל של עשרות אלפיות השניה) הוא ציינה בתא (איור 4). פולסים קצרים של אור, כמו האור כבוי, התנהגות הפוכה הוא ציין. אותות אלה יוחסו לוריאציה בקיבול קרום עקב חימום המקומי הבא קליטת אור.

לתאורה ממושכת, לעומת זאת, שלילת קוטביות הראשונית במהלך הבזקי האור הופכת לhyperpolarization תא (איור 5). לתופעה זו ישלהשיג מקור תרמית, אבל במקרה הזה זה קשור לוריאציה של פוטנציאל שיווי משקל קרום עקב שינוי במוליכות תעלות יונים הנגרמות על ידי הטמפרטורה עלתה.

איור 1
איור 1. סקיצה של מצע photoactive. ממשקי photoactive משמשים לגירוי אופטי סלולארי עשויות משכבה דקה של מוליכים למחצה אורגניים שהופקדו על מצע זכוכית מצופה איטו. ניתן לגדל תאים ישירות על משטחי המכשיר לאחר שטופל בשכבה מתאימה הידבקות (למשל, פיברונקטין). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. התעסקות ספקטרום tion של פולימרים מצומדות שונים. השימוש בשכבות דקות של מוליכים למחצה אורגניים עשויות לאפשר tunability הגדול בגל עירור תוך שמירת שקיפות חלקית של המצע. כדוגמא, ספקטרום הקליטה של פולימרים מצומדות שונים משמש בדרך כלל בphotovoltaics מדווחים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. HEK-293 תאים בתרבית על מצע photoactive. מיקרוסקופ אופייני של HEK-293 תאים בתרבית על פני השטח של מצע photoactive לאחר 24 שעות של דגירה. בר סולם, 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

e_content "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 "> איור 4
איור 4. גירוי אופטי של HEK-293 תאים עם 20 הבזקי אור msec. וריאציה של פוטנציאל הממברנה של תא HEK-293 שהושרו על ידי דופק msec 20 של אור. ספייק המהיר ראשוני על תחילתה של האור ואחריו שלילת קוטביות של התא במהלך הדופק. כאור כבוי, התנהגות הפוכה הוא ציין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. גירוי אופטי של HEK-293 תאים עם 200 הבזקי אור msec. וריאציה בפוטנציאל הממברנה של תא HEK-293 שהושרו על ידי דופק msec 200 של אור. שלילת קוטביות הראשונית נצפתה תאורה קצרהination היא רק תופעה חולפת, שלאחר כמה עשרות אלפיות השניה של תאורה ממושכת הופכת לhyperpolarization של התא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שלבים קריטיים של הפרוטוקול דיווח ב- מבחנה גירוי אופטי של תאים בעיקר נוגע לבחירה של הפולימר רגיש לאור, פרמטרים עיקור התרמיים, העצמה והמשך הזמן של גירויי אור. P3HT: סרט דק PCBM נבחר כאן, שכן הוא מבטיח יציבות זמנית ואלקטרוכימיים טובה. עם זאת, יש לשים לב שלא כל הפולימרים הרגישים לאור יכולים להציע הופעות אנלוגיות, 22 באופן ספציפי יותר על תאורה. בנוסף, במקרה זה נבחר עיקור תרמית פרמטרים לא יובילו להשפלה גדולה של תכונות אופטו פולימר; הודעה, עם זאת, במקרה שיטת העיקור או הפרמטרים טיפול התרמיים משתנות, השפעות אפשריות על מאפייני הפולימר יש להעריך בזהירות. זה ידוע, למשל, שהחשיפה לקרינת UV במהירות מובילה להלבנת פולימר בלתי הפיכה והשפלה, כתוצאה מאובדן הצמידה. יתר על כן, חישול שונהטמפרטורות ומשך עלולות להוביל לכדי מורפולוגיים שונה של פני השטח הפולימר, עם השפעות שליליות על נכסי תחבורת מטען החשמליים. הפרמטרים של פרוטוקול photoexcitation יש להעריך בזהירות, כמו גם: צפיפות עירור מעל 100 mW / 2 סנטימטר, ו / או גירויים ממושכים, עלולה בקלות להוביל להשפלת פולימר וכישלון של פרוטוקול photostimulation. עוד צעד קריטי בפרוטוקול מורכב בשימוש בשכבת הדבקת חלבון, כתוצאה ממידת הידרופוביות הגבוהה של P3HT: משטח PCBM. אם אין שכבת הדבקה מועסקת במימוש ממשק יו-פולימר, זריעת תאים וההתרבות עשוי להיות בסכנה ברצינות.

בתוך השלבים הקריטיים שהוזכרו לעיל ואילוצים, לעומת זאת, דיווח הפרוטוקול יכול להיות שונה בצורה ישירה, בהתאם לצרכי הניסוי הספציפיים והמטרות. ניתן למצוא פולימרים רגישים לאור אחר יציבים, 7, מכמה commercial ספקים או על ידי סינתזה כראוי תרכובות חדשות. זה מאפשר שימוש באורכי גל עירור שונה, המשתרע מהכחול לאדום הטווח וניר. יתר על כן, הטכניקה בתצהיר הפולימר אינה מוגבלת לשימוש ציפוי ספין. ואכן, ניתן בחזון שיטות אחרות להבטיח אחידות טובה ועובי סרט מתאים, כגון הדפסה בהזרקת הדיו, ציפוי תרסיס, או Blading ההשפעות של המגע הממושך עם תקשורת גוברת התא ושל שיטת העיקור יש להעריך עבור כל חומר חדש נלקח בחשבון. למרות שהשימוש בשכבות הידבקות חלבון יש צורך לקבל תרביות תאים טובות על גבי המשטחים פולימריים, השימוש הספציפי של פיברונקטין, כפי שדווחו כאן, לא חובה. ניתן להשתמש בשכבות חלבון הידבקות שונות, גם בהתאם לקו התא לגדול; 21 לדוגמא, תאים עצביים הם בדרך כלל בתרבית על שכבת פולי-L ליזין. לבסוף, ניתן לשנות פרוטוקולי תאורה ומותאמים לSPצרכי ecific, במונחים של אורך גל, גודל נקודה, צפיפות עירור כוח, משך זמן ותדירות גירויים, כיוון שכיחות אור (מהמצע או מאמבטית אלקטרוליט). כאמור לעיל בקצרה, לעומת זאת, ההגדרה של הפרמטרים הפרוטוקול צריכה לקחת בחשבון את טווח קליטת הפולימר אופטי ואפקטי השפלה אפשריים, אשר עשוי להשתנות הרבה ממקרה למקרה.

היציבות הזמנית ואלקטרוכימיים המוגבלת של כמה פולימרים רגישים לאור למעשה מייצגת את המגבלות העיקריות של הטכניקה. בנוסף, שימוש בפולימרים מסחריים ללא כל טיהור נוספת עלולים להוביל במקרים מסוימים לדירות מוגבלות של תוצאות בין קבוצות שונות של החומר, בשל מידת טוהר שונה.

כמו כן, אנו מבחינים כי המנגנונים המדויקים בבסיס השפעת phototransduction בפרוטוקולי CSPP עדיין צריכים להיות הובהרו נוסף ומאופיין. ph התרמי, חשמלי והכימיenomena הם אולי מעורב, במידות שונות במודלים ביולוגיים שונים. הבנה מלאה תהיה מפתח לנצל את הטכניקה באופן מלא. בפרט, את התרחשותן של תופעות בתיווך חום צריכה להיבדק כהגבלה של הטכניקה, שכן הוא יכול להיות כמעט בשליטה, ויכולה להוביל להשפעות התחממות יתר מקומיות, בפרט במקרה של יישומי in vivo. יישום ספציפי של המכשיר, שנועד לשלוט בדיפוזיה החום בסביבה תאית על ידי הנדסה נכונה של שבילי חום-מוליך, עלול לחשוף נחוץ בעתיד הקרוב לניצול המלא של הטכניקה.

בספרות, בטכניקות שונות המשתמשות בפולסים אופטיים לגירוי בתיווך טמפרטורה של תאים ורקמות, ניתן למצוא גם במבחנה וב- vivo. במחקרים אלה, הקליטה של קרן לייזר IR על ידי מים משמשת בדרך כלל כמנגנון התמרה. 23-25 ​​עם כל הכבוד לאינפרא אדוםעצבי גירוי, יש מנגנון CSPP יתרונות ברורים, במיוחד לניסויים במבחנה. CSPP מבוסס על אור בטווח הנראה לעין ושל עוצמה מתונה, כך שגירוי יכול להיות מסופק על ידי נתיב העירור של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי. להיפך, ספיגת מים דורשת אורכי גל בIR (בעיקר סביב 1.45 מיקרומטר ו1.93 מיקרומטר), שצריך להיות מועברים למדגם באמצעות מקורות חיצוניים כמו סיבים אופטיים micromanipulated בקרבתו של ההכנה, מאז הרכבת האופטית של סטנדרטי מיקרוסקופ לא ניתן להשתמש באורכי גל כזה. במקרה של CSPP, דפוסי האור שהושגו עם מערכות סריקת לייזר, כמו גם את מאפנני אור מרחבי יכולים להיות יחד ישירות לרכבת האופטית של רוב המיקרוסקופים. בדרך זו, photostimulation של מצעים המבוסס על מוליכים למחצה אורגניים יכול לעשות את זה אפשרי להשיג גירוי של כמה תאים בשדה הראייה באופן עצמאי, עם שני זמניים גבוהים רזולוציה מרחבית nd.

אלטרנטיבה יקרה מאוד אחרת לגירוי אופטי מוצעת על ידי שיטות גנטיות, המבוססת על ביטוי למיקוד של בדיקות גנטית בתאי photoactivatable. Optogenetics מציע כיום רזולוציה של זמן ומרחב חסר תקדים, עם עוצמות תאורה טיפוסיות בטווח של כמה עשרות mW / 2 מ"מ, יכול גם לרגש ומעכבים את פעילות חשמלית, ויכול להיות ממוקד גנטי לתת-אוכלוסיות ספציפיות של אזורים במוח הספציפיים של עניין. עם זאת, זה עדיין מציג כמה בעיות שצריכות לפתור. בפרט, חששות בטיחות בנוגע לשימוש בוירוסים לביטוי גנים, במיוחד בבני אדם, וההישג של ביטוי חלבון Heterologous היציב לטווח ארוך ובשליטה עדיין מייצגים את האתגרים הגדולים. טכניקת CSPP מאפשרת לעקוף את הצורך בהעברת גנים, וכל חששות הבטיחות הקשורים, אשר רלוונטיים במיוחד עבור יישומים ב- vivo.

jove_content "> בסך הכל, שיטת CSPP מציע מספר יתרונות ביחס לטכניקות photostimulation אנדוגני. מאז הוא לא פולשנית, זה יכול להיות בשילוב בקלות לכל תחנת עבודה אלקטרו הקיימת והוא אינו דורש מקורות לייזר מורכבים או transfection הגנטי, בעוד ש שמירה על סלקטיביות מרחב ובזמן גבוהה. מסיבות אלה, CSPP טומן בחובו הבטחה להפוך לכלי משלים במדעי מוח ב- מבחנה חקירות, ולפתוח אופקים חדשים ביישומים ב- vivo. עם זאת, מאמץ גדול ממדע, הפיזיקה והנדסת חומרים קהילות צפויות בשנים הקרובות, צריכה לחדד, לייעל ולנצל את הטכניקה באופן מלא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
rr-P3HT Sigma Aldrich 698989-5G
ITO-coated substrates Nano-CS IT10300100
Fibronectin Sigma Aldrich F1141
chlorobenzene Sigma Aldrich 319996
PCBM Nano-C Nano-CPCBM-BF
acetone  Sigma Aldrich 270725
isopropyl alcohol Sigma Aldrich 563935
HEK cells LGC standards srl ATCC-CRL-1573
HEPES Sigma Aldrich H0887
PBS Sigma Aldrich P5244
E-MEM LGC standards srl ATCC-30-2003
EDTA Sigma Aldrich E8008-
FBS LGC standards srl ATCC-30-2020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
  2. Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
  3. Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
  4. Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
  5. Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
  6. Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
  7. Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. Organic-based tristimuli colorimeter. Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509 (2007).
  8. Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
  9. Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
  10. Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
  11. Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
  12. Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
  13. Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. The Rise of Organic Bioelectronics. Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).
  14. Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
  15. Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
  16. Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
  17. Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
  18. Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
  19. Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
  20. Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
  21. Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
  22. Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
  23. Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
  24. Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
  25. Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 107 פולימרים מצומדות polythiophene הביו האורגני גירוי אופטי תא מוליכים למחצה אורגניים P3HT
שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martino, N., Bossio, C., Vaquero… More

Martino, N., Bossio, C., Vaquero Morata, S., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers. J. Vis. Exp. (107), e53494, doi:10.3791/53494 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter