Introduction
La possibilità di manipolare l'attività cellulare con una risoluzione spaziale e temporale preciso rappresenta una strategia fondamentale nella ricerca neuroscientifica e nel trattamento di disturbi neurologici e psichiatrici. 1 metodi tradizionali si basano sulla stimolazione elettrica delle cellule utilizzando elettrodi posizionati in prossimità o in contatto con il sistema mirato, 2 che può essere di diversa complessità (singola cellula, rete cellulare, sezioni di cervello, in vivo tessuti cerebrali). Nel secolo scorso, l'uso di patch-clamp, metallo e elettrodi substrato integrato hanno fornito un quadro dettagliato della fisiologia e fisiopatologia dei singoli neuroni e dei meccanismi di funzionamento delle reti neurali. Tuttavia, la stimolazione elettrica soffre di importanti limitazioni. Il primo è legato a una risoluzione spaziale generalmente scarsa a causa delle dimensioni fisiche degli elettrodi e la loro geometria fissa, che non può essere facilmente adattatoa sistemi organizzati complessi come i tessuti biologici. Inoltre, i problemi relativi alla impedenza elettrodi e di cross-talk tra sistemi di stimolazione e di registrazione possono deteriorare il rapporto finale segnale-rumore delle misurazioni. 3 D'altra parte, l'uso di luce per stimolazione può contribuire a superare molte limitazioni dell'approccio elettrico. Prima di tutto, offre spaziale senza precedenti (<1 um) e risoluzione temporale (<1 msec), rendendo possibile bersaglio specifici tipi cellulari o anche compartimenti sub-cellulari. Inoltre è altamente non invasiva poiché evita qualsiasi contatto fisico con il tessuto di interesse e districa stimolazione da registrazione. Inoltre, sia l'intensità della luce e lunghezza d'onda può essere regolata con precisione e possono essere applicati protocolli di stimolazione così diverse. 3,4
Tuttavia, la maggior parte delle cellule animali non presentano alcuna sensibilità specifica alla luce. Diverse strategie per stimulatio ottican sono stati quindi proposti, sia sfruttando mediatori molecolari fotosensibili nelle vicinanze o all'interno delle cellule, o utilizzando un dispositivo fotoattivi collocato esternamente, vicino alla cella. La prima categoria si riferisce a meccanismi endogeni come la stimolazione tramite (IR) di luce visibile o infrarossa, così come l'uso di composti photoisomerizable / photocleavable o l'espressione genetica di attuatori molecolari fotosensibili (optogenetics). Quest'ultima categoria comprende tecniche di stimolazione esogena ottenuta con l'uso di nano / micro-particelle inorganiche o substrati di silicio fotoconduttori. 5 Tuttavia, tutti questi sistemi hanno lati luminosi e svantaggi. In particolare, l'assorbimento endogena di cellule nel visibile è debole e non affidabile, e la generazione contemporanea di specie reattive dell'ossigeno può essere dannoso per la cella. In generale, IR viene utilizzato per indurre il riscaldamento termico locale dovuto all'assorbimento di acqua, ma il coefficiente di estinzione dell'acqua è piccola, richiedendo così strong luce infrarossa (da decine a centinaia di W / mm 2) che è difficile da trasportare via ottica microscopio standard e può comportare problemi di sicurezza per le applicazioni in-vivo. D'altra parte, foto-commutabile ingabbiamento composti hanno un'azione limitata tempo e spesso richiedono la luce UV che è difficile da trasportare a causa della penetrazione tissutale limitata. Inoltre essi soffrono di problemi di diffusione dei composti attivati su fotolisi fuori dell'area illuminata. Infine, gli strumenti optogenetic hanno permesso agli scienziati di indirizzare sottopopolazione cellulare specifico e sotto-scompartimenti e stanno rapidamente emergendo come una delle tecnologie chiave nella ricerca neuroscientifica. Tuttavia, l'inserimento di un segmento di DNA esogeno tramite un vettore virale solleva importanti problemi di sicurezza, soprattutto in vista di adozione su pazienti umani. 5,6 Per queste ragioni, la ricerca di nuovi materiali e dispositivi in grado di cellula manipolazione ottica è un argomento estremamente caldo.
Recentemente, un romanzo, è stato proposto approccio basato sull'uso di polimeri coniugati fotosensibili, in grado di trasdurre efficientemente uno stimolo ottico in una modulazione di cellula attività elettrica. La stimolazione delle cellule da Polymer fotoeccitazione (CSPP) tecnica sfrutta molte caratteristiche chiave di abilitazione tipico di semiconduttori organici: sono intrinsecamente sensibili alla luce nel campo del visibile, 7 sono biocompatibili, morbida e adattabile e la loro flessibilità meccanica permette un'interfaccia intima con tessuti sia in vitro e in vivo 8-10. Oltre a questo, possono essere facilmente funzionalizzati per meglio adattarsi all'interfaccia con cellule viventi, e per consentire l'eccitazione specifico, sondando e sentendo capacità. 11,12 Inoltre, essi sostengono elettronica e trasporto ionico, che li rende ideali per la combinazione dell'elettronica annuncio biologia. 13,14 interessante, possono lavorare in modalità fotovoltaico, evitando la necessità di applicare una polarizzazione esterna fo la stimolazione ottica cella efficiente. 15
L'affidabilità della tecnica CSPP è già stata dimostrata in diversi sistemi, compresi i neuroni primari, 15,16 astrociti, 17 linee di cellule secondarie 18 e tessuti retinici espiantati. 16 In questo lavoro, tutti i passi necessari per fabbricare un biopolimero sensibile alla luce interfaccia 19 per la stimolazione ottica di sistemi in vitro sono descritte in dettaglio. Come caso di studio, una miscela fotovoltaico organico prototipo di regione-regolare poli (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), che funge da donatore di elettroni, e fenil estere-C61-butirrico acido-metile (PCBM), in qualità di accettore di elettroni è impiegato. Poiché il sistema biologico, sono utilizzati embrionali umane di rene (HEK-293) le cellule. Viene fornito un esempio di un protocollo fotostimolazione con la relativa registrazione dell'attività delle cellule tramite misurazioni elettrofisiologiche.
La piattaforma descrittaè tuttavia di validità generale, e può essere facilmente esteso per l'uso di altri polimeri coniugati (regolando correttamente il processo di soluzione preparazione ei parametri di deposizione), diversi tipi di cellule (modificando adeguatamente il protocollo coltura cellulare, placcatura procedura e il tempo richiesto per la semina e la proliferazione delle cellule), e diversi protocolli di stimolazione (lunghezza d'onda della luce, frequenza stimoli e durata, densità fotoeccitazione).
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Protocol
1. Preparazione di substrati fotoattivi
- Preparare una P3HT: soluzione PCBM (1: 1 w / w) in clorobenzene ad una concentrazione di 20 g P3HT / L. Mescolare la soluzione con un agitatore magnetico per almeno 4 ore a 60 ° C. Consideriamo un volume di 150 ml di soluzione per ciascun substrato da preparare.
- Pulire vetrini ITO rivestite (R s = 10 Ω / sq, 18x18 mm 2, spessore 170 micron), con bagni consecutivi di acqua deionizzata, acetone e isopropanolo in un sonicatore (10 min per ogni passo). Asciugare il coprioggetto con una pistola di azoto. Mettere i campioni in un pulitore di plasma a 100 W di potenza per 10 min.
- Depositare un film sottile dello strato attivo sui substrati puliti tramite spin-coating.
- Con una punta di diamante, tagliare un vetrino da microscopio, (spessore ≈ 1 mm) per le stesse dimensioni laterali dei substrati rivestiti ITO-. Rimuovere il P3HT: soluzione PCBM dalla piastra e lasciate raffreddare a temperatura ambiente.
- Impostare un due steps programma di spin-coater: i) 30 sec a 800 rpm; ii) 30 sec a 1.600 giri al minuto. Posizionare il vetrino sul mandrino dello spin-verniciatore e avviare il vuoto per risolvere il problema. Mettere una goccia di acetone sul vetrino e quindi il substrato pulito, con il lato ITO rivestito rivolto verso l'alto. Avviare la rotazione di spin-coater per sbarazzarsi di acetone in eccesso.
- Mettere 150 ml di P3HT: soluzione PCBM sui substrati e riprendere lo spin-coater (usare lo stesso protocollo descritto in 1.3.2).
- Dopo lo spin-verniciatore ha finito, rimuovere il campione e staccare con cura il substrato rivestito dal vetrino. Pulire la parte posteriore del substrato con un tampone camera bianca immerso in acetone.
Nota: I substrati fotoattivi possono essere conservati per alcuni giorni in una scatola buia fino all'uso. Per periodi più lunghi, tenerli in un cassetto portaoggetti con gas inerte.
2. Preparazione di coltura cellulare e Elettrofisiologia Solutions
- Preparare il terreno di coltura completo (CGM) perCellule HEK-293: Dulbecco Modified Eagle (DMEM) supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) termicamente inattivati, 100 U / ml di penicillina e 100 mg / ml di streptomicina. Sterilizzare il mezzo con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione extracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 135 NaCl, KCl 5.4, 5 HEPES, 10 glucosio, 1.8 CaCl 2, 1 MgCl 2. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron e conservare a 4 ° C.
- Preparare la soluzione intracellulare in acqua ultrapura (concentrazioni in mm): 12 KCl, 125 K-gluconato, 1 MgCl 2, 0.1 CaCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na 2. Si noti che l'ATP-Na 2 è sensibile al calore e aggiungerlo scorso. Regolare il pH a 7,4 con NaOH. Sterilizzare la soluzione con un sistema di filtrazione 0,2 micron, aliquota in 1 ml provette e conservare a -20 ° C.
3. placcatura cellule HEK-293sui substrati attivi
- Posizionare il substrato fotoattivi in un bicchiere di vetro rivestito con alluminio o una piastra di Petri chiusa e messo in stufa a 120 ° C per 2 ore per la sterilizzazione. Da questo momento in poi, eseguire tutte le operazioni in condizioni sterili. Mettere i campioni in una cappa sterile e lasciarli raffreddare.
- Coat substrato fotoattivi con uno strato di adesione per ridurre l'idrofobicità superficiale e di promuovere l'adesione cellulare.
- Posizionare i substrati attivi in una capsula di Petri P35 o un piatto pozzetti 6. Data l'idrofobicità dello strato polimero coniugato, fare un polidimetilsilossano (PDMS) e fissare il campione e confinare le soluzioni.
- Mescolare PDMS e catalizzatore in 10: 1 proporzione con una bacchetta di vetro per ottenere un impasto viscoso.
- Versare l'impasto in una piastra multipozzetto 6, erogazione quantità sufficiente a coprire la metà di ciascun pozzetto.
- Attendere PDMS polimerizzazione a temperatura ambiente.
- Tagliare il PDMS curati in mezzo per obtaining una forma quadrata della stessa dimensione del campione di polimero.
- Sterilizzare il PDMS pozzetti per immersione in una miscela etanolo-acqua 70% per almeno 30 min.
- Se si utilizza bene le PDMS, graffiare lo strato fotoattivo lungo tutto il bordo del pozzetto con pinzette a punta, in modo da evitare il distacco dello strato intero quando si rimuovono le PDMS bene dopo coltura cellulare.
- Coprire l'intera superficie di ciascun campione con una soluzione di fibronectina (2 mg / L in PBS). Un volume tra 500-750 microlitri per campione è di solito sufficiente se un PDMS pozzo viene utilizzato (chiaro superficie del pozzetto: 15x15 mm 2). Senza le PDMS oltre, sono necessarie per immergere completamente il campione di circa 2 ml di soluzione di fibronectina; prestare attenzione che il substrato non galleggia durante l'aggiunta della soluzione. Incubare i campioni a 37 ° C per almeno 1 ora.
- Rimuovere la soluzione fibronectina con una pipetta di vetro e lavare una volta con 2 ml di PBS.
- Posizionare i substrati attivi in una capsula di Petri P35 o un piatto pozzetti 6. Data l'idrofobicità dello strato polimero coniugato, fare un polidimetilsilossano (PDMS) e fissare il campione e confinare le soluzioni.
- Plate cellule HEK-293 sui campioni fibronectina trattata ad una densità di 15.000 cellule / cm 2 in terreno di coltura completo. Utilizzare un volume di 750-1,000 ml di CGM per ciascun campione se un PDMS bene è utilizzato, altrimenti 2-3 ml di CGM sono necessari. Incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO 2 per 24-48.
4. ottico Stimolazione protocollo e misurazioni elettrofisiologiche
- Mettere la soluzione extracellulare in un bagno d'acqua a 37 ° C per thermalize; scongelare la soluzione intracellulare, metterlo in una siringa da 1 ml con un ago calibro 34 e tenerlo a contatto con il ghiaccio per evitare il degrado della ATP.
- Prendete un substrato cellulare rivestito dal termostato, togliendo con cura il PDMS bene se presente. Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta di vetro e risciacquare il campione con una soluzione extracellulare. Procedete lentamente per evitare il distacco delle cellule.
- Mettere il dispositivo nel campione-titolare della stazione di elettrofisiologia con solutio extracellularen e l'elettrodo di riferimento. Preparare micropipette di vetro freschi per patch-clamp con un estrattore (resistenza ideale è nel range 2-4 MW). Riempire la metà della pipetta con la soluzione intracellulare e montarlo sul micromanipolatore.
- Cercare una cellula sana di patch sul dispositivo. Per evitare eccitazione indesiderato del substrato fotoattivi, utilizzare illuminazione IR per l'imaging, ponendo un filtro passa-lunghezza d'onda (ad esempio, un taglio di lunghezza d'onda λ = 750 nm può essere utilizzato per i polimeri che assorbono nel visibile) davanti dell'illuminatore microscopio.
- Patch la cella selezionata e applicare il protocollo desiderato per la stimolazione ottica fornendo luce per il campione attraverso il percorso di fluorescenza di eccitazione del microscopio (Figura 1). Una descrizione dettagliata del protocollo patch-clamp può essere trovato in riferimento 20.
- Posizionare la pipetta di patch in prossimità della membrana cellulare con un manipolatore micrometrica. Durante il posizionamento, applicare overpressure alla pipetta per evitare incollamenti sporcizia sulla punta. La pipetta deve essere pochi micron sopra la cella.
- Avviare abbassando la pipetta verso la membrana cellulare controllando la resistenza pipetta sul software di controllo patch. Quando la resistenza pipetta è aumentata di circa 1 MW, rimuovere la sovrapressione dalla pipetta durante l'applicazione di una aspirazione delicata, per formare la gigaseal fra la pipetta e la membrana cellulare (cioè, la resistenza misurata deve aumentare a valori superiori a 1 GΩ) .
- Applicare un potenziale negativo per la pipetta vicino alla cella di attesa potenziale di riposo (per HEK293 cella un potenziale di -40 mV possono essere utilizzati) per contribuire a stabilizzare la tenuta. Compensare i transitori capacitivi causa delle capacità di pipetta con i comandi relativi sull'amplificatore cerotto e / o il software di controllo patch.
- Rompere la membrana per consentire l'accesso elettrico al citoplasma cella applicando un impulso di breve e intensa aspirazionealla pipetta. Impostare l'amplificatore patch clamp modalità corrente (I = 0, cioè, senza corrente iniettata nella cellula) per monitorare il potenziale di membrana cellulare. Attendere pochi minuti per vedere se il potenziale cella è stabile.
- Applicare il protocollo illuminazione desiderata per la cella e registrare l'effetto sul potenziale di membrana.
Nota: L'illuminazione può essere consegnato al campione sia dal basso o dall'alto, a seconda dell'architettura microscopio.- Selezionare una lunghezza d'onda di eccitazione che viene ben assorbita dal materiale attivo; per il P3HT: PCBM miscela, una lunghezza d'onda nell'intervallo 450-600 nm può essere utilizzato. Densità photoexcitation adatti sono nell'intervallo 10-100 mW / mm 2.
Nota: impulsi brevi di luce (sotto 10-20 msec) risultato in una depolarizzazione transitoria della cellula, mentre con illuminazione prolungata (centinaia di millisecondi o impulsi più lunghi) una iperpolarizzazione sostenuta si osserva fino a quando la luce è spenta.
- Selezionare una lunghezza d'onda di eccitazione che viene ben assorbita dal materiale attivo; per il P3HT: PCBM miscela, una lunghezza d'onda nell'intervallo 450-600 nm può essere utilizzato. Densità photoexcitation adatti sono nell'intervallo 10-100 mW / mm 2.
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Representative Results
Le cellule possono essere facilmente coltivate su P3HT: substrati PCBM, a condizione che uno strato di adesione è depositato adatto (come la fibronectina utilizzato nel passaggio 3.2 del protocollo descritto). P3HT: PCBM picchi di assorbimento ottico nella parte verde dello spettro visibile; tuttavia altri polimeri coniugati fotosensibili possono essere selezionati, secondo la gamma d'onda fotostimolazione preferita (figura 2). Biocompatibilità di questi substrati è stata dimostrata non solo con linee cellulari 18,21 come HEK-293, ma anche con colture primarie di neuroni e astrociti 15 17 Una tipica micrografia di sani cellule HEK-293 coltivate su un P3HT:. PCBM pellicola è indicata in figura 3. stimolazione ottica di cellule mediata dai substrati fotoattivi può provocare effetti diversi sulla membrana cellulare, a seconda della durata dello stimolo luce. 18 Su dell'inizio della impulso luminoso, unspike veloce (con un'intensità di circa 3 mV e una durata di circa 1 msec) può essere osservato nelle registrazioni potenziali di membrana (Figura 4). Questo segnale è dovuta ad una carica capacitiva dell'interfaccia polimero / elettrolita e generazioni carica nel materiale attivo.
Dopo questo spiking veloce iniziale, una depolarizzazione transitoria (con un'intensità di circa 1 mV e una durata dell'ordine di decine di millisecondi) si osserva nella cella (Figura 4). Per brevi impulsi di luce, come la luce è spenta, un comportamento opposto si osserva. Questi segnali sono stati attribuiti a una variazione di capacità di membrana a causa del riscaldamento locale dopo assorbimento della luce.
Per illuminazione prolungata, tuttavia, la depolarizzazione iniziale durante gli impulsi di luce si trasforma in una iperpolarizzazione cellulare (Figura 5). Questo fenomeno ha unaacquisire una origine termica, ma in questo caso è relativo ad una variazione del potenziale di membrana di equilibrio a causa di un cambiamento nei canali ionici conducibilità indotte dalla temperatura aumentata.
Figura 1. Sketch del substrato fotoattivi. Le interfacce fotoattivi utilizzati per la stimolazione ottica a celle costituito da un film sottile di semiconduttori organici depositati su un substrato di vetro ITO rivestito. Le cellule possono essere coltivate direttamente sulla superficie del dispositivo dopo che è stato trattato con uno strato di adesione adeguato (ad es, fibronectina). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. assorbi zione spettri di differenti polimeri coniugati. L'uso di film sottili di semiconduttori organici possono consentire grande lunghezza d'onda di eccitazione in tunability mantenendo una trasparenza parziale del substrato. A titolo di esempio, gli spettri di assorbimento di differenti polimeri coniugati tipicamente utilizzata nel settore fotovoltaico sono segnalati. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. HEK-293 cellule coltivate su un substrato fotoattivo. Tipica micrografia di HEK-293 cellule coltivate sulla superficie di un substrato fotoattivo dopo 24 ore di incubazione. Barra della scala, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. stimolazione ottica di cellule HEK-293 con 20 impulsi luminosi msec. Variazione del potenziale di membrana di una cellula HEK-293 suscitato da un impulso 20 msec di luce. Un picco iniziale veloce sulla insorgenza della luce è seguita da una depolarizzazione della cella durante l'impulso. Come la luce è spenta, un comportamento opposto si osserva. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. stimolazione ottica di cellule HEK-293 con 200 impulsi luminosi msec. Variazione del potenziale di membrana di una cellula HEK-293 suscitato da un impulso di luce di 200 msec. La depolarizzazione iniziale osservato per breve illuminazione è solo un fenomeno transitorio, che, dopo poche decine di millisecondi di illuminazione prolungata si trasforma in una iperpolarizzazione della cellula. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici del protocollo riportato in vitro per stimolazione ottica di cellule riguardano principalmente la scelta del polimero fotosensibile, i parametri di sterilizzazione termica, l'intensità e la durata di stimoli luminosi. A P3HT: film sottile PCBM stato selezionato qui, dal momento che garantisce una buona stabilità temporale e elettrochimica. Tuttavia, si dovrebbe notare che non tutti i polimeri fotosensibili in grado di offrire prestazioni analogici, 22 più specificamente su illuminazione. Inoltre, in questo caso selezionata sterilizzazione termica parametri non portano alla degradazione considerevole delle caratteristiche optoelettronici polimero; nota, tuttavia, che, nel caso in cui si cambiano il metodo di sterilizzazione oi parametri di trattamento termico, i possibili effetti sulle proprietà del polimero deve essere attentamente valutato. È noto, per esempio, che l'esposizione UV porta rapidamente irreversibile sbianca polimero e degrado, a causa della perdita di coniugazione. Inoltre, ricottura diversotemperatura e durata possono comportare ordine diverso morfologica della superficie del polimero, con effetti negativi sulle proprietà di trasporto di carica elettrica. I parametri del protocollo fotoeccitazione devono essere attentamente valutati e: densità di eccitazione superiori a 100 mW / cm 2, e / o di stimoli prolungati, possono facilmente portare a degradazione del polimero e il fallimento del protocollo fotostimolazione. Un altro punto critico nel protocollo consiste nell'uso di uno strato proteina di adesione, a causa della elevata idrofobicità del P3HT: Superficie PCBM. Se no strato di adesione è impiegato nella realizzazione dell'interfaccia biopolimero, semina e proliferazione cellulare può essere seriamente compromessa.
Entro i passaggi critici suddetti e vincoli, tuttavia, il protocollo riportato può essere direttamente modificato, secondo le esigenze e gli obiettivi sperimentali specifici. Altri polimeri stabili fotosensibili possono essere trovati, 7 da vari comcommerciale fornitori o con la corretta sintesi di nuovi composti. Questo permette l'utilizzo di diverse lunghezze d'onda di eccitazione, che va dal blu al rosso e gamma NIR. Inoltre, la tecnica di deposizione del polimero non è limitato all'uso spin coating. Infatti, possono essere previsti altri metodi assicurando buona omogeneità e spessore del film adatto, come la stampa a getto d'inchiostro, rivestimento a spruzzo, o palettatura Gli effetti del prolungato contatto con i substrati di coltivazione della cellula e del metodo di sterilizzazione deve essere valutata per ogni nuovo materiale prendere in considerazione. Anche se è necessario l'uso di strati di adesione proteine per ottenere colture cellulari buone sopra le superfici polimeriche, l'uso specifico di fibronectina, come qui riportato, non è obbligatorio. Diversi strati di proteine di adesione possono essere utilizzati anche in conformità con la linea cellulare di crescere; 21 per esempio, le cellule neuronali sono generalmente coltivati su uno strato di poli-L-lisina. Infine, i protocolli di illuminazione possono essere modificati e adattati SPecific esigenze, in termini di lunghezza d'onda, formato di punto, densità di potenza di eccitazione, la durata stimoli tempo e frequenza, luce di senso incidenza (dal substrato o dal bagno elettrolitico). Come brevemente indicato sopra, tuttavia, la definizione dei parametri del protocollo dovrebbe tener conto della gamma polimero ottico assorbimento e possibili effetti di degradazione, che possono variare molto da caso a caso.
La limitata stabilità temporale e elettrochimica di alcuni polimeri fotosensibili effettivamente rappresenta i principali limiti della tecnica. Inoltre, l'uso di polimeri commerciali senza alcuna ulteriore purificazione può portare in alcuni casi ad ripetibilità limitato di risultati tra i diversi lotti di materiale, a causa di diversi gradi di purezza.
Notiamo anche che i meccanismi precisi alla base dell'effetto phototransduction nei protocolli CSPP ancora bisogno di essere ulteriormente chiarita e caratterizzati. Termica, ph elettrica e chimicaenomena sono eventualmente coinvolti, in misura diversa nei modelli biologici. Una comprensione completa sarà la chiave per sfruttare appieno la tecnica. In particolare, il verificarsi di fenomeni di calore mediata deve essere riesaminata come una limitazione della tecnica, poiché può essere difficilmente controllato, e può portare ad effetti surriscaldamento locale, in particolare nel caso di applicazioni in vivo. Una implementazione specifica del dispositivo, mira a controllare la diffusione del calore nell'ambiente extracellulare mediante appropriata ingegnerizzazione di percorsi calore conduttivo, potrebbe rivelare necessario nel prossimo futuro per il pieno sfruttamento della tecnica.
In letteratura, diverse tecniche che utilizzano impulsi ottici per la stimolazione temperatura mediata di cellule e tessuti, possono essere trovati sia in vitro e in vivo. In questi studi, l'assorbimento di raggi laser IR da acqua di solito è usato come un meccanismo di trasduzione. 23-25 Per quanto riguarda infrarossiStimolazione Neurale, il meccanismo CSPP presenta evidenti vantaggi, soprattutto per la sperimentazione in vitro. CSPP si basa sulla luce nella gamma visibile e di moderata intensità, in modo che la stimolazione può essere fornito dal percorso di eccitazione di un microscopio a fluorescenza standard. Al contrario, assorbimento d'acqua richiede lunghezze d'onda IR (principalmente intorno a 1,45 micron e 1,93 micron), che devono essere consegnati al campione tramite fonti esterne come le fibre ottiche micromanipolati in prossimità della preparazione, in quanto il treno ottico standard microscopio non può essere usato a tali lunghezze d'onda. Nel caso di CSPP, i modelli di luce ottenuti con sistemi di scansione laser e modulatori spaziali di luce possono essere accoppiati direttamente al treno ottico maggior microscopi. In questo modo, la fotostimolazione di substrati a base di semiconduttori organici può permettere di ottenere stimolazione più celle nel campo visivo indipendente, sia con un alto temporale risoluzione spaziale nd.
Un'altra alternativa di grande valore per la stimolazione ottica è offerto con metodi genetici, sulla base di espressione targeting di sonde geneticamente fotoattivabile nelle cellule. Optogenetics offre oggi risoluzione temporale e spaziale senza precedenti, con le tipiche intensità di illuminazione nella gamma di poche decine di mW / mm 2, possono entrambi eccitare e di inibire l'attività elettrica, e può essere geneticamente mirati per specifiche sotto-popolazioni di specifiche regioni cerebrali di interesse. Tuttavia, esso presenta ancora alcuni problemi che devono essere risolti. In particolare, problemi di sicurezza per quanto riguarda l'uso di virus per l'espressione genica, in particolare negli esseri umani, e il raggiungimento di lungo termine espressione stabile e controllato proteina eterologa rappresentano ancora le sfide principali. Tecnica CSPP permette di aggirare la necessità di trasferimento di geni, e tutti i problemi di sicurezza connessi, che sono particolarmente rilevanti per le applicazioni in-vivo.
jove_content "> Nel complesso, il metodo CSPP offre diversi vantaggi rispetto alle tecniche fotostimolazione endogeni. Poiché non è invasivo, può essere facilmente accoppiato a qualsiasi stazione di lavoro elettrofisiologico esistente e non richiede sorgenti laser complesse o transfezione genetica, mentre mantenendo alta selettività spaziale e temporale. Per queste ragioni, CSPP promette di diventare uno strumento complementare in neuroscienze in vitro indagini, e di aprire nuove prospettive nelle applicazioni in-vivo. Tuttavia, un grande sforzo da parte scienza dei materiali, fisica e ingegneria comunità è previsto nei prossimi anni, necessari per perfezionare, ottimizzare e sfruttare al massimo la tecnica.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
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