Introduction
De mogelijkheid om de cellulaire activiteit een nauwkeurige ruimtelijke en temporele resolutie manipuleren is een belangrijke strategie neurowetenschappelijk onderzoek en bij de behandeling van neurologische en psychiatrische stoornissen. 1 traditionele methoden berusten op elektrische stimulatie van cellen met behulp positioneringen nabijheid of in contact met het beoogde systeem 2 die kunnen van verschillende complexiteit (enkele cel, cellulair netwerk hersencoupes in-vivo hersenweefsel). Tijdens de afgelopen eeuw, hebben het gebruik van de patch-clamp, metaal en substraat geïntegreerde elektroden een gedetailleerd beeld van de fysiologie en pathofysiologie van enkele neuronen en van de werkingsmechanismen van neurale netwerken voorzien. Echter, elektrische stimulatie lijdt aan belangrijke beperkingen. De eerste heeft betrekking op een algemeen slechte ruimtelijke resolutie door de fysieke afmetingen van de elektroden en hun vaste geometrie, die niet gemakkelijk kan worden aangepastcomplexe bestuurde achtige biologische weefsels. Ook kunnen problemen met de elektroden impedantie en overspraak tussen stimulatie en opnamesystemen de uiteindelijke signaal-ruisverhouding van de meting afnemen. 3 Aan de andere kant kan het gebruik van licht voor het stimuleren helpen vele beperkingen te overwinnen van de elektrische benadering. Ten eerste biedt het ongekende ruimtelijke (<1 um) en temporele resolutie (<1 msec), waardoor specifieke celtypen of zelfs sub-celcompartimenten richten. Bovendien is sterk niet-invasief aangezien het vermijdt contact komen met het weefsel van belang en ontwart stimulatie van opname. Bovendien kunnen zowel lichtsterkte en de golflengte nauwkeurig worden geregeld en daarmee diverse stimulatie protocollen kunnen worden toegepast. 3,4
Echter, de meeste dierlijke cellen geen specifieke lichtgevoeligheid presenteren. Verschillende strategieën voor optische stimulation zijn dus voorgesteld, hetzij benutten lichtgevoelige moleculaire mediatoren nabij of binnen de cellen of middels fotoactieve extern apparaat geplaatst nabij de cel. De eerste categorie betreft endogene mechanismen zoals stimulatie via zichtbaar of infrarood (IR) licht, alsmede het gebruik van hetzij fotoisomeriseerbare / splitsbare verbindingen of de genetische expressie van lichtgevoelige moleculaire actuators (optogenetics). De laatste klasse omvat technieken exogene stimulering bereikt met het gebruik van anorganische nano / micro-deeltjes of fotogeleidende siliciumsubstraten. 5 Desalniettemin, al deze systemen lichte kanten en nadelen. Vooral endogene opname van cellen in het zichtbare gebied zwak en onbetrouwbaar, en de gelijktijdige vorming van reactieve zuurstofsoorten kan schadelijk zijn voor de cel. In het algemeen wordt IR gebruikt voor het induceren van lokale thermische opwarming door waterabsorptie, maar de extinctiecoëfficiënt van water klein is, waardoor het nodig strong infrarood licht (van tientallen tot honderden W / mm 2) dat moeilijk te leveren via standaardmicroscoop optica en kunnen veiligheidsoverwegingen in vivo toepassingen opleveren. Anderzijds, foto-schakelbare kooien verbindingen hebben een tijd beperkte werking en vereisen vaak UV licht dat moeilijk te leveren als gevolg van beperkte weefselpenetratie. Verder zij lijden aan diffusieprobleem van de geactiveerde verbindingen bij fotolyse buiten de verlichte zone. Tenslotte hebben optogenetic hulpmiddelen mogen wetenschappers subpopulatie specifieke cellulaire en sub-compartimenten targeten en worden sterk opkomende als een van de belangrijkste technologieën neurowetenschappelijk onderzoek. Echter, het inbrengen van een exogeen DNA-segment via een virale vector roept belangrijke veiligheidskwesties, met name met het oog op goedkeuring op menselijke patiënten. 5,6 Om deze redenen, onderzoek naar nieuwe materialen en apparaten staat cel optische manipulatie is een zeer hot topic.
Onlangs is een nieuwaanpak gebaseerd op het gebruik van lichtgevoelige geconjugeerde polymeren, efficiënt kunnen transduceren optische stimulus in een modulatie van cel elektrische activiteit, is voorgesteld. De cel stimulatie door Polymer fotoexcitatie (CSPP) techniek maakt gebruik van een groot aantal key-enabling typische kenmerken van organische halfgeleiders: ze zijn intrinsiek gevoelig voor licht in het zichtbare gebied, 7 ze zijn biocompatibel, zacht en gelijkvormig en hun mechanische flexibiliteit maakt een intieme-interface met weefsel zowel in-vitro en in-vivo 8-10. Daarnaast, kunnen zij gemakkelijk worden gefunctionaliseerd om beter aan te passen aan de interface met levende cellen en specifieke excitatie schakelen indringende en sensing capaciteiten. 11,12 Bovendien ondersteunen zij zowel elektronische als ionentransport, waardoor ze ideaal voor de combinatie Elektronica ad biologie. 13,14 Interessant is dat ze werken in fotovoltaïsche modus, het vermijden van de noodzaak een extern voorspanning f toepassingof efficiënte cel optische stimulatie. 15
De betrouwbaarheid van CSPP techniek is eerder aangetoond in diverse systemen, waaronder primaire neuronen, 15,16 astrocyten, 17 secundaire cellijnen 18 en geëxplanteerd netvlies weefsels. 16 In dit werk, alle stappen die nodig zijn om een lichtgevoelige bio-polymeer fabriceren -interface 19 voor optische stimulatie van in vitro-systemen worden beschreven. Als een studie geval een prototypische organische fotovoltaïsche mix van regio-reguliere poly (3-hexylthiophene) (rr-P3HT), functioneren als het elektron donor, en fenyl-C61-boterzuur-zuur-methyl ester (PCBM), als de elektronenacceptor wordt toegepast. Als het biologische systeem, zijn humane embryonale nier (HEK-293) cellen gebruikt. Een voorbeeld van een fotostimulering protocol met de relatieve opname van celactiviteit via elektrofysiologische metingen wordt geleverd.
De beschreven platformechter algemene geldigheid, en kan gemakkelijk worden uitgebreid naar het gebruik van andere geconjugeerde polymeren (door juiste instelling van de oplossing voorbereidingsproces en de depositie parameters), verschillende celtypen (door naar behoren het veranderen van de celkweek protocol, plating procedure en de gevraagde voor mobiele zaaien en proliferatie) en verschillende stimulatie protocollen (licht golflengte, stimuli frequentie en duur, foto-excitatie dichtheid).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Fotoactieve Substrates
- Bereid een P3HT: PCBM oplossing (1: 1 w / w) in chloorbenzeen bij een P3HT concentratie van 20 g / l. Meng de oplossing met een magnetische roerder gedurende ten minste 4 uur bij 60 ° C. Beschouw een volume van 150 ul oplossing voor elk substraat te bereiden.
- Clean-ITO beklede objectglaasjes (Rs = 10 Ω / vierkant, 18x18 mm 2, dikte 170 pm) met opeenvolgende baden gedeïoniseerd water, aceton en isopropanol in een sonicator (10 min voor elke stap). Droog de dekglaasjes met een stikstof pistool. Doe de monsters in een plasma cleaner bij 100 W vermogen gedurende 10 min.
- Deponeren van een dunne film van de actieve laag op de gereinigde substraten via spin-coating.
- Met een diamantpunt, snijd een microscoop glasplaatje, (≈ dikte 1 mm) aan dezelfde laterale afmetingen van de ITO-beklede substraten. Verwijder de P3HT: PCBM oplossing van de verwarmingsplaat en laat het afkoelen tot omgevingstemperatuur.
- Stel een twee-steps spin-coater programma: i) 30 sec bij 800 rpm; ii) 30 sec bij 1600 rpm. Plaats de dia op de boorkop van de spin-coater en start de stofzuiger om het te repareren. Een druppel van aceton op de dia en het gereinigde substraat met de ITO-gecoate zijde naar boven. Start de spin-coater draaien om zich te ontdoen van de overtollige aceton.
- Put 150 ui P3HT: PCBM oplossing op de substraten en opnieuw beginnen de spin-coater (hetzelfde protocol in 1.3.2).
- Na de spin-coater is voltooid, verwijdert u het monster en voorzichtig los te maken van de gecoate substraat van het glaasje. Reinig de achterkant van het substraat met een cleanroom doekje gedrenkt in aceton.
Opmerking: De fotoactieve substraten kunnen worden bewaard paar dagen in een donkere doos tot gebruik. Voor langere periodes, bewaar ze in een dashboardkastje met een inert gas.
2. Voorbereiding van celcultuurmedium en Elektrofysiologie Solutions
- Bereid de volledige groeimedium (CGM) voorHEK-293-cellen: Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) niet warmte geïnactiveerd, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Steriliseer het medium met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid de extracellulaire oplossing in ultrapuur water (concentraties in mm): 135 NaCl, 5,4 KCl, 5 HEPES, 10 Glucose, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtratie en bewaar bij 4 ° C.
- Bereid de intracellulaire oplossing in ultrazuiver water (concentraties in mM): 12 KCl, 125 K-gluconaat, 1 MgCl2, 0,1 CaCl2, 10 EGTA, 10 HEPES, 10 ATP-Na2. Merk op dat ATP-Na 2 is warmtegevoelig en voeg deze laatste. Stel de pH tot 7,4 met NaOH. Steriliseer de oplossing met een 0,2 urn filtersysteem, aliquot in 1 ml buizen en bewaar bij -20 ° C.
3. Plating HEK-293 cellende actieve substraten
- Plaats de fotoactieve substraat in een glazen beker bedekt met aluminium of een afgesloten petrischaal en in een oven bij 120 ° C gedurende 2 uur voor sterilisatie. Vanaf dit moment, voeren alle bewerkingen in steriele omstandigheden. Zet de monsters in een steriele kap en laat ze afkoelen.
- Coat de fotoactieve substraat een hechtlaag aan het oppervlak hydrofobiciteit verminderen en celadhesie bevorderen.
- Plaats de actieve substraten in een P35 petrischaal of een 6 multiwell plaat. Gezien de hydrofobiciteit van het geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaan (PDMS) en het monster vast en beperken de oplossingen.
- Meng PDMS en katalysator in een 10: 1 verhouding met een glazen staaf naar een viskeuze slurry te verkrijgen.
- Giet de slurry in een 6 multiwell plaat, het afgeven van een hoeveelheid die voldoende is om de helft van iedere afdekken.
- Wacht PDMS polymerisatie bij kamertemperatuur.
- Snijd de uitgeharde PDMS in het midden voor obtaining een vierkante vorm van dezelfde afmeting van het polymeer monster.
- Steriliseer de PDMS putten door onderdompeling in een 70% ethanol-water mengsel gedurende tenminste 30 minuten.
- Bij gebruik van de PDMS goed, krassen op de fotoactieve laag langs de gehele rand van de put met spitse pincet, zodat losraken van de gehele laag te voorkomen bij het verwijderen van PDMS lang na celkweek.
- Bedek het gehele oppervlak van elk monster met een fibronectine-oplossing (2 mg / l in PBS). Een volume tussen 500-750 ul per monster is meestal voldoende als een PDMS goed wordt gebruikt (helder oppervlak van de put: 15x15 mm 2). Zonder de PDMS goed, ongeveer 2 ml van fibronectine oplossing nodig is om het monster volledig ondergedompeld zijn; let dat de ondergrond niet zweven, terwijl het toevoegen van de oplossing. Incubeer de monsters bij 37 ° C gedurende tenminste 1 uur.
- Verwijder de fibronectine-oplossing met een glazen pipet en eenmaal wassen met 2 ml PBS.
- Plaats de actieve substraten in een P35 petrischaal of een 6 multiwell plaat. Gezien de hydrofobiciteit van het geconjugeerde polymeerlaag, maak een polydimethylsiloxaan (PDMS) en het monster vast en beperken de oplossingen.
- Plat HEK-293-cellen op de fibronectine-behandelde monsters bij een dichtheid van 15.000 cellen / cm2 in compleet groeimedium. Gebruik een volume van 750-1000 pl van CGM voor elk monster als een PDMS goed gebruikt, anders 2-3 ml CGM nodig. Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24-48 uur.
4. Optische Stimulatie Protocol en elektrofysiologische metingen
- Zet de extracellulaire oplossing in een waterbad bij 37 ° C te thermaliseren; dooi de intracellulaire oplossing, zet het in een 1 ml spuit met een 34 gauge naald en houd het in contact komt met ijs om degradatie van de ATP te voorkomen.
- Neem een cel-gecoate substraat uit de incubator, zorgvuldig verwijderen van de PDMS goed indien aanwezig. Verwijder het groeimedium met een glazen pipet en spoel het monster met extracellulaire oplossing. Overgaan langzaam naar cel onthechting te voorkomen.
- Zet het apparaat in de monster-houder van de elektrofysiologie station met extracellulaire solution en de referentie-elektrode. Bereid vers glas micropipetten voor patch-klem met een trekker (ideaal weerstand in het bereik 2-4 MQ). Vul de helft van de pipet met intracellulaire oplossing en monteren op de micromanipulator.
- Kijk voor een gezonde cel te patchen op het apparaat. Om ongewenste excitatie van de fotoactieve substraat te voorkomen, gebruikt IR verlichting voor beeldvorming, het plaatsen van een lange-golflengte doorlaatfilter (bijvoorbeeld een cut golflengte λ = 750 nm worden gebruikt voor polymeren absorberen in het zichtbare) voor de microscoop belichtingstoestel.
- Patch de geselecteerde cel en het gewenste protocol voor optische stimulatie toepassing leveren licht op het monster via de fluorescentie excitatie weg van de microscoop (Figuur 1). Een gedetailleerde beschrijving van de patch-clamp-protocol is te vinden in referentie 20.
- Plaats de patch pipet in de nabijheid van het celmembraan een micrometrische manipulator. Tijdens het positioneren van toepassing overpressure de pipet om vuil kleven aan het uiteinde te voorkomen. De pipet moet enkele microns boven de cel.
- Start verlagen van de pipet naar het celmembraan, terwijl het regelen van de pipet weerstand op de patch besturingssoftware. Wanneer de pipet weerstand van 1 MQ is toegenomen, verwijdert de overdruk uit de pipet onder toepassing van een zachte zuiging, om de gigaseal tussen de pipet en het celmembraan te vormen (dat wil zeggen de gemeten weerstand moet toenemen met waarden groter dan 1 GQ) .
- Breng een negatieve potentiaal op de pipet dicht bij de verwachte cel rustpotentiaal (voor HEK293 cel een potentiaal van -40 mV worden gebruikt) om de afdichting te stabiliseren. Compenseren capacitieve transiënten vanwege de pipet capaciteit met relatief opdrachten op de patch versterker en / of de pleister besturingssoftware.
- Breek het membraan elektrisch toegang tot het cytoplasma toe door een korte, intense afzuiging pulsede pipet. Stel de patch clamp versterker actuele stand (I = 0, dat wil zeggen zonder stroom geïnjecteerd in de cel) het celmembraanpotentiaal volgen. Wacht enkele minuten om te zien of de celpotentiaal stabiel.
- Breng de gewenste belichting protocol naar de cel en neem het effect op de membraanpotentiaal.
Opmerking: De verlichting kan worden afgegeven aan het monster ofwel van onderen of van boven, afhankelijk van de microscoop architectuur.- Selecteer een excitatiegolflengte die goed wordt geabsorbeerd door het actieve materiaal; de P3HT: PCBM mengsel, kan een golflengte 450-600 nm worden gebruikt. Geschikte foto-excitatie dichtheden in het bereik van 10-100 mW / mm2.
Opmerking: Korte lichtpulsen (hierna 10-20 msec) leiden tot een tijdelijke depolarisatie van de cel, terwijl bij langdurige belichting (honderden milliseconden of meer pulsen) een aanhoudende hyperpolarisatie wordt waargenomen tot het licht wordt uitgeschakeld.
- Selecteer een excitatiegolflengte die goed wordt geabsorbeerd door het actieve materiaal; de P3HT: PCBM mengsel, kan een golflengte 450-600 nm worden gebruikt. Geschikte foto-excitatie dichtheden in het bereik van 10-100 mW / mm2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellen kunnen eenvoudig worden gekweekt op P3HT: PCBM substraten, mits er een geschikte hechtlaag is aangebracht (zoals fibronectine gebruikt in stap 3.2 van de beschreven protocol). P3HT: PCBM optische absorptie pieken in het groene deel van het zichtbare spectrum; maar andere lichtgevoelige geconjugeerde polymeren kunnen worden geselecteerd volgens de gewenste fotostimule- golflengte bereik (figuur 2). Biocompatibiliteit van deze substraten is aangetoond niet alleen cellijnen 18,21 zoals HEK-293, maar ook met primaire kweken van neuronen en astrocyten 17 15 Een typische microfoto van gezonde HEK-293-cellen gekweekt op een P3HT. PCBM film weergegeven figuur 3. Optische stimulatie van cellen gemedieerd door de fotoactieve substraten kan resulteren in verschillende effecten op het celmembraan, afhankelijk van de duur van het licht stimulus. 18 Bij het begin van de lichtpuls, eenfast spike (met een intensiteit van ongeveer 3 mV en een tijdsduur van ongeveer 1 msec) kunnen worden waargenomen in de celmembraanpotentiaal opnamen (figuur 4). Dit signaal wordt door een capacitieve lading van het polymeer / elektrolyt-interface op lading opwekkende in het actieve materiaal.
Na deze snelle spiking, wordt een tijdelijke depolarisatie (met een intensiteit van ongeveer 1 mV en een tijdsduur in de orde van tientallen milliseconden) waargenomen in de cel (figuur 4). Voor korte pulsen van licht, als het licht wordt uitgeschakeld, wordt een tegengesteld gedrag waargenomen. Deze signalen zijn toegeschreven aan een wijziging in membraancapaciteit vanwege lokale verwarming volgens lichtabsorptie.
Voor langdurige verlichting, maar de initiële depolarisatie tijdens de lichtpulsen verandert in een cel hyperpolarisatie (figuur 5). Dit fenomeen heeft eenwint een thermische oorsprong, maar in dit geval heeft betrekking op een variant van het membraan evenwichtspotentiaal gevolg van een verandering in de ionkanalen geleidbaarheden geïnduceerd door de verhoogde temperatuur.
Figuur 1. Schets van de fotoactieve substraat. De fotoactieve interfaces voor cellulaire optische stimulatie bestaan uit een dunne film van organische halfgeleiders afgezet op een ITO-gecoate glassubstraat. Cellen kunnen direct worden geteeld op het apparaat oppervlak nadat deze is behandeld met een geschikte hechtlaag (bijvoorbeeld fibronectine). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. absorp tie spectra van verschillende geconjugeerde polymeren. Het gebruik van dunne films van organische halfgeleiders kunnen grote tunability in excitatiegolflengte toe met behoud van een gedeeltelijke transparantie van het substraat. Als een voorbeeld, de absorptie spectra van verschillende geconjugeerde polymeren doorgaans gebruikt in fotovoltaïsche worden gemeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. HEK-293-cellen gekweekt op een fotoactieve substraat. Typische microfoto van HEK-293-cellen gekweekt op het oppervlak van een fotoactieve substraat na 24 uur incubatie. Schaal bar, 20 urn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Optische stimulatie van HEK-293-cellen met 20 msec lichtpulsen. Variatie van het membraan potentieel van een HEK-293 cellen opgewekt door een 20 msec lichtpuls. Een initiële snelle piek bij het begin van het licht wordt gevolgd door een depolarisatie van de cel tijdens de puls. Als het licht wordt uitgeschakeld, een tegengesteld gedrag wordt waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Optische stimulatie van HEK-293-cellen met 200 msec lichtpulsen. Variatie in het membraan potentieel van een HEK-293 cellen opgewekt door een 200 msec lichtpuls. De initiële depolarisatie waargenomen voor korte Illumminatie is slechts een voorbijgaand verschijnsel, dat na enkele tientallen milliseconden van langdurige verlichting verandert in een hyperpolarisatie van de cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritische stappen van de gerapporteerde protocol voor in-vitro optische stimulatie van cellen voornamelijk betrekking op de keuze van de lichtgevoelige polymeer, de thermische sterilisatie parameters, de intensiteit en de duur van het licht stimuli. Een P3HT: PCBM dunne film werd hier gekozen, omdat het garandeert een goede tijd en elektrochemische stabiliteit. Echter, men moet opmerken dat niet alle lichtgevoelige polymeren analoge optredens meer specifiek kan bieden, 22 bij belichting. Bovendien, in casu geselecteerde thermische sterilisatie parameters niet leidt tot aanzienlijke afbraak van het polymeer opto-elektronische elementen; mededeling evenwel dat, indien de sterilisatiewerkwijze of thermische behandeling parameters worden gewijzigd, mogelijke effecten op de polymeereigenschappen zorgvuldig worden geëvalueerd. Het is bijvoorbeeld bekend dat UV-blootstelling snel leidt tot onomkeerbare polymeer bleken en degradatie vanwege conjugatie verlies. Voorts verschillende annealingtemperaturen en duur kan leiden tot verschillende morfologische orde van het polymeer oppervlak, met negatieve gevolgen voor de elektrische lading transport eigenschappen. De parameters van de foto-excitatie protocol zorgvuldig ook worden geëvalueerd: excitatie dichtheden boven 100 mW / cm 2, en / of langdurige stimuli, kan gemakkelijk leiden tot polymeerafbraak en het falen van de fotostimulering protocol. Een andere belangrijke stap in het protocol bestaat in het gebruik van een eiwit hechtlaag, vanwege de hoge mate van hydrofobiciteit P3HT: PCBM oppervlak. Indien geen hechtlaag wordt in de realisatie van het biopolymeer interface cell seeding en proliferatie ernstig zou kunnen worden aangetast.
Binnen de hierboven genoemde kritische stappen en beperkingen echter de gerapporteerde protocol kan worden gemodificeerd rechtlijnig, volgens de specifieke experimentele behoeften en doelstellingen. Andere stabiele, lichtgevoelige polymeren kunnen worden gevonden, 7 uit verschillende comcommerciële leveranciers of door goed te synthetiseren nieuwe verbindingen. Dit maakt het gebruik van verschillende golflengten, variërend van blauwe tot de rode en NIR bereik. Bovendien wordt het polymeer depositietechniek niet beperkt tot het spincoaten gebruikt. Inderdaad, kunnen andere werkwijzen zorgen voor goede homogeniteit en geschikte filmdikte worden overwogen, zoals inkt-jet printen, sproeicoating of schoepen de effecten van langdurige blootstelling aan het cel groeimedia en de sterilisatiemethode worden geëvalueerd voor elk nieuw materiaal in overweging genomen. Hoewel het gebruik van eiwithechting lagen moeten goede celkweken verkrijgen bovenop de polymeeroppervlakken, het specifieke gebruik van fibronectine, zoals hier vermeld, is niet verplicht. Verschillende adhesieproteïne lagen kunnen worden toegepast, eveneens overeenkomstig de cellijn te kweken, bijvoorbeeld 21, neuronale cellen gewoonlijk gekweekt op een poly-L-lysine layer. Tenslotte kan de verlichting protocollen worden veranderd en aangepast specifieke behoeften qua golflengte vlekgrootte, stroom excitatie dichtheid tijd stimuli en -frequentie, lichtinval richting (van het substraat of van het elektrolytbad). Zoals kort hierboven vermeld, kan de definitie van de protocolparameters moet rekening worden gehouden met de polymere optische absorptiegebied en mogelijke degradatie-effecten, die veel kan van geval tot geval.
De beperkte tijd en elektrochemische stabiliteit van een aantal lichtgevoelige polymeren vertegenwoordigt eigenlijk de belangrijkste beperkingen van de techniek. Bovendien kan gebruik van commerciële polymeren zonder verdere zuivering leiden in bepaalde gevallen beperkte herhaalbaarheid van resultaten tussen verschillende batches van het materiaal, door ander zuiverheidsgraad.
We merken ook dat de precieze mechanismen aan de basis van de fototransductiecascade effect CSPP protocollen moeten nog verder worden opgehelderd en gekarakteriseerd. Thermische, elektrische en chemische phenomena zijn mogelijk betrokken bij verschillende mate in verschillende biologische modellen. Een volledig begrip zal de sleutel tot de techniek ten volle te benutten zijn. Met name het optreden van warmte-gemedieerde verschijnselen dient in het bijzonder bij toepassing in vivo beoordeeld als een beperking van de techniek, aangezien het moeilijk kan worden gecontroleerd, en kan leiden tot plaatselijke oververhitting effecten. Een specifieke implementatie van de inrichting, gericht op het beheersen van de warmte diffusie in de extracellulaire omgeving door de juiste techniek van warmte-geleidende paden kunnen in de nabije toekomst nodig blijkt voor de volledige benutting van de techniek.
In de literatuur verschillende technieken die optische pulsen temperatuur gemedieerde stimulatie van cellen en weefsels te gebruiken, zowel in vitro als in vivo te vinden. In deze onderzoeken werd de absorptie van infrarood laserstralen door water meestal gebruikt als een transductiemechanisme. 23-25 Wat InfraredZenuwstimulatie, de CSPP mechanisme heeft duidelijke voordelen, in het bijzonder voor in vitro experimenten. CSPP op basis van licht in het zichtbare gebied en matige intensiteit, zodat de stimulatie kan worden geleverd door het excitatiepad een standaard fluorescentiemicroscoop. Integendeel, wateropname vereist golflengten in het IR (vooral rond 1,45 pm en 1,93 pm), die moeten via externe bronnen zoals optische vezels micromanipulated in de nabijheid van het preparaat het monster te leveren, aangezien de optische keten van een standaard microscoop kan niet worden gebruik bij dergelijke golflengtes. Bij CSPP, kan de lichtpatronen verkrijgbaar laser scanning systemen en de ruimtelijke lichtmodulatoren direct gekoppeld worden aan de optische keten van de meeste microscopen. Op deze wijze kan de fotostimulering van substraten op basis van organische halfgeleiders u vaak stimulatie van verschillende cellen te verkrijgen in het gezichtsveld onafhankelijk met zowel een hoge temporele nd ruimtelijke resolutie.
Een ander zeer waardevol alternatief voor optische stimulatie wordt aangeboden door genetische werkwijzen, gebaseerd op richtbare expressie van genetisch activeerbare probes in cellen. Optogenetics biedt tegenwoordig ongekende temporele en ruimtelijke resolutie, met typische verlichting intensiteiten in het bereik van enkele tientallen mW / mm2, kan zowel prikkelen en remmen elektrische activiteit en kunnen genetisch worden gericht op specifieke subpopulaties van specifieke hersengebieden plaats. Echter, het nog steeds presenteert een aantal problemen die moeten worden opgelost. Vooral veiligheidszorgen betreffende het gebruik van virussen voor genexpressie, met name bij mensen en het bereiken van stabiele en gecontroleerde langdurige heteroloog eiwitexpressie vormen nog steeds de belangrijkste uitdagingen. CSPP techniek maakt de noodzaak van genoverdracht, en alle gerelateerde veiligheidsproblemen die bijzonder relevant voor in vivo toepassingen te omzeilen.
jove_content "> Al met al is de CSPP methode biedt verschillende voordelen ten opzichte van endogene fotostimulatie technieken. Aangezien het niet invasief, kan het gemakkelijk worden gekoppeld met bestaande elektrofysiologische werkstation en niet complex laserbronnen of genetische transfectie vereisen, terwijl handhaven van hoge ruimtelijke en temporele selectiviteit. Daarom CSPP houdt belofte een aanvullend instrument in neurologie in vitro onderzoeken worden en nieuwe perspectieven in in vivo toepassingen. Echter, een grote inspanning van de materiaalkunde, natuurkunde en techniek gemeenschappen wordt verwacht in de komende jaren, die nodig zijn om te verfijnen, optimaliseren en de techniek volledig te benutten.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| rr-P3HT | Sigma Aldrich | 698989-5G | |
| ITO-coated substrates | Nano-CS | IT10300100 | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| chlorobenzene | Sigma Aldrich | 319996 | |
| PCBM | Nano-C | Nano-CPCBM-BF | |
| acetone | Sigma Aldrich | 270725 | |
| isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 563935 | |
| HEK cells | LGC standards srl | ATCC-CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H0887 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P5244 | |
| E-MEM | LGC standards srl | ATCC-30-2003 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E8008- | |
| FBS | LGC standards srl | ATCC-30-2020 |
References
- Alivisatos, A. P., et al. Nanotools for Neuroscience and Brain Activity Mapping. ACS Nano. 7 (3), 1850-1866 (2013).
- Spira, M. E., Hai, A. Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology. Nat. Nanotechnol. 8 (2), 83-94 (2013).
- Scanziani, M., Häusser, M. Electrophysiology in the age of light. Nature. 461 (7266), 930-939 (2009).
- Bareket-Keren, L., Hanein, Y. Novel interfaces for light directed neuronal stimulation: advances and challenges. Int. J. Nanomed. 9 (1), 65-83 (2014).
- Antognazza, M. R., et al. Shedding Light on Living Cells. Adv. Mater. , (2014).
- Martino, N., Ghezzi, D., Benfenati, F., Lanzani, G., Antognazza, M. R. Organic semiconductors for artificial vision. J. Mater. Chem. B. 1 (31), 3768-3780 (2013).
- Antognazza, M. R., Scherf, U., Monti, P., Lanzani, G. Organic-based tristimuli colorimeter. Appl. Phys. Lett. 90 (16), 163509 (2007).
- Liao, C., Zhang, M., Yao, M. Y., Hua, T., Li, L., Yan, F. Flexible Organic Electronics in Biology: Materials and Devices. Adv. Mater. , (2014).
- Khodagholy, D., et al. NeuroGrid: recording action potentials from the surface of the brain. Nat. Neurosci. 18 (2), 310-315 (2015).
- Campana, A., et al. Electrocardiographic Recording with Conformable Organic Electrochemical Transistor Fabricated on Resorbable Bioscaffold. Adv. Mater. 26 (23), 3874-3878 (2014).
- Bonetti, S., et al. A Lysinated Thiophene-Based Semiconductor as a Multifunctional Neural Bioorganic Interface. Adv. Healthc. Mater. , (2015).
- Benfenati, V., et al. A transparent organic transistor structure for bidirectional stimulation and recording of primary neurons. Nat. Mater. 12 (7), 672-680 (2013).
- Rivnay, J., Owens, R. M., Malliaras, G. G. The Rise of Organic Bioelectronics. Chem. Mater. 26 (1), 679-685 (2014).
- Pires, F., et al. Neural stem cell differentiation by electrical stimulation using a cross-linked PEDOT substrate: Expanding the use of biocompatible conjugated conductive polymers for neural tissue engineering. BBA-Gen. Subjects. 1850 (6), 1158-1168 (2015).
- Ghezzi, D., et al. A hybrid bioorganic interface for neuronal photoactivation. Nat. Commun. 2 (166), 1-7 (2011).
- Ghezzi, D., et al. A polymer optoelectronic interface restores light sensitivity in blind rat retinas. Nat. Photonics. 7 (5), 400-406 (2013).
- Benfenati, V., et al. Photostimulation of Whole-Cell Conductance in Primary Rat Neocortical Astrocytes Mediated by Organic Semiconducting Thin Films. Adv. Healthc. Mater. 3 (3), 392-399 (2014).
- Martino, N., et al. Photothermal cellular stimulation in functional bio-polymer interfaces. Sci. Rep. 5 (8911), (2015).
- Antognazza, M. R., Ghezzi, D., Musitelli, D., Garbugli, M., Lanzani, G. A hybrid solid-liquid polymer photodiode for the bioenvironment. Appl. Phys. Lett. 94 (24), 243501 (2009).
- Essentials of Neuroscience. Patch Clamp Electrophysiology. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2015).
- Scarpa, G., Idzko, A. L., Götz, S., Thalhammer, S. Biocompatibility Studies of Functionalized Regioregular Poly(3-hexylthiophene) Layers for Sensing Applications. Macromol. Biosci. 10 (4), 378-383 (2010).
- Bellani, S., et al. Reversible P3HT/Oxygen Charge Transfer Complex Identification in Thin Films Exposed to Direct Contact with Water. J. Phys. Chem. C. 118 (12), 6291-6299 (2014).
- Wells, J., et al. Optical stimulation of neural tissue in vivo. Opt. Lett. 30 (5), 504-506 (2005).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), 1-10 (2012).
- Duke, A. R., et al. Transient and selective suppression of neural activity with infrared light. Sci. Rep. 3 (2600), 1-8 (2013).
