Introduction
İki foton mikroskopi yaşayan ve hayvanları davrandığını beyin aktivitesinin gözlem devrim. 1990 yılında piyasaya sunulmasından bu yana hızla popülerlik kazanmıştır ve şimdi in vivo 1,2 beyin aktivitesinin birçok yönleriyle incelenmesi yönünde en ilginç ve yenilikçi yaklaşımlarından biri olarak uygulanır. Bu uygulamalar ve nöronal hücrelerin morfolojisi (kalsiyum seviyesi göstergeleri veya erken genler ifade kullanarak, örneğin) kan akım ölçümleri, nöronal aktivasyon dahildir. Laboratuvarların sayısı giderek artıyor in vivo beyin görüntüleme için yeni bir standart olarak bilimsel dünyada tekniği uygulayan, iki foton mikroskopları kullanın.
Standart yaklaşım kafatası pencere implantasyon varil ya da fare beyninin 3 görsel korteks üzerinde (bir kapak camı ile kapatılmış kafatasına bir yuvarlak delik) içerir. Daha sonra, deney protokolüne göre, MMse zaman 4,5 üzerinde beyin aktivitesi ve nöronal morfoloji değişiklikleri izlemek için izin, görselleştirme ve davranışsal eğitim oturumları bir dizi uğrar. Her iki durumda da kraniyotomi sadece sütürler geçmeden, parietal kemik etkiler. Büyük ölçüde tekniğin başlıca dezavantajı, bu tür hazne ya da görsel korteksin kolayca erişilebilir korteks için sınırlı bir uygulama olduğuna inanılmaktadır. diğer bölgelere göre kraniyal pencere implantasyonu nedeniyle aşırı kanama ve / veya uzaysal engel için, zorluklar bir çok oluşturmaktadır.
Bu yazıda in vivo mikroskopi 6 iki-foton ilgi başka bir olası bölge olarak retrosplenial korteks (RSC) Yukarıdaki kraniyal pencere implantasyonu öneriyoruz. RSC uzaysal oluşumundan sorumlu beyin devresinin önemli bir unsurdur. Anatomik, RSC kortikal, hipokampal ve talamik bölgeleri 7 bağlayan bir nöronal ağın bir parçasıdır. Buağır gibi uzamsal öğrenme ve nesli yanı sıra mekansal navigasyon 6 gibi davranışların, bir dizi çıkıyor.
Nöronların morfolojik değişikliklerini görselleştirmek için biz Thy1 promoteri altında yeşil floresan protein (GFP) eksprese eden bir transgenik fare hattı kullanır. Bu farelerde, GFP iki foton mikroskopi 8 kullanarak kortikal akson ve dendritler net görüntülenmesi için izin beyindeki nöronların yaklaşık% 10 olarak ifade edilir. Biz teklif Başka bir yenilik RSC projelendirme beynin derin yapılara bir nöron spesifik CaMKII promotör 9 altında kırmızı floresan proteini (mCherry) kodlama bir rekombinant adeno-ilişkili virüs serotipi 2/1 (/ 1 RAAV2) enjekte edilmesidir hipokamp gibi. Thy1-GFP fare hipokampusunda rAAV2 / 1 mCherry sentezleme Hippocampo-cortica öncesi ve postsinaptik elemanlarının aynı anda görüntülenmesi sağlarl 10 sinapsların. Protein aksonal terminallerde yeterli düzeyde ulaşmasını mCherry rAAV güdümlü ifade iki ila üç hafta gerektirir. Bu süre Kraniotomi kurtarma için gerekli her zamanki saatinde ile tutarlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm deneysel prosedürleri Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü, Polonya Bilimler Akademisi Yerel Etik Kurulu tarafından kabul edildi.
Not: ilişkili videoda bazı sahneler hızlanır. Hız faktörü bu sahneler gösterilir.
1. Cerrahi Hazırlık
- otoklav sıvıların ve pamuklu için tüm araçları, cam kapları sterilize. vazgeçilebilir eldiven kullanın. Cerrahi tablo, stereotaksik çerçeve ve% 70 etanol ile tüm çevresi temizleyin. tüm sterilize ekipmanlar için steril bir alan yaratmak için steril cerrahi takımını kullanın. Küçük parçalar halinde gelfoam kesin ve steril tuzlu su içinde bekletin.
Not: Laboratuvar Hayvanları Bakım ve Kullanım Kılavuzu göre, etanol sterilant ne de üst düzey dezenfektan ne olduğunu. Sadece daha önceden sterilize edilmiş yüzeyler üzerinde bir temizleme / yağ ayırma maddesi olarak kullanılır. - th hayvan koymake indüksiyon odası ve / dk 2 L% 5 izofluran seviyesini ve oksijen akışını ayarlayın. Bu işlem yaklaşık 3 dakika sürer.
- indüksiyon odasının dışında hayvan alın. Hayvan tamamen uyuşturulmuş sağlamak amacıyla kuyruk ya da ayak Kıstırmaları kullanın.
- kesin bir düzeltici gözlerine kadar (kulak arası) başın arka saç tıraş kullanma.
- stereotaksik çerçeve hayvan koyun ve kulak çubukları ile baş stabilize.
- % 1.5-2 izofluran ve 0.3 L / dk oksijen anestezi seviyelerini ayarlayın.
- göz merhemi sürün.
- sırasıyla, iltihap, ağrı ve enfeksiyonu önlemek için Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) ve Baytril (5 mg / kg) ile, hayvan deri altına enjekte edilir.
- Beyin şişmesini önlemek Deksametason hayvan intramüsküler (0.2 mg / kg) enjekte edilir.
Not: Deksametazon deri altından enjekte ya da periton boşluğu içine, kas hasarını önlemek mümkündür. - s kullanarak cilt temizlemekBetadine ile terile pamuklu% 70 etanol ile izledi.
- eldiven değiştirin ve% 70 etanol ile sprey.
Not: Steril alan dokunmayın atılabilir eldivenler kullanırken. Sadece steril cerrahi aletler ve steril bezlerden uçları ile hayvan dokunun.
2. Kafa Pencere Cerrahisi
- forseps ile cilt kaldırın ve mikro makas gözler arasında ön noktaya eğik sonra kafa tabanı boyunca yatay olarak cilt insizyon ve kullanma. flep çıkarın.
- aşırı kanama ve ağrıyı önlemek için periost üzerinde steril bir bez ile lidokain merhem sürün.
- periost kaldırmak için steril pamuklu çubuklarla veya bir neşter kullanın. Steril bezlerden ile kafatası kurulayın.
- Steril bir iğne kullanarak onları hareketsiz ve diş çimento ile temas önlemek için deri kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın. tutkal kurumasını bekleyin.
- t üzerinde steril, 3 mm coverglass Laylambdoidea'nın sütür ile öne o kafatası. RSC de lamel merkezi koordinatları: AP, Bregma -2.8; ML, steril bir iğne ile kafatası yüzeyi çizilmeye tarafından 0. Mark lamel kenarları bregma. % 70 etanol ile, steril kap içine geri coverglass koyun.
- 3 mm çaplı daire anahat küçük çaplı çapak ile yüksek hızlı diş matkap kullanın. steril tuzlu batırılmış çubuklar ile kemik tozundan sondaj sahasını temizleyin. zaman zaman kanamayı durdurmak ve kemik temizlemek için gelfoam ve bezlerden kullanın.
- sondaj arasında hafifçe kemik daire dokunmadan ve hareketliliğini kontrol ederek ince forseps ile kemik kalınlığı kontrol edin. Kemik sütür alanının üzerinde kalın olduğunu unutmayın. Kemik daire mobil ve kemik sadece bir hatta ince tabaka çevresi üzerinde bırakıldığında sondaj durdurun. tuzlu batırılmış çubuklar ile kalan tüm kemik tozu operasyonel alanını temizleyin.
- delinmiş CIR kapsayan, delme alanına steril tuz bırakındöngü. Dikkatlice sonra yavaşça ince forseps ve kemik daire gözetlemek ama sıkıca yukarıya doğru kaldırarak kemiği kaldırmak. dura olası hasarları önlemek için kaldırarak kemik daire çarpık için dikkatli olun.
- Yavaşça kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için dura üzerine steril serum fizyolojik ile ıslatılmış gelfoam uygulayın. Tüm kanama tamamen durana kadar bekleyin. Dikkatle pıhtılaşma sürecini rahatsız etmeyecek gelfoam kaldırın.
Not: Bu noktada kanama derin olarak kanıtlamak olabilir bu yüzden dikiş alanı, çok kanlanan olduğunu. Kanama tamamen durdurmak için yeterli bir süre beklemek gereklidir. Buz üzerine yerleştirerek soğutulan tuzlu batırılmış gelfoam tutmak için yararlıdır.
3. Virüs enjeksiyonundan
- stereotaktik kuleye infüzyon pompası takın ve denetleyici bağlayın.
- şırınga içine 35G iğne takın. sterilize etanol şırıngayı 10 kez yıkayın ve steril tuzlu su ile 10 kat e izlerini silmek için-metanol. şırınga hava kabarcıklarını çıkarın. pompası içine şırınga yerleştirin.
Not: diğer dezenfektanların kullanmayı düşünün. - (10 12 pfu tavsiye edilir) RAAV2 / 1 MCherry hazırlanması tek doz çözülme ve buz üzerinde tutmak. virüs çözümü ile şırınga doldurun.
- Bregma üzerinde iğne ortalamak ve sonra yavaşça aşağıdaki koordinatları kullanarak hipokampus takın: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Bu koordinatlar Kraniotomi kenarına yakın yer alacaktır. Doku stabilize etmek için 5 dakika bekleyin.
- 50 nl / dak oranında rAAV2 / 1 MCherry çözeltisi 0.7 ul enjekte edilir. Virüs tamamen adsorbe için 10 dakika bekleyin. Yavaşça iğneyi çıkartın. Kanama oluşursa gelfoam ile kurulayın. kontralateral site ile tekrarlayın.
4. Kafa Pencere İmplantasyonu
- delinmiş daire çerçeve içinde dura üstüne steril, kuru coverglass yatıyordu. Forc ile coverglass tutuneps hafifçe dura düzleştirmek ve coverglass getirmek için 'kafatası yüzeye yakın kenarları.
Not: coverglass pıhtı ve kanama devam eder bozan mümkündür. Bu durumda ise, coverglass asansör alkol, kuru yerleştirin ve 2.9 adıma geri dönün. - steril bir iğne coverglass kenarlarında yoğun siyanoakrilat yapıştırıcı uygulamak kullanılarak kafatası onları takmak için. tutkal kurumasını bekleyin.
- Kafatasının ön kısmında bir sabitleme çubuğu (M2 somunu veya ısmarlama tasarım) yerleştirin. bar kenarlar üzerinden siyanoakrilat tutkal sürün. tutkal kurumasını bekleyin.
- oturumu görüntüleme sırasında kafatası pencerenin yatay konumlandırma sağlayacak bir konuma tespit çubuğunu yerleştirin. penceresinden mümkün olduğunca uzak yerleştirin. o pencereye çok yakın yerleştirilirse, ısmarlama tutucu ile bağlayan çubuk ve vida görüntüleme işlemi sırasında hedefi için bir engel olarak poz olabilir.
- kranial pencerenin etrafında krater takviye operasyonel alanda, deri kenarları, tespit çubuğunun geri kalanını kapsayan diş akrilik bir kap oluşturun. Diş çimento sertleşmesine bekleyin.
- stereotaksik çerçeve hayvan çıkarın ve kurtarma odasına koydu.
- fizyolojik fonksiyonlarını izlerken hayvan ameliyatın bekleyin.
- 48 saat boyunca post-operatif analjezi (karprofen, 10 mg / kg) ve antibiyotik tedavisi (Baytril, 5 mg / kg) uygulanır.
5. Görüntüleme
- kadar güç mikroskobu, Sapphire lazer: Ti başlatın. Bu deneyde kullanılan sistem bir iki-fotonlu lazer, OPO sistemi ve çift GaAsP PMT ile donatılmıştır.
- induc hayvan koyunyon odası ve anestezi neden.
- mikroskop altında gaz anestezi maskesi indüksiyon odası ve yerden hayvan çıkarın. 0.3 L / dak oksijen akışını ve% 1.5-2 izofluran konsantrasyonu azaltır.
- M2 vida (veya başka bir özel sistemi) ile özel mikroskop çerçeveye hayvan sabitleyin. kranial pencereyi dengeleyin.
Not: Belirli özel kare daha iyi sonuçlar (geliştirilmiş kafa istikrar, kronik deney sırasında birden oturumlarda sabit konumlandırma) verir rağmen, mikroskop üreticinin baş sabitleme sistemini kullanmak mümkündür. - retrosplenial korteksin kenarlarından birinde widefield mikroskop ayarları ve düşük büyütme objektif merkezi görünümü kullanarak ve lamel yüzey üzerine odaklanır.
- krater benzeri akrilik kuyuya bir su damlasının uygulanır. Bir uzun mesafe suya daldırma hedefi geçin. Su menisküs con kadar kafatası pencereye doğru hedefe taşımaknumune ve objektif nects.
- iki foton ayarlarına geçin ve en düşük zum kullanarak alt numune üst taramaya başlar. dura mater geçiş yüksek spesifik olmayan sinyalin bir parlama olarak görünür olacaktır.
- tüm dinamik aralığını karşılamak için floresan hücrelerden sinyal gücüne göre her iki kanal (GFP ve mCherry) mikroskop satın alma ayarlarını yapın.
- (Diğer hücrelerden ayrılmıştır dendritik ağaç ile) uygun bir nöron bulduktan sonra düşük zum ve 5 mikron z mesafe sadece GFP filterset kullanarak bir ilk tarama yapar.
- Taranan yığınının maksimum projeksiyon elde etmek ve (ters renkleri kullanarak) ek açıklamalar için yazdırabilirsiniz.
- İstenilen morfolojik ayrıntıları görüntüye sağlayacak bir değere zum ayarlayın. Görüntü rehber olarak maksimum projeksiyon kullanılarak GFP ve mCherry kanallarında tüm dendritik ağaç.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Thy1-GFP raportör fare nöronların bir alt GFP tanımı kortikal dendrit ve RSC lokal akson çıkıntıların in vivo görüntüleme karşılaştırın. Şekil 1A görebilir birden GFP pozitif dendritler ile görüntülerin bir yığının en projeksiyon gösterir. Hücre gövdesi bir arter altında kalmıştır. Şekil 1B 1A belirtilen dendritik şube tek bir düzlem uzaklaştırdınız görüntü (dijital zoom 3x) gösterir. dendritik morfoloji (dikenler, filopodia) Detayları açıkça görülebilir. GFP kanal bant geçiren emisyon filtresi 500-550 nm kullanılarak elde edilir.
Dorsal hipokampusun içine RAAV2 / 1 mCherry bir enjeksiyon RSC sonlanan hipokampal akson ve sinaptik BOUTONS görselleştirme sağlar. Bu terminaller MCherry kanalı (band geçiren emisyonu 570-610 nm filtre) tespit edilebilir.
Şekil 1. RSC nöronlar ve RSC hipokampal çıkıntı in vivo iki foton görüntüleme İki kanal (A). RSC bir fragman (renkle gösterilen resim) GFP-ifade eden hücrelerin bir bakış. düşük büyütme (0.7x dijital zoom) alınan 100 mikron kalınlığında yığının gösterilen maksimum projeksiyon. GFP kanalında yüksek büyütme (3x dijital zoom) edinilen (B), (A) bendinde belirtilen fragmanın tek optik düzlem. MCherry alıcı ayarlar kullanılarak (c) (a) 'de gösterilen tek optik bir düzlem parçası. Algılama filtreleri ayrıntılar için Protokol bakın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Geçerli yazıda kranial pencereden RSC sinaptik giriş ve postsinaptik hedeflerin in vivo görüntüleme eş zamanlı iki foton için bir protokol mevcut. implantasyon prosedürü birkaç anahtar aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, hayvan derin anestezi ve stereotaktik çerçeve sabittir, daha sonra RSC üzerinde kafatası belirgin bir dairesel çizgiler boyunca matkap ve dairesel kemik kaldırılır ile inceltilir. Kanama durdurulduktan sonra, RAAV2 / 1 MCherry hipokampus enjekte edilir ve kapak cam delinmiş alana kafatasına sabitlenir. Son olarak sabitleme çubuğu kafasına sabitlenmiştir ve hayvan 48 saat boyunca geri odasına yerleştirilir. yaklaşık 2-3 hafta virüs ekspresyon için gerekli sonra RSC görselleştirilebilir. Görüntüleme protokolü, aşağıdaki adımlardan oluşur. İlk olarak, hayvan anestetize edilmiş ve bir mikroskop altında giderilmiştir. sonra widefield mikroskop kullanılarak ayarlanır odak, sistem swi olduğunuİki foton moduna tched ve ilgi kanalları (GFP ve mCherry) görüntülenmiştir.
sunulan teknik daha önce açıklanan protokoller üzerinde büyük bir gelişme sunuyor. Standart bir yaklaşımda, bir etiket yalnızca tek bir tip tespit edilebilir. Bu görüntü, yerel akson projeksiyonları ve dendritik ağaçlar için kullanılır olabilir, ancak hiçbir uzun menzilli bağlantı çalışmaları mümkün idi. İki floresan proteinleri birleştirerek biz pre-ve postsinaptik unsurların aynı anda izleme sağladı. Bu farazi sinaptik bağlantıların in vivo izlenmesi uzun süreli sağlar.
tarif edilen prosedürde en iyi sonuçları elde etmek için, birkaç kritik adımlar dikkat etmek önemlidir. inflamasyona neden ve kafatası pencerenin şeffaflığını bozabilir adım 2.8 dura herhangi bir zarar kemik daire kaldırma sırasında. Adım 2.9 veya prosedürün başka aşamada kanama Yetersiz durması, kan Birikimli sonuçlanırpencerenin altında iyon ve önemli ölçüde görüş alanını azaltır. virüs enjekte ettikten sonra sadece enjeksiyon yerinde doku içine demlenmeye virüsün sırayla, iğneyi çıkarmadan önce en az 10 dakika beklemek zorunda hayati önem taşımaktadır. Bu iğne çıkarılması sırasında virüs ile kortekste istenmeyen enfeksiyon olasılığını sınırlandırır. Viral transfeksiyon alan beyin dokusunun post hoc histolojik analiz ile muayene edilmelidir. İğne izi boyunca hücrelerin herhangi MCherry sentezleme kaçınılmalıdır. Standart iyileşme süresi 3 haftadır. Virüs sinaptik projeksiyonlar istikrarlı ifadesini ulaşmak ve kafatası pencere tamamen iyileşmek ve stabilize etmek için bu sürenin yeterli olacaktır. hayvanların tek kafes arkadaşları tarafından kafatası pencere implantın çıkarılmasını önlemek için muhafaza edilmelidir. büyütülmüş kafes kullanımı metal çubuklar vurarak kafatası pencerenin kazara zarar görmesini önlemek için düşünülebilir. mou ve stabil tespitmikroskop altında SE gereklidir. solunum hareketleri de dahil olmak üzere herhangi bir baş hareketi, elde edilen görüntülerin kalitesinde belirgin azalmaya neden olabilir. Objektif yatay kranial pencereyi konumlandırmak için pencerenin tüm düzlemi eşit odak edinme ile olası sorunları sınırlamak için de yararlıdır. çözme dikenler ve BOUTONS için net kriterler uygulanmalıdır. Genel olarak, BOUTONS önceki elyaf 7 en az 3 kat daha büyük bir çapa sahip olan aksonal şişlikler olarak tanımlanır. Dikenler, bir bombeli kafa içeren dendrit mili açıkça ayırt çıkıntılar olarak tanımlanır. İnce, küt, mantar ve dallı dikenler nüfusu içine daha fazla bölünme 3 mümkündür. Nedeniyle iki foton mikroskopi nispeten zayıf eksenel çözünürlük, optik eksen boyunca proje dikenler analizi 3 kaçınılmalıdır. Açıkça post hoc immün fonksiyonel boutons ve dikenler, ayırt etmek içinöncesi ve postsinaptik belirteçler 7 tanımlamak için yapılabilir.
sunulan protokol deneysel tasarımlar en uygun olduğu kanıtlanmıştır rağmen, farklı deneysel hedeflerine uygun için bunu değiştirmek mümkündür. Bazen yerine izofluran (örneğin ketamin-Xylazin gibi) enjektabl anestezi kullanmak daha uygundur, ama yeterince farklı suşları, yaş ve cinsiyet fareler arasındaki ilaç duyarlılık zihin farklılıkları tutarak, dozunu ayarlamak için önemlidir. Bur yerine delme için küresel bir birinin bir trepan kullanmak mümkündür, ancak dura zarar görme riskini artırabilir. Steril tuzlu su başarıyla yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) ile değiştirilir, ancak hazırlanması ve işletilmesi sırasında her zaman steril tutmak için önemlidir olabilir. ACSF hazırlandıktan sonra 3-4 hafta boyunca istikrarlı ve herhangi bir kirlenme bu süreden önce ortaya çıkarsa derhal atılmalıdır. Farklı kafa fixaticihazlarda iki foton mikroskop altında uyanık fare gözlemleme olasılığı da dahil olmak üzere, deneysel tasarım bağlı olarak uygulanabilir.
başka herhangi bir teknik olarak, bu aynı zamanda sınırlamaları vardır. İki foton mikroskop dura yüzeyinden 500 mikron derin beyin dokusu kadar görselleştirme sağlar. derin beyin yapılarının incelenmesi için ek modifikasyonlar uygulanmalıdır. Bizim protokol RSC çoğuna erişim sağlar, ancak superior sagittal sinüs altında gizli yapısının bir parçası hala erişilebilir değil. İki foton mikroskop çözünürlüğü belirli bir sinaps tanımlanması ve dendritik dikenler ayrıntılı morfolojik analiz için yeterli değildir. Böyle bağıntılı elektron mikroskobu gibi ek teknikler, şüpheli bir yapının varlığını doğrulamak için uygulanmalıdır. Oldukça zor bir cerrahi tekniktir olduğunu belirtmek de önemlidir ve Reco değilBir tecrübesiz operatör için mmended.
sunulan teknik deneylerin geniş bir aralıkta uygulanabilir. Bu iki foton mikroskopu ile erişilebilir olan, değişik beyin bölgelerinde araştırılması için modifiye edilebilir. Bu fizyolojik ve patolojik devletler bilişsel süreçlere dahil ve yaşlanma veya nörolojik ve psikiyatrik durumların ilerlemesi çeşitli sırasında akson ve dendritik değişiklikler aynı anda izlenmesini sağlar. Bu kesin olarak tanımlanmış nöronal altkümelerini kaynaklanan projeksiyonları görselleştirmek için hücre spesifik yararlanıcı kullanımına izin verir. Aynı zamanda uyanık ve davranış hayvanlar üzerinde deneyler protokolleri uyacak şekilde ayarlanabilir. Bundan başka, kalsiyum ya da pH-duyarlı proteinler, sadece nöronal morfoloji görselleştirmek için beyinde eksprese edilebilir, ancak, aynı zamanda, hücre aktivitesi ve fonksiyon değişir. yaklaşımın başka bir muhtemel değişikliğe MCherry ekspresyonu için farklı bir rAAV serotip kullanılmasıdır. Kimerik 2/1 serotip provides yeterince hızlı başlangıçlı (2-3 hafta) ile enjeksiyon yerinde sağlam anlatım. MCherry seviyeleri ilk başlangıcından sonra en az 12 hafta süreyle stabil kaldı ve hiçbir retrograd etiketleme bizim deneylerde tespit edildi. retrograd etiketleme elde etmek için, başka bir serotip örneğin rAAV9 olarak kullanılabilir. görüntüleme oturumları en az 24 saat aralığı anestezi sonrasında hayvanın uygun kurtarma sağlamak amacıyla tavsiye edilir ancak en, herhangi bir frekansta yapılabilir. doğru uygulandığı takdirde, bu tekniğin birkaç ay boyunca aynı bölgede birden fazla görüntüleme oturumları performans sağlar. Uzun süreli deneyler (6 aydan uzun), bir CRE / LoxP sistemi floxed GFP fare hattı AAV vektörü ile birlikte rekombinaz kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar (KL, MR, KR) patent haklarını Bu maddede kullanılan Tutucu çerçeve için (PL410001) bekleyen var.
Acknowledgments
Yazarlar filme yardım için ses kayıtları, çizimler M. Borczyk, virüs üretimi A. Trąbczyńska, genotipleme M. Ziókowska ve A. Mirgos M. Steczkowski teşekkür etmek istiyorum. KR K. Deisseroth gelen CAMK promoterinin kontrolü altında floresan protein mCherry rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) tür hediye kabul eder. Bu proje Avrupa Birliği tarafından finanse edilen CEPT altyapısı kullanılarak, Doku Yapısı ve İşlevi, Nörobiyoloji, Deneysel Biyoloji Nencki Enstitüsü Merkezi'nin Hayvan Modelleri ve Laboratuvar Laboratuvarı çekirdek tesislerinde gerçekleştirildi - Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu içinde 2007-2013 Operasyonel Programı "Yenilikçi Ekonomi". Bu çalışma, Ulusal Bilim Merkezi'ne hibe ile desteklenmiştir: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / G / KR ve Sonata Bis 2014 NZ24 / 00691 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
