Introduction
Zwei-Photonen-Mikroskopie revolutioniert die Beobachtung der Gehirnaktivität in lebenden und lebenden Tier. Seit seiner Einführung im Jahr 1990 es schnell Popularität gewonnen und ist nun als eines der interessantesten und innovative Ansätze zur Untersuchung zahlreicher Aspekte der Hirnaktivität in vivo 1,2 umgesetzt. Diese Anwendungen umfassen Blutströmungsmessungen, neuronale Aktivierung (beispielsweise unter Verwendung von Calciumfüllstandsanzeiger oder immediate early Gene expression) und die Morphologie von neuronalen Zellen. Eine zunehmende Anzahl von Laboratorien Zweiphotonen - Mikroskope, die Technik in der gesamten wissenschaftlichen Welt als neuer Standard für die Umsetzung in vivo Bildgebung des Gehirns.
Der Standardansatz beinhaltet die Implantation des Schädelfenster (ein rundes Loch in den Schädel mit einem Deckglas bedeckt) über den Lauf oder visuellen Kortex des Gehirns von Mäusen 3. Als nächstes wird in Abhängigkeit von der Versuchsprotokoll, das mouse durchläuft eine Reihe von Visualisierung und Verhaltenstrainingseinheiten, so dass die Veränderungen in der Hirnaktivität und die neuronale Morphologie über 4,5 Zeit zu überwachen. In beiden Fällen wirkt sich die Kraniotomie nur den Scheitelbein, ohne die Nähte kreuzen. Es wird weitgehend angenommen, dass der Hauptnachteil der Technik leicht zugänglich Cortex wie der Lauf oder Sehrinde seine begrenzte Anwendung. Implantieren des kranialen Fenster über anderen Regionen stellt eine Menge Schwierigkeiten, aufgrund einer übermäßigen Blutungen und / oder räumliche Hinderung.
In dieser Arbeit schlagen wir vor der Implantation des kranialen Fenster über dem retrosplenialen cortex (RSC) als weitere mögliche interessierende Region für die Zwei-Photonen - Mikroskopie in vivo 6. RSC ist ein wichtiges Element des Gehirns Schaltung verantwortlich für die räumliche Gedächtnisbildung. Anatomisch ist RSC ein Teil eines neuronalen Netzes verbindet cortical, hippocampalen und thalamischen Regionen 7. Es istin einer Reihe von Verhaltensweisen, wie räumliches Lernen und Extinktion sowie räumliche Navigation 6 stark beteiligt.
Um die morphologischen Veränderungen der Neuronen zu visualisieren verwenden wir eine transgene Mauslinie, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der THY1 Promotor. Bei diesen Mäusen GFP wird in etwa 10% der Neuronen im Gehirn ermöglicht eine klare Visualisierung der kortikalen Axonen und Dendriten mit Zwei-Photonen - Mikroskopie 8 ausgedrückt. Eine weitere Neuerung , die wir vorschlagen , ist die Injektion eines rekombinanten adeno-assoziierten Virus - Serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) Codieren eines rot fluoreszierendes Protein (mCherry) unter einer neuron-spezifischen Promotor CaMKII 9 in die tieferen Strukturen des Gehirns RSC Projizieren wie dem Hippocampus. Die Expression von rAAV2 / 1 mCherry im Hippocampus von Thy1-GFP - Maus ermöglicht die gleichzeitige Darstellung von prä- und postsynaptischen Elemente der Hippocampo-cortical Synapsen 10. Die rAAV-gesteuerte Expression von mCherry erfordert zwei bis drei Wochen für das Protein ausreichendes Niveau in den axonalen Terminals zu erreichen. Diese Frist ist mit der üblichen Zeitaufwand für die Wiederherstellung von Craniotomie konsistent.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle nachfolgend beschriebenen experimentellen Verfahren wurden von lokalen Ethikkommission am Nencki Institut für Experimentelle Biologie, Polnische Akademie der Wissenschaften genehmigt.
Hinweis: Einige der Szenen in dem zugehörigen Video beschleunigt werden. Drehzahlfaktor wird in diesen Szenen angezeigt.
1. Eine Operation Vorbereitung
- Sterilisieren alle Werkzeuge, Glasbehälter für Flüssigkeiten und Wattestäbchen im Autoklaven. Verwenden entbehrlich Handschuhe. Reinigen Sie den OP-Tisch, die Stereotaxierahmen und die ganze Umgebung mit 70% Ethanol. Verwenden Sie eine sterile OP-Pad einen sterilen Raum für alle sterilisierten Ausrüstung zu schaffen. Schneiden Sie Gelfoam in kleine Stücke und genießen sie in steriler Kochsalzlösung.
Hinweis: Nach dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, Ethanol ist weder ein Sterilisierungsmittel noch ein High-Level-Desinfektionsmittel. Es sollte nur als Reinigungs- / Entfettungsmittel auf zuvor sterilisierten Oberflächen verwendet werden. - Legen Sie das Tier in the Induktionskammer und stellen Sie die Isofluran-Ebene auf 5% und Sauerstoffstrom auf 2 l / min. Dieses Verfahren sollte ca. 3 Minuten dauern.
- Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer. Verwenden Schwanz oder Zehen kneift, um sicherzustellen, dass das Tier vollständig sediert.
- Mit Hilfe eines präzisen Trimmer das Haar von der Rückseite des Kopfes (zwischen den Ohren) bis zu den Augen rasieren.
- Legen Sie das Tier in der Stereotaxierahmen und stabilisieren den Kopf mit Ohr-Bars.
- Set Anästhesie Ebenen 1,5-2% Isofluran und 0,3 l / min Sauerstoff.
- Tragen Sie die Augensalbe.
- Injizieren das Tier subkutan mit Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) und Baytril (5 mg / kg) Entzündung, Schmerz und Infektion zu verhindern, respectively.
- Spritzen Sie das Tier intramuskulär mit Dexamethason (0,2 mg / kg) Schwellung des Gehirns zu verhindern.
Hinweis: Es ist möglich , Dexamethason subkutan zu injizieren oder intraperitoneal Muskelschäden zu verhindern. - Reinigen Sie die Haut mit sterile Wattestäbchen mit Betadine um 70% Ethanol.
- Ändern Sie die Handschuhe und sprühen sie mit 70% Ethanol.
Hinweis: Während der Einmalhandschuhe verwenden nicht das sterile Feld berühren. Berühren Sie das Tier nur mit den Spitzen der sterilen chirurgischen Instrumenten und sterilen Tupfer.
2. Cranial Fenster Chirurgie
- Heben Sie die Haut mit einer Pinzette und mit Mikro Schere, um die Haut horizontal entlang der Basis des Kopfes einzuschneiden und dann schräg nach vorne Punkt zwischen den Augen. Entfernen Sie die Hautlappen.
- Bewerben Lidocain Salbe mit einem sterilen Tupfer auf die Knochenhaut übermäßigen Blutungen und Schmerzen zu verhindern.
- Verwenden Sie sterile Wattestäbchen oder einem Skalpell das Periost zu entfernen. Trocknen Sie den Schädel mit einem sterilen Tupfer.
- Mit Anwendung einer sterilen Nadel dicht Sekundenkleber auf die Hautränder sie zu immobilisieren und aus dem Kontakt mit Zahnzement zu verhindern. Warten Sie auf den Leim trocknen.
- Legen Sie eine sterile 3 mm Deckglas über ter Schädel nach vorn auf die Lambdanaht. Zentrieren Sie das Deckglas an RSC-Koordinaten: AP, Bregma -2,8; ML, Bregma 0. Markieren Sie die Deck Kanten durch die Schädeloberfläche mit einer sterilen Nadel zu kratzen. Legen Sie das Deckglas wieder in den sterilen Behälter mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie ein High-Speed-Dentalbohrer mit kleinem Durchmesser Grat mit einem 3 mm Durchmesser-Kreis zu skizzieren. Reinigen Sie die Bohrstelle aus dem Knochenstaub mit steriler Kochsalzlösung getaucht Tupfer. Verwenden Sie die Gelfoam und Tupfer die gelegentliche Blutungen zu stoppen und den Knochen zu reinigen.
- Dazwischen Bohrungen überprüfen Sie die Knochendicke mit einer feinen Pinzette vorsichtig den Knochen Kreis berühren und seine Beweglichkeit zu prüfen. Denken Sie daran, dass der Knochen auf der Naht der Bereich dicker ist. Stoppen Sie die Bohrung, wenn der Knochen Kreis ist mobil und nur eine gleichmäßige, wird dünne Schicht von Knochen auf dem Umfang links. Reinigen Sie das Operationsfeld aller verbleibenden Knochenstaub mit Kochsalzlösung getaucht Tupfer.
- Löschen Sie die sterile Kochsalzlösung auf der Bohrstelle, für den gebohrten circle. den Knochen Kreis mit einer feinen Pinzette vorsichtig hebeln und dann vorsichtig, aber fest den Knochen entfernen, indem Sie ihn nach oben zu heben. Achten Sie darauf, nicht die Knochen Kreis zu neigen, während sie heben eine mögliche Beschädigung der Dura zu verhindern.
- gelten vorsichtig die Gelfoam in steriler Kochsalzlösung auf die Dura getränkt, um die Blutung zu stoppen. Warten Sie, bis alle Blutung vollständig gestoppt wird. Entfernen Sie vorsichtig den Gelfoam nicht den Gerinnungsprozess zu stören.
Hinweis: Die Nahtbereich gefäß ist, so dass die an dieser Stelle Blutungen könnte sich tiefgründig zu sein. Es ist wichtig, für die genügend Zeit zu warten, bis die Blutung vollständig zu stoppen. Es ist hilfreich, die Kochsalzlösung getränkten Gelfoam, indem sie auf Eis gestellt gekühlt zu halten.
3. Virus Injection
- Bringen Sie die Infusionspumpe mit dem stereotaktischen Turm und den Controller angeschlossen werden.
- Legen Sie die 35G Nadel in die Spritze. Spülen Sie die Spritze 10-mal mit Ethanol um sie zu sterilisieren und 10 mal mit steriler Kochsalzlösung zu entfernen Spuren von ethanol. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spritze. Legen Sie die Spritze in die Pumpe.
Hinweis: Stellen Sie sich andere Desinfektionsmittel verwenden. - Tauen Sie eine Einzeldosis von rAAV2 / 1 mCherry Vorbereitung (10 12 pfu wird empfohlen) und halten Sie sie auf Eis. Füllen Sie die Spritze mit der Virus-Lösung.
- Zentrieren Sie die Nadel auf dem Bregma und dann sanft in den Hippocampus fügen Sie die folgenden Koordinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Diese Koordinaten werden in der Nähe der Kante der Kraniotomie befinden. Warten Sie 5 Minuten für das Gewebe zu stabilisieren.
- Injizieren 0,7 ul der rAAV2 / 1 mCherry Lösung mit einer Geschwindigkeit von 50 nl / min. Warten Sie 10 min für das Virus vollständig zu adsorbieren. Sie vorsichtig die Nadel entfernen. Blot mit Gelfoam wenn die Blutung auftritt. Wiederholen Sie mit dem kontralateralen Seite.
4. Cranial Fenster Implantierung
- Legen Sie das sterile, getrocknete Deckglas auf der Oberseite der Dura in dem gebohrten Kreis Rahmen. Halten Sie das Deckglas mit dem forceps die Dura zu sanft flach und bringen Abdeckglas 'Kanten an die Schädeloberfläche näher.
Hinweis: Es ist möglich , dass das Deckglas das Gerinnsel stört und die Blutung wird fortgesetzt. Wenn das der Fall ist, heben Sie den Deckglas, legen Sie sie in Alkohol, trocken und Rückkehr 2.9 zu treten. - eine sterile Nadel gelten die dichte Sekundenkleber auf den Abdeckglas Kanten Mit ihnen auf den Schädel zu befestigen. Warten Sie auf den Leim trocknen.
- Legen Sie eine Befestigungsstange (M2 Mutter oder eine Sonderanfertigung) im vorderen Teil des Schädels. Tragen Sie die Sekundenkleber über die Ränder des Balkens. Warten Sie auf den Leim trocknen.
- Legen Sie die Befestigungsleiste in einer Position, die horizontale Positionierung des Schädelfenster während der Bildgebungssitzung ermöglicht. Stellen Sie sie so weit entfernt wie möglich aus dem Fenster. Wenn es um das Fenster zu schließen platziert wird, die Bar und die Schraube mit dem maßgeschneiderten Halter verbinden könnte als ein Hindernis für das Ziel während des Abbildungsprozesses darstellen.
- Erstellen Sie eine Kappe mit dem Dentalacryl, für den Rest des operativen Bereich Hautränder, Fixierung Bar, den Krater um die Schädelfenster verstärken. Warten, bis der Zahnzement zu härten.
- Nehmen Sie das Tier aus dem Stereotaxierahmen und steckte es in die Auffangkammer.
- Warten, bis das Tier von der Operation erholen, während die physiologischen Funktionen zu beobachten.
- Anwenden postoperative Analgesie (Carprofen, 10 mg / kg) und Antibiotika-Behandlung (Baytril, 5 mg / kg) für 48 Stunden.
5. Imaging
- Starten Sie den Ti: Saphir-Laser, Macht das Mikroskop auf. Das System in diesem Experiment verwendet wird mit einem Zwei-Photonen-Laser, OPO System und Dual GaAsP PMT ausgestattet.
- Legen Sie das Tier in der INDUCtion Kammer und Anästhesie zu induzieren.
- Nehmen Sie das Tier aus der Induktionskammer und in der Gasnarkosemaske unter dem Mikroskop. Verringern Sie den Sauerstofffluss auf 0,3 l / min und die Isofluran-Konzentration auf 1,5 bis 2%.
- Befestigen Sie das Tier auf dem benutzerdefinierten Mikroskop Rahmen mit einem M2 Schraube (oder einem anderen benutzerdefinierten System). Richten Sie die Schädelfenster.
Hinweis: Es ist möglich , die Mikroskophersteller Kopf Fixationssystem zu verwenden, obwohl die spezifische benutzerdefinierte Rahmen zu besseren Ergebnissen führt (verbesserte Kopfstabilität, konstante Positionierung in mehreren Sitzungen während einer chronischen Experiment). - Mit Hilfe der Weitfeld-Mikroskop-Einstellungen und eine geringe Vergrößerung Ziel Zentrum der Blick auf eine der Seiten von retrosplenialen Kortex und fokussieren es auf der Deckfläche.
- Tragen Sie einen Tropfen Wasser in die kraterartigen Acryl gut. Wechseln Sie zu einem Wasserimmersionsobjektiv lange Strecke. Bewegen Sie das Ziel in Richtung Schädelfenster, bis der Wassermeniskus conConnects der Probe und Ziel.
- Wechseln Sie in den Zwei-Photonen-Einstellungen und beginnen Scannen der Probe von oben nach unten niedrigsten Zoom verwendet wird. Die Überquerung der Dura mater wird als Blendung von hohen unspezifischen Signal sichtbar sein.
- Passen Sie die Mikroskop Erwerb Einstellungen in beiden Kanälen (GFP und mCherry) entsprechend der Signalstärke von fluoreszierenden Zellen, um den gesamten Dynamikbereich abzudecken.
- ein geeignetes Neuron (mit dendritischen Baum von anderen Zellen getrennt) führen einen ersten Scan nur mit der GFP filterset mit dem niedrigsten Zoom und z-Abstand von 5 Mikrometer Nach dem Auffinden.
- Besorgen Sie sich einen maximalen Vorsprung des gescannten Stapel und drucken Sie es für Anmerkungen (invertierten Farben verwenden).
- Stellen Sie Zoom auf einen Wert, der die gewünschten morphologischen Details Bild ermöglicht. Bild der gesamten dendritischen Baum in den GFP und mCherry Kanäle mit maximaler Projektion als Führer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die Expression von GFP in einer Untergruppe von Neuronen im Thy1-GFP reporter Maus in vivo Abbildung der kortikalen Dendriten und lokale axonale Projektionen in RSC ermöglicht. 1A zeigt maximale Projektion eines Stapels von Bildern mit mehreren GFP-positive Dendriten erkennbar. Der Zellkörper wird durch eine Arterie verdeckt. 1B zeigt eine einzige Ebene vergrößerte Bild (Digitalzoom 3x) der dendritischen Verzweigung in 1A angegeben. Details von dendritischen Morphologie (Stacheln, Filopodien) sind deutlich sichtbar. Die GFP-Kanal wird durch Verwendung des Bandpassemissionsfilter 500-550 nm erworben.
Eine Injektion des rAAV2 / 1 mCherry in den dorsalen Hippocampus ermöglicht die Visualisierung der Hippokampus - Axonen und Synapsen Boutons in RSC endet. Diese Anschlüsse können im mCherry Kanal erkannt werden (die Bandpassemissionsfilter 570-610 nm).
Abbildung 1. Zwei - Kanal in vivo Zwei-Photonen - Imaging von RSC Neuronen und Hippocampus - Projektionen RSC. (A) Eine Übersicht über die GFP-exprimierenden Zellen in einem Fragment von RSC (Bild in umgekehrten Farben dargestellt). Maximale Projektion eines um 100 bei geringer Vergrößerung genommen dicken Stapel gezeigt (0,7x Digitalzoom). (B) Einzel optische Ebene des Fragments in (A) angegeben bei hoher Vergrößerung erworben (3x digitaler Zoom) in der GFP - Kanal. (C) Einzel optischen Ebene Fragment in (A) angegeben mit den mCherry Erwerb Einstellungen. Siehe Protokoll für die Einzelheiten der Detektionsfilter. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In der aktuellen Papier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Zwei-Photonen - in - vivo - Bildgebung der synaptischen Eingänge und postsynaptischen Ziele im RSC durch ein Schädel-Fenster. Das Implantationsverfahren bestehen aus mehreren Schlüsselschritte. Zunächst wird das Tier tief anästhesiert und in dem stereotaktischen Rahmen befestigt, dann wird der Schädel über RSC wird entlang der markierten Kreislinien mit einem Bohrer ausgedünnt und die kreisförmige Knochen entfernt wird. Nachdem die Blutung gestoppt wird, wird die rAAV2 / 1 mCherry in den Hippocampus injiziert und das Deckglas auf den Schädel über der gebohrten Fläche befestigt ist. Schließlich wird die Befestigungsleiste auf dem Kopf befestigt ist und das Tier wird für 48 Stunden in der Wiedergewinnungskammer angeordnet. Nach ca. 2-3 Wochen für das Virus die Expression benötigt werden, kann die RSC visualisiert werden. Das Abbildungsprotokoll besteht aus den folgenden Schritten. Zunächst wird das Tier narkotisiert und unter dem Mikroskop fixiert. Der Fokus wird dann das Weitfeld- Mikroskop verwendet wird, ist das System switched in die Zwei-Photonen-Modus und die Kanäle von Interesse (GFP und mCherry) sichtbar gemacht werden.
Die vorgestellte Technik bietet eine wesentliche Verbesserung gegenüber den zuvor beschriebenen Protokollen. Im Standardansatz könnte nur eine Art eines Etiketts detektiert werden. Es könnte zu Bild lokalen axonalen Projektionen und dendritischen Bäume verwendet werden, aber keine Langstreckenkonnektivität Studien waren möglich. Durch die Kombination von zwei fluoreszierenden Proteinen aktiviert wir die gleichzeitige Verfolgung von prä- und postsynaptischen Elemente. Dies ermöglicht langfristig in - vivo - Überwachung mutmaßlicher synaptischen Verbindungen.
Um die optimale Ergebnisse in dem beschriebenen Verfahren zu erhalten, ist es wichtig, auf einige kritische Schritte zu zahlen. Beim Anheben des Knochen Kreis in Schritt 2.8 eine Beschädigung der Dura kann eine Entzündung hervorrufen und die Transparenz des Schädel Fenster beeinträchtigen. Unzureichende Stillstand des in Schritt 2.9 oder zu einem anderen Schritt des Verfahrens Blutungen führt zu Blut accumulatIonen unter dem Fenster und reduziert das Sichtfeld. Nachdem das Virus Injektion ist es wichtig, für mindestens 10 Minuten warten, bevor die Nadel, um das Virus zu entfernen nur in das Gewebe an der Injektionsstelle ziehen lassen. Es begrenzt die Möglichkeit einer ungewollten Infektion der Hirnrinde mit dem Virus während der Nadelentfernungs. Das Gebiet der viralen Transfektion sollte mit einer post hoc histologische Analyse von Hirngewebe untersucht werden. Jede mCherry Expression in Zellen entlang der Nadelspur zu vermeiden. Die Standard-Wiederherstellungszeit ist 3 Wochen. Dieser Zeitraum ist ausreichend für das Virus eine stabile Expression in den synaptischen Projektionen zu erreichen und für die Schädelfenster vollständig zu heilen und zu stabilisieren. Die Tiere sollten einzelne, um durch die Käfiggenossen Entfernung des Schädelfenster Implantat zu verhindern, untergebracht werden. Die Verwendung eines vergrößerten Käfig könnte erwogen werden, um unbeabsichtigte Beschädigung des Schädel Fenster zu vermeiden, indem Sie die Metallstangen schlagen. Stabile Fixierung des mouse unter dem Mikroskop ist von wesentlicher Bedeutung. Jede Kopfbewegung, einschließlich Atembewegungen, kann es zu erheblichen Verringerung der Qualität der erhaltenen Bilder. Es ist auch hilfreich, die cranial Fenster horizontal auf das Ziel zu positionieren, mögliche Probleme zu begrenzen, mit dem gleichen Schwerpunkt für die gesamte Ebene des Fensters zu erwerben. Klare Kriterien für die Lösung Stacheln und boutons angewandt werden. Im Allgemeinen werden als boutons axonalen Schwellungen definiert mindestens 3 - mal größer als die vorhergehende Faser 7 einen Durchmesser aufweist. Spines werden als klar unterscheidbare Vorsprünge von der Dendriten Welle definiert, die einen verdickten Kopf enthalten. Weitere Unterteilung in Populationen von dünnen, kurze Form, Pilz und verzweigten Stacheln ist möglich 3. Aufgrund der relativ schlechten axiale Auflösung des Zwei-Photonen - Mikroskopie, die Analyse von Stacheln, die sich entlang der optischen Achse projizieren sollte 3 vermieden werden. Um die Funktions Boutons und Dornen zu deutlich unterscheiden, eine Post - hoc - Immunmarkierungzu identifizieren , prä- und postsynaptischen Markern 7 in Reihenfolge ausgeführt werden.
Obwohl die dargestellten Protokoll der günstigste in unseren experimentellen Designs erwiesen, ist es möglich, sie zu modifizieren, um unterschiedliche experimentelle Ziele zu passen. Manchmal ist es besser geeignet injizierbare Anästhesie zu verwenden (wie Ketamin-xylasine) anstelle von Isofluran, aber es ist wichtig, um angemessen die Dosierung anzupassen, unter Berücksichtigung Unterschiede in Wirkstoffansprechverhaltens zwischen Mäusen verschiedener Stämme, Alter und Geschlecht. Es ist möglich, eine Trepanbohrer anstelle einer sphärischen eine für das Bohren zu verwenden, aber es könnte die Gefahr einer Beschädigung der Dura erhöhen. Sterile Kochsalzlösung werden mit künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) erfolgreich ersetzt, aber es ist wichtig, sie zu allen Zeiten steril zu halten, während der Herstellung und im Betrieb. ACSF ist stabil für 3-4 Wochen nach der Herstellung, und wenn eine Kontamination vor dieser Zeit auftritt, sollte es sofort verworfen werden. Verschiedene Kopf Befestigungsauf Vorrichtungen angewendet werden, je nach Versuchsanordnung, einschließlich der Möglichkeit, die wach Maus unter der Zwei-Photonen-Mikroskop beobachtet wird.
Wie jede andere Technik, dieser hat auch seine Grenzen. Die Zwei-Photonen-Mikroskop ermöglicht die Visualisierung von Hirngewebe von bis zu 500 & mgr; m tief von der Oberfläche dura. Zur Untersuchung der tieferen Hirnstrukturen müssen zusätzliche Modifikationen angewendet werden. Unser Protokoll ermöglicht den Zugang zu den meisten RSC, aber der Teil der Struktur unter dem Sinus sagittalis superior verborgen ist noch nicht zugänglich. Die Auflösung des Zwei-Photonen-Mikroskop für die Identifizierung eines spezifischen Synapsen sowie detaillierte morphologische Analyse der dendritischen Dornen nicht ausreichend. Zusätzliche Techniken, wie korrelativen Elektronenmikroskopie muss, um das Vorhandensein eines vermuteten Struktur zu bestätigen angewendet werden. Es ist auch wichtig zu erwähnen, dass dies eine relativ schwierige chirurgische Technik ist, und es ist nicht recommended für einen unerfahrenen Bediener.
Die dargestellte Technik kann in einer Vielzahl von Experimenten angewandt werden. Es kann für die Untersuchung der verschiedenen Hirnregionen zugänglich mit dem Zwei-Photonen-Mikroskop modifiziert werden. Es ermöglicht die gleichzeitige Überwachung von axonalen und dendritischen Veränderungen während Vielzahl von physiologischen und pathologischen Zuständen kognitiven Prozessen, einschließlich und Alterungs oder Progression von neurologischen und psychiatrischen Erkrankungen. Es ermöglicht die Verwendung von zellspezifischen Promotoren Vorsprünge Ursprung an genau definierten neuronalen Teilmengen zu visualisieren. Es kann auch die Protokolle von Experimenten an wach und verhalten Tiere passen angepasst werden. Weiterhin calcium- oder pH- empfindliche Proteine können in das Gehirn, um sichtbar zu machen, nicht nur die neuronale Morphologie, sondern auch Veränderungen in der Zellaktivität und Funktion ausgedrückt werden. Eine weitere mögliche Modifikation des Ansatzes ist die Verwendung eines anderen rAAV-Serotyp für mCherry Expression. Die chimären 2/1 Serotyp provides robust Ausdruck an der Injektionsstelle mit ausreichend schnellen Wirkungseintritt (2-3 Wochen). Die mCherry Ebenen blieben stabil für mindestens 12 Wochen nach der ersten Auftreten und keine retrograden Markierung wurde in unseren Experimenten nachgewiesen. Um retrograden Markierung zu erhalten, könnte ein anderer Serotypen verwendet werden, wie beispielsweise rAAV9. Die Imaging-Sitzungen können bei einer beliebigen Frequenz durchgeführt werden, mindestens jedoch 24-Stunden-Intervall empfohlen wird, um die richtige Erholung des Tieres nach der Narkose zu ermöglichen. Wenn sie richtig angewendet wird, ermöglicht diese Technik mehrere Imaging-Sitzungen der gleichen Region im Laufe von mehreren Monaten durchgeführt wird. Für Langzeitversuche (länger als 6 Monate), ein Cre / loxP-System kann mit dem mit dem AAV-Vektor in eine floxed GFP Mauslinie geliefert Rekombinase verwendet werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren (KL, MR, KR) haben Rechte für Patent angemeldet (PL410001) für in diesem Artikel verwendete Halterahmen.
Acknowledgments
Die Autoren möchten M. Steczkowski für Sprachaufnahmen, M. Borczyk für Zeichnungen, A. Trąbczyńska für die Virusproduktion, M. Ziókowska für die Genotypisierung und A. Mirgos für die Unterstützung bei Dreharbeiten zu danken. KR erkennt die Art Geschenk des rekombinanten Adeno-assoziierten Virus (rAAV) fluoreszierendes Protein mCherry unter der Kontrolle von CaMK Promotor von K. Deisseroth Ausdruck zu bringen. dem Europäischen Regionalentwicklungsfonds innerhalb - Dieses Projekt wurde in den Kernanlagen des Labors für Tiermodelle und Labor für Tissue Struktur und Funktion, Zentrum für Neurobiologie, Nencki Institut für Experimentelle Biologie, mit dem Einsatz von CePT Infrastruktur von der Europäischen Union finanziert werden durchgeführt das operationelle Programm "Innovative Wirtschaft" für den Zeitraum 2007-2013. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse von der National Science Centre unterstützt: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 zu KR und Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 bis RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
