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Neuroscience

एक साथ दो-फोटान Published: March 13, 2016 doi: 10.3791/53528
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 3
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology
* These authors contributed equally

Introduction

दो photon माइक्रोस्कोपी रह रहे हैं और जानवरों के व्यवहार कर में मस्तिष्क की गतिविधियों के अवलोकन में क्रांति ला दी। 1990 में अपनी शुरुआत के बाद से इसे जल्दी से लोकप्रियता हासिल की और अब विवो 1,2 में मस्तिष्क की गतिविधियों के कई पहलुओं की परीक्षा की दिशा में सबसे दिलचस्प और अभिनव तरीकों में से एक के रूप में कार्यान्वित किया जाता है। इन आवेदनों और neuronal कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (कैल्शियम स्तर संकेतक या तत्काल जल्दी जीन अभिव्यक्ति का उपयोग, उदाहरण के लिए) रक्त प्रवाह माप, न्यूरोनल सक्रियण शामिल हैं। प्रयोगशालाओं की संख्या बढ़ रही दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करें, इन विवो ब्रेन इमेजिंग के लिए एक नए मानक के रूप में दुनिया भर में वैज्ञानिक तकनीक को लागू करने।

मानक दृष्टिकोण कपाल खिड़की का आरोपण बैरल या माउस मस्तिष्क 3 के दृश्य प्रांतस्था पर (कपाल एक गिलास को कवर के साथ कवर में एक गोल छेद) शामिल है। अगले, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पर निर्भर करता है, समझौता ज्ञापनएसई दृश्य और व्यवहार प्रशिक्षण सत्र की एक श्रृंखला आए, समय 4.5 ओवर मस्तिष्क की गतिविधियों और neuronal आकृति विज्ञान में परिवर्तन की निगरानी करने की इजाजत दी। दोनों ही मामलों में craniotomy केवल टांके पार करने के बिना, पार्श्विका हड्डी प्रभावित करता है। यह काफी हद तक माना जाता है कि तकनीक के मुख्य दोष ऐसे बैरल या दृश्य कोर्टेक्स के रूप में आसानी से सुलभ cortexes करने के लिए अपने सीमित आवेदन पत्र है। अन्य क्षेत्रों पर कपाल खिड़की का आरोपण अत्यधिक रक्तस्राव और / या स्थानिक बाधा के कारण काफी परेशानियों का बना हुआ है।

इस पत्र में हम retrosplenial कोर्टेक्स (आरएससी) विवो माइक्रोस्कोपी 6 में दो photon के लिए ब्याज की एक अन्य संभावित क्षेत्र के रूप में ऊपर कपाल खिड़की का आरोपण का प्रस्ताव। आरएससी मस्तिष्क सर्किट स्थानिक स्मृति गठन के लिए जिम्मेदार का एक महत्वपूर्ण तत्व है। Anatomically, आरएससी cortical, हिप्पोकैम्पस, और thalamic क्षेत्रों 7 जोड़ने के लिए एक न्यूरोनल नेटवर्क का एक हिस्सा है। यह हैभारी ऐसे स्थानिक सीखने और विलुप्त होने के साथ ही स्थानिक नेविगेशन 6 के रूप में व्यवहार, की एक श्रेणी में शामिल किया गया।

आदेश में न्यूरॉन्स की रूपात्मक परिवर्तन कल्पना करने के लिए हम एक ट्रांसजेनिक माउस लाइन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) Thy1 प्रमोटर के तहत व्यक्त उपयोग करें। इन चूहों में, GFP दो photon माइक्रोस्कोपी 8 का उपयोग दिमाग में न्यूरॉन्स cortical axons और dendrites के स्पष्ट दृश्य के लिए अनुमति देने का लगभग 10% में व्यक्त किया जाता है। एक और नवीनता है कि हम प्रस्ताव एक पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस सीरोटाइप 2/1 (rAAV2 / 1) आरएससी के लिए पेश मस्तिष्क के गहरे ढांचे में एक न्यूरॉन विशिष्ट CaMKII प्रमोटर 9 के तहत एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mCherry) कोडिंग के इंजेक्शन है हिप्पोकैम्पस के रूप में इस तरह के। Thy1-GFP माउस के हिप्पोकैम्पस में rAAV2 / 1 mCherry की अभिव्यक्ति hippocampo-cortica के पूर्व और postsynaptic तत्वों के एक साथ दृश्य के लिए अनुमति देता हैएल synapses 10। प्रोटीन axonal टर्मिनलों में पर्याप्त स्तर तक पहुँचने के लिए mCherry के rAAV संचालित अभिव्यक्ति दो से तीन सप्ताह की आवश्यकता है। इस अवधि में सामान्य समय craniotomy से वसूली के लिए आवश्यक के साथ संगत है।

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Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रायोगिक जीवविज्ञान के Nencki संस्थान, पोलिश एकेडमी ऑफ साइंसेज में स्थानीय नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

नोट: जुड़े वीडियो में दृश्यों के कुछ त्वरित हैं। गति कारक इन दृश्यों में संकेत दिया है।

1. सर्जरी की तैयारी

  1. सभी उपकरण, तरल पदार्थ और आटोक्लेव में कपास swabs के लिए ग्लास कंटेनर जीवाणुरहित। नगण्य दस्ताने का प्रयोग करें। शल्य चिकित्सा की मेज, stereotaxic फ्रेम और 70% इथेनॉल के साथ सभी आसपास के क्षेत्र को साफ। सभी निष्फल उपकरण के लिए एक बाँझ जगह बनाने के लिए एक बाँझ शल्य पैड का प्रयोग करें। छोटे टुकड़ों में gelfoam कट और उन्हें बाँझ खारा में भिगो दें।
    नोट: देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग के लिए गाइड के मुताबिक, इथेनॉल न तो एक sterilant है और न ही एक उच्च स्तरीय कीटाणुनाशक है। यह केवल पर पहले से निष्फल सतहों एक सफाई / Defatting एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  2. वें में पशु रखोई प्रेरण कक्ष और 2 एल / मिनट के लिए 5% isoflurane स्तर और ऑक्सीजन का प्रवाह निर्धारित किया है। इस प्रक्रिया के बारे में 3 मिनट के लिए ले जाना चाहिए।
  3. प्रेरण कक्ष से बाहर पशु ले लो। आदेश में पूंछ या पैर के अंगूठे चुटकी उपयोग को सुनिश्चित करने के लिए कि जानवर पूरी तरह से बेहोश है।
  4. एक सटीक trimmer आंखों के लिए ऊपर सिर के पीछे (कान के बीच) से बाल दाढ़ी का उपयोग करना।
  5. stereotaxic फ्रेम में पशु रखें और कान सलाखों के साथ सिर को स्थिर।
  6. 1.5-2% isoflurane और 0.3 एल / मिनट ऑक्सीजन के लिए संज्ञाहरण के स्तर को निर्धारित करें।
  7. आँख मरहम लागू करें।
  8. सूजन, दर्द और संक्रमण, क्रमशः को रोकने के लिए Tolfedine (4 मिलीग्राम / किग्रा), Butomidor (2 मिलीग्राम / किग्रा) और Baytril (5 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पशु subcutaneously इंजेक्षन।
  9. Dexamethasone के साथ पशु intramuscularly (0.2 मिलीग्राम / किग्रा) मस्तिष्क की सूजन को रोकने के लिए इंजेक्षन।
    नोट: यह Dexamethasone subcutaneously इंजेक्षन करने के लिए या intraperitoneally मांसपेशियों की क्षति को रोकने के लिए संभव है।
  10. त्वचा s का उपयोग करके साफBetadine साथ terile कपास swabs 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा किया।
  11. दस्ताने बदलने और उन्हें 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे।
    नोट: डिस्पोजेबल दस्ताने का उपयोग करते हुए बाँझ क्षेत्र स्पर्श नहीं करते। केवल बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों और बाँझ swabs के सुझावों के साथ पशु स्पर्श करें।

2. कपाल खिड़की सर्जरी

  1. संदंश के साथ त्वचा लिफ्ट और सूक्ष्म कैंची त्वचा आंखों के बीच सामने बात करने के फेर से सिर के आधार के साथ क्षैतिज काटकर अलग कर देना और उसके बाद का उपयोग कर। त्वचा फ्लैप निकालें।
  2. periosteum पर एक बाँझ झाड़ू अत्यधिक रक्तस्राव और दर्द को रोकने के साथ lidocaine मरहम लागू करें।
  3. बाँझ कपास swabs या एक छुरी का प्रयोग periosteum हटा दें। बाँझ swabs के साथ खोपड़ी सूखी।
  4. एक बाँझ सुई का प्रयोग त्वचा के किनारों पर घने cyanoacrylate गोंद लागू उन्हें स्थिर करने के लिए और दंत सीमेंट के साथ संपर्क में आने से रोकने के लिए। गोंद शुष्क करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  5. टी पर एक बाँझ 3 मिमी coverglass निर्धारित करनावह lambdoid सीवन के लिए पूर्व से खोपड़ी। आरएससी पर coverslip केंद्र निर्देशांक: एपी, शीर्षस्थान -2.8; एमएल, एक बाँझ सुई के साथ खोपड़ी की सतह scratching द्वारा 0. मार्क coverslip किनारों bregma। coverglass 70% इथेनॉल के साथ बाँझ कंटेनर में वापस डाल दिया।
  6. एक 3 मिमी व्यास चक्र की रूपरेखा तैयार करने के लिए छोटे व्यास गड़गड़ाहट के साथ एक उच्च गति दंत ड्रिल का प्रयोग करें। बाँझ खारा डूबा swabs के साथ हड्डी धूल से ड्रिलिंग साइट को साफ करें। कभी-कभी खून बह रहा बंद करो और हड्डी साफ करने के लिए gelfoam और swabs का प्रयोग करें।
  7. ड्रिलिंग के बीच में धीरे हड्डी चक्र को छू और अपनी गतिशीलता की जाँच करके ठीक संदंश के साथ हड्डी मोटाई की जाँच करें। ध्यान रखें कि हड्डी सीवन के क्षेत्र पर गहरा हो जाता है। ड्रिलिंग बंद करो जब हड्डी सर्कल मोबाइल है और केवल एक भी हड्डी की पतली परत परिधि पर छोड़ दिया है। खारा डूबा swabs के साथ सभी शेष हड्डी धूल के परिचालन क्षेत्र को साफ करें।
  8. ड्रिलिंग क्षेत्र पर बाँझ खारा गिरा, drilled परिस्थितियों को कवरCLE। ध्यान से धीरे ठीक संदंश और फिर साथ हड्डी सर्कल जिज्ञासा लेकिन दृढ़ता से यह ऊपर की ओर उठाने से हड्डी को हटा दें। हड्डी सर्कल तिरछा करने के लिए नहीं है, जबकि यह ड्यूरा उठाने के लिए संभावित नुकसान को रोकने के लिए सावधान रहें।
  9. धीरे रक्तस्राव को रोकने में मदद करने के लिए ड्यूरा पर gelfoam बाँझ खारा में भिगो लागू होते हैं। जब तक सभी पूरी तरह से खून बह रहा बंद कर दिया है रुको। ध्यान थक्के प्रक्रिया को परेशान करने के लिए नहीं gelfoam को हटा दें।
    नोट: सीवन क्षेत्र, अत्यधिक vascularized है तो इस बिंदु पर खून बह रहा है गहरा साबित हो सकता है। यह पर्याप्त समय के लिए प्रतीक्षा करने के लिए आवश्यक खून बह रहा है पूरी तरह से बंद करने के लिए है। यह खारा लथपथ gelfoam बर्फ पर रखकर ठंडा रखने के लिए उपयोगी है।

3. वायरस इंजेक्शन

  1. स्टीरियोटैक्टिक टावर के लिए प्रेरणा पंप देते हैं और नियंत्रक कनेक्ट।
  2. सिरिंज में 35 जी सुई डालें। इथेनॉल के साथ सिरिंज फ्लश 10 बार यह बाँझ और बाँझ खारा के साथ 10 बार ई के निशान को दूर करने के लिएthanol। सिरिंज से हवाई बुलबुले निकालें। पंप में सिरिंज डालें।
    नोट: अन्य कीटाणुनाशक उपयोग पर विचार करें।
  3. RAAV2 / 1 mCherry तैयारी की एक खुराक गला लें (10 से 12 pfu सिफारिश की है) और यह बर्फ पर रहते हैं। वायरस समाधान के साथ सिरिंज भरें।
  4. शीर्षस्थान पर सुई केंद्र और फिर धीरे निम्नलिखित निर्देशांक का उपयोग कर हिप्पोकैम्पस में सम्मिलित: एपी -2, एमएल +/- 1.0, डीवी -1। ये निर्देशांक craniotomy के किनारे के पास स्थित हो जाएगा। 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ऊतक को स्थिर करने के लिए।
  5. 50 nl / मिनट की दर से rAAV2 / 1 mCherry समाधान के 0.7 μl इंजेक्षन। 10 मिनट रुको वायरस के लिए पूरी तरह से सोखना करने के लिए। धीरे सुई को हटा दें। gelfoam के साथ दाग यदि रक्त स्राव होता है। contralateral साइट के साथ दोहराएँ।

4. कपाल खिड़की आरोपण

  1. drilled सर्कल फ्रेम में ड्यूरा के शीर्ष पर बाँझ, सूखे coverglass निर्धारित करना। forc साथ coverglass पकड़ोईपीएस धीरे ड्यूरा समतल और coverglass लाने के लिए 'खोपड़ी की सतह के करीब किनारों।
    नोट: यह है कि coverglass थक्का और खून बह रहा है को फिर बाधित संभव है। यदि यह मामला है, coverglass उठा शराब, शुष्क में डाल दिया और कदम करने के लिए 2.9 वापसी।
  2. एक बाँझ सुई coverglass किनारों पर घने cyanoacrylate गोंद का उपयोग कर उन्हें लागू खोपड़ी को देते हैं। गोंद शुष्क करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  3. खोपड़ी के सामने के हिस्से में एक बार निर्धारण (M2 अखरोट या एक कस्टम डिजाइन) रखें। बार के किनारों पर cyanoacrylate गोंद लागू करें। गोंद शुष्क करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    1. एक स्थिति है कि इमेजिंग सत्र के दौरान कपाल खिड़की की क्षैतिज स्थिति में सक्षम हो जाएगा निर्धारण बार रखें। यह जगह के रूप में खिड़की से संभव के रूप में दूर। यह भी खिड़की के पास रखा जाता है, बार और पेंच कस्टम बनाया धारक के साथ जोड़ने की प्रक्रिया के दौरान इमेजिंग उद्देश्य के लिए एक बाधा के रूप में खड़ा हो सकता है।
  4. दंत एक्रिलिक के साथ एक टोपी बनाने के लिए, परिचालन क्षेत्र, त्वचा किनारों, निर्धारण बार के बाकी को कवर, कपाल खिड़की के आसपास गड्ढा मजबूत। दंत सीमेंट कड़ा करने के लिए प्रतीक्षा करें।
  5. stereotaxic फ्रेम से पशु निकालें और यह वसूली कक्ष में डाल दिया।
  6. पशु शारीरिक कार्यों का अवलोकन करते हुए सर्जरी से उबरने के लिए प्रतीक्षा करें।
  7. 48 घंटे के लिए पोस्ट ऑपरेटिव analgesia (Carprofen, 10 मिलीग्राम / किग्रा) और एंटीबायोटिक दवाओं के उपचार (baytril, 5 मिलीग्राम / किग्रा) को लागू करें।

5. इमेजिंग

  1. नीलम लेजर, बिजली माइक्रोस्कोप: तिवारी शुरू करो। इस प्रयोग में इस्तेमाल किया प्रणाली एक दो photon लेजर, OPO प्रणाली और दोहरी GaAsP पीएमटी के साथ सुसज्जित है।
  2. induc में पशु रखोtion कक्ष और संज्ञाहरण प्रेरित।
  3. प्रेरण कक्ष और माइक्रोस्कोप के तहत गैस संज्ञाहरण नकाब में जगह से पशु निकालें। 0.3 एल / मिनट के लिए ऑक्सीजन का प्रवाह और 1.5-2% isoflurane एकाग्रता में कमी।
  4. एक M2 पेंच (या किसी अन्य कस्टम सिस्टम) के साथ कस्टम माइक्रोस्कोप फ्रेम करने के लिए जानवर को ठीक करें। कपाल खिड़की के स्तर।
    नोट: यह, माइक्रोस्कोप के निर्माता के सिर निर्धारण प्रणाली का उपयोग करने के लिए संभव है, हालांकि विशिष्ट कस्टम फ्रेम बेहतर परिणाम (सुधार सिर स्थिरता, एक पुरानी प्रयोग के दौरान कई सत्रों में लगातार स्थिति) देता है।
  5. retrosplenial कोर्टेक्स के पक्ष में से एक पर widefield माइक्रोस्कोप सेटिंग्स और एक कम बढ़ाई उद्देश्य केंद्र दृश्य का उपयोग और coverslip सतह पर ध्यान केंद्रित।
  6. गड्ढा की तरह अच्छी तरह से एक्रिलिक में पानी की एक छोटी बूंद लागू करें। एक लंबी दूरी की पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए स्विच। पानी meniscus चोर जब तक कपाल खिड़की की ओर ले जाएँ उद्देश्यनमूना और उद्देश्य nects।
  7. दो photon सेटिंग्स के लिए स्विच और नीचे करने के लिए नमूना शीर्ष स्कैनिंग सबसे कम ज़ूम का उपयोग शुरू करते हैं। ड्यूरा मेटर के पार उच्च गैर विशिष्ट संकेत के एक चमक के रूप में दिखाई जाएगी।
  8. दोनों चैनलों (GFP और mCherry) के क्रम में पूरे गतिशील रेंज को कवर करने में फ्लोरोसेंट कोशिकाओं से सिग्नल की शक्ति के अनुसार में माइक्रोस्कोप अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करें।
  9. एक उपयुक्त न्यूरॉन (अन्य कोशिकाओं से अलग वृक्ष के समान पेड़ के साथ) खोजने के बाद सबसे कम जूम और 5 माइक्रोन की जेड दूरी के साथ ही GFP filterset का उपयोग कर एक प्रारंभिक स्कैन करते हैं।
  10. स्कैन ढेर की एक अधिकतम प्रक्षेपण प्राप्त करें और व्याख्या के लिए इसे प्रिंट (उल्टे रंगों का उपयोग)।
  11. एक मूल्य है कि वांछित रूपात्मक विवरण छवि के लिए अनुमति देगा करने के लिए ज़ूम सेट करें। छवि गाइड के रूप में अधिकतम प्रक्षेपण का उपयोग GFP और mCherry चैनलों में पूरे वृक्ष के समान पेड़।

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Representative Results

Thy1-GFP संवाददाता माउस में न्यूरॉन्स की एक सबसेट में GFP की अभिव्यक्ति cortical dendrites और आरएससी में स्थानीय axonal अनुमानों के vivo इमेजिंग में अनुमति देता है। चित्रा 1 ए कई GFP पॉजिटिव दिखाई डेन्ड्राइट के साथ छवियों के एक ढेर की अधिकतम प्रक्षेपण से पता चलता है। सेल शरीर एक धमनी से छिप जाता है। चित्रा 1 बी 1 ए में संकेत वृक्ष के समान शाखा का एक ही विमान तेजी से बढ़ी छवि (डिजिटल ज़ूम 3x) से पता चलता है। वृक्ष के समान आकृति विज्ञान (कांटा, filopodia) का विवरण स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। GFP चैनल बैंड पास उत्सर्जन फिल्टर 500-550 एनएम का उपयोग करके प्राप्त किया जाता है।

पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस में rAAV2 / 1 mCherry का एक इंजेक्शन हिप्पोकैम्पस एक्सोन और synaptic BOUTONS आरएससी में समाप्त के दृश्य के लिए अनुमति देता है। इन टर्मिनलों mCherry चैनल (बैंड पास उत्सर्जन फिल्टर 570-610 एनएम) में पता लगाया जा सकता है।


आकृति 1। आरएससी न्यूरॉन्स और आरएससी के लिए हिप्पोकैम्पस के अनुमानों के विवो दो photon इमेजिंग में दो चैनल। (ए) आरएससी का एक टुकड़ा (छवि उल्टे रंग में दिखाया गया है) में GFP व्यक्त कोशिकाओं का अवलोकन। अधिकतम प्रक्षेपण एक 100 माइक्रोन मोटी ढेर कम बढ़ाई (0.7x डिजिटल ज़ूम) पर लिया दिखाया गया है। (बी) के खंड (ए) ने संकेत दिया की एक ऑप्टिकल विमान GFP चैनल में उच्च वृद्धि (3x डिजिटल ज़ूम) में अधिग्रहण किया। (सी) एक ऑप्टिकल विमान टुकड़ा में (ए) ने संकेत दिया mCherry अधिग्रहण सेटिंग्स का उपयोग कर। पता लगाने फिल्टर की जानकारी के लिए प्रोटोकॉल देखें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

वर्तमान पत्र में हम एक कपाल खिड़की के माध्यम से अन्तर्ग्रथनी आदानों और आरएससी में पोस्टअन्तर्ग्रथनी लक्ष्यों की vivo इमेजिंग में एक साथ दो photon के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। आरोपण की प्रक्रिया कई महत्वपूर्ण कदम से मिलकर बनता है। सबसे पहले, पशु गहरा anesthetized और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में तय हो गई है, तो आरएससी के ऊपर खोपड़ी चिह्नित परिपत्र पंक्तियों के साथ एक ड्रिल और परिपत्र हड्डी निकाल दिया जाता है के साथ पतला है। बाद रक्तस्राव बंद कर दिया है, rAAV2 / 1 mCherry हिप्पोकैम्पस में इंजेक्ट किया जाता है, और कांच कवर drilled क्षेत्र में खोपड़ी के लिए तय हो गई है। अंत में नियतन बार सिर पर सुरक्षित है और पशुओं के 48 घंटे के लिए वसूली कक्ष में रखा गया है। बाद लगभग 2-3 सप्ताह वायरस अभिव्यक्ति के लिए की जरूरत है, आरएससी देखे जा सकते हैं। इमेजिंग प्रोटोकॉल के बाद के चरणों के शामिल हैं। सबसे पहले, पशु anesthetized और माइक्रोस्कोप के तहत तय हो गई है। फोकस तो widefield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेट कर दिया जाता है, सिस्टम श्रृंगार हैदो photon मोड में tched और ब्याज की चैनल (GFP और mCherry) कल्पना कर रहे हैं।

प्रस्तुत तकनीक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल पर एक बड़ा सुधार प्रदान करता है। मानक दृष्टिकोण में, एक लेबल का ही एक प्रकार का पता लगाया जा सकता है। यह छवि स्थानीय axonal अनुमानों और वृक्ष के समान पेड़ों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन कोई लंबी दूरी की कनेक्टिविटी के अध्ययन संभव हो गया है। दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संयोजन से हम पूर्व और postsynaptic तत्वों के एक साथ ट्रेसिंग सक्षम होना चाहिए। यह ख्यात synaptic कनेक्शन के विवो निगरानी में लंबी अवधि के लिए अनुमति देता है।

आदेश में वर्णित प्रक्रिया में इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए, यह कई महत्वपूर्ण कदम पर ध्यान देना जरूरी है। ड्यूरा को कोई नुकसान 2.8 चरण में हड्डी चक्र उठाने सूजन का कारण है और कपाल खिड़की की पारदर्शिता के दौरान ख़राब हो सकता है। 2.9 कदम में या प्रक्रिया के किसी भी अन्य कदम पर खून बह रहा है की अपर्याप्त रक्त ठहराव accumulat में यह परिणामखिड़की के नीचे आयन और देखने के क्षेत्र में काफी कम कर देता है। वायरस को इंजेक्शन लगाने के बाद यह वायरस को हटाने के लिए सुई, क्रम में ही इंजेक्शन स्थल पर ऊतक में तर करने के लिए पहले कम से कम 10 मिनट के लिए इंतजार करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह सुई हटाने के दौरान वायरस से कोर्टेक्स के अवांछित संक्रमण की संभावना को सीमित करता है। वायरल अभिकर्मक के क्षेत्र में एक पोस्ट अस्थायी मस्तिष्क के ऊतकों की ऊतकीय विश्लेषण के साथ जांच की जानी चाहिए। सुई का पता लगाने के साथ कोशिकाओं में किसी भी mCherry अभिव्यक्ति से बचा जाना चाहिए। मानक वसूली समय 3 सप्ताह है। वायरस synaptic अनुमानों में स्थिर अभिव्यक्ति तक पहुंचने के लिए और कपाल खिड़की के लिए पूरी तरह से ठीक है और स्थिर करने के लिए यह अवधि पर्याप्त है। जानवरों के एक आदेश पिंजरे साथियों द्वारा कपाल खिड़की प्रत्यारोपण के हटाने को रोकने के लिए रखा जाना चाहिए। एक बढ़े हुए पिंजरे के उपयोग के आदेश धातु सलाखों मार से कपाल खिड़की के आकस्मिक नुकसान से बचने के लिए विचार किया जा सकता है। समझौता ज्ञापन पर स्थिर निर्धारणखुर्दबीन के नीचे एसई आवश्यक है। श्वास आंदोलनों सहित किसी भी सिर आंदोलन, प्राप्त छवियों की गुणवत्ता में काफी कमी हो सकती है। यह भी उपयोगी है, उद्देश्य के लिए क्षैतिज कपाल खिड़की की स्थिति विंडो के पूरे विमान के लिए बराबर फोकस प्राप्त करने के साथ संभावित समस्याओं को सीमित करने के लिए है। हल करने कांटा और BOUTONS के लिए स्पष्ट मानदंड लागू किया जाना चाहिए। आम तौर पर, BOUTONS एक व्यास के कम से कम 3 बार पूर्ववर्ती फाइबर 7 से भी बड़ा होने axonal सूजन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। कांटा डेन्ड्राइट शाफ्ट कि एक बल्बनुमा सिर होते से स्पष्ट रूप से पहचाने उभार के रूप में परिभाषित कर रहे हैं। पतली, ठूंठदार, मशरूम और branched कांटा की आबादी में आगे विभाजन संभव 3 है। दो photon माइक्रोस्कोपी के अपेक्षाकृत गरीब अक्षीय संकल्प के कारण, कांटा कि ऑप्टिकल अक्ष के साथ परियोजना के विश्लेषण 3 से बचा जाना चाहिए। आदेश में स्पष्ट रूप से कार्यात्मक BOUTONS और कांटा, एक पोस्ट अस्थायी immunolabeling भेद करने मेंआदेश में पूर्व और postsynaptic मार्कर 7 की पहचान करने में किया जा सकता है।

हालांकि प्रस्तुत प्रोटोकॉल हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन में सबसे अनुकूल साबित हुई, यह क्रम में विभिन्न प्रयोगात्मक लक्ष्यों को फिट करने के लिए इसे संशोधित करने के लिए संभव है। कभी कभी यह अधिक isoflurane की बजाय (जैसे ketamine-xylasine के रूप में) इंजेक्शन संज्ञाहरण उपयोग के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह पर्याप्त रूप से, खुराक को समायोजित करने के लिए विभिन्न प्रकारों, उम्र और सेक्स के चूहों के बीच दवा संवेदनशीलता में मतभेद मन में रखते हुए महत्वपूर्ण है। यह बर बजाय ड्रिलिंग के लिए एक गोलाकार एक के एक trepan का उपयोग करना संभव है, लेकिन यह ड्यूरा को होने वाले नुकसान के खतरे को बढ़ा सकता है। बाँझ खारा सफलतापूर्वक कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (ACSF) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन इसे तैयार करने और ऑपरेशन के दौरान हर समय यह बाँझ रखने के लिए महत्वपूर्ण है। ACSF तैयारी के बाद 3-4 सप्ताह के लिए स्थिर है, और अगर किसी भी संक्रमण इस समय से पहले होता है इसे तुरंत खारिज किया जाना चाहिए। अलग सिर fixatiउपकरणों पर दो photon माइक्रोस्कोप के तहत जाग माउस के अवलोकन की संभावना सहित प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर लागू किया जा सकता है।

किसी भी अन्य तकनीक के रूप में, यह एक भी अपनी सीमाएं हैं। दो photon माइक्रोस्कोप ड्यूरा की सतह से 500 माइक्रोन गहरी करने के लिए मस्तिष्क के ऊतकों अप के दृश्य के लिए अनुमति देता है। गहरी मस्तिष्क संरचना की परीक्षा के लिए अतिरिक्त संशोधनों के लागू किया जाना चाहिए। हमारी प्रोटोकॉल आरएससी के अधिकांश के लिए उपयोग की अनुमति देता है, लेकिन संरचना बेहतर बाण साइनस के नीचे छिपा का हिस्सा अभी भी सुलभ नहीं है। दो photon माइक्रोस्कोप का संकल्प एक विशिष्ट अन्तर्ग्रथन की पहचान के रूप में अच्छी तरह से वृक्ष के समान spines की विस्तृत रूपात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त नहीं है। ऐसे correlative इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में अतिरिक्त तकनीक, आदेश में एक संदिग्ध संरचना के अस्तित्व की पुष्टि करने के लिए लागू किया जाना चाहिए। यह भी है कि यह एक अपेक्षाकृत मुश्किल सर्जिकल तकनीक है उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है और यह सिफारिश नहीं हैएक अनुभवहीन ऑपरेटर के लिए mmended।

प्रस्तुत तकनीक के प्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला में लागू किया जा सकता है। यह दो photon माइक्रोस्कोप के साथ सुलभ अलग मस्तिष्क क्षेत्रों की जांच के लिए संशोधित किया जा सकता है। यह संज्ञानात्मक प्रक्रियाओं सहित और उम्र बढ़ने या तंत्रिका संबंधी और मनोरोग की स्थिति की प्रगति को शारीरिक और रोग राज्यों की विविधता के दौरान axonal और वृक्ष के समान परिवर्तन के एक साथ निगरानी में सक्षम बनाता है। यह सेल विशिष्ट प्रमोटरों का उपयोग ठीक से परिभाषित न्यूरोनल सबसेट पर होने वाले अनुमानों कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। यह भी जाग और व्यवहार जानवरों पर प्रयोग के प्रोटोकॉल फिट करने के लिए समायोजित किया जा सकता है। इसके अलावा, कैल्शियम या pH- संवेदनशील प्रोटीन आदेश न केवल न्यूरोनल आकृति विज्ञान कल्पना करने में मस्तिष्क में व्यक्त किया जा सकता है लेकिन यह भी सेल गतिविधि और समारोह में बदलता है। दृष्टिकोण का एक अन्य संभावित संशोधन mCherry अभिव्यक्ति के लिए एक अलग rAAV सीरोटाइप का इस्तेमाल होता है। कैमेरिक 2/1 सीरोटाइप जनसंपर्कovides पर्याप्त तेजी से शुरू होने (2-3 सप्ताह) के साथ इंजेक्शन स्थल पर मजबूत अभिव्यक्ति। mCherry स्तरों प्रारंभिक शुरू होने के बाद कम से कम 12 हफ्तों के लिए स्थिर बनी हुई है और कोई प्रतिगामी लेबलिंग हमारे प्रयोगों में पाया गया था। आदेश प्रतिगामी लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, एक अलग तरह के सीरोटाइप rAAV9 के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इमेजिंग सत्र के किसी भी आवृत्ति पर किया जा सकता है, लेकिन कम से कम 24 घंटे की अंतराल आदेश संज्ञाहरण के बाद पशु के समुचित वसूली अनुमति देने के लिए सिफारिश की है। अगर ठीक से लागू किया, इस तकनीक को कई महीनों के पाठ्यक्रम पर एक ही क्षेत्र के कई इमेजिंग सत्र के प्रदर्शन की अनुमति देता है। लंबी अवधि के प्रयोगों (अब से 6 महीने) के लिए, एक Cre / LoxP प्रणाली एक floxed GFP माउस लाइन में एएवी वेक्टर के साथ दिया Recombinase के साथ प्रयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों (के.एल., एमआर, के.आर.) धारक इस लेख में इस्तेमाल फ्रेम के लिए लंबित (PL410001) पेटेंट के लिए अधिकार नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों फिल्माने के साथ सहायता के लिए आवाज रिकॉर्डिंग, चित्र के लिए एम Borczyk, वायरस उत्पादन के लिए ए Trąbczyńska, जीनोटाइपिंग के लिए एम Ziókowska और ए Mirgos के लिए एम Steczkowski को धन्यवाद देना चाहूंगा। केआर पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस (rAAV) लालकृष्ण Deisseroth से CaMK प्रमोटर के नियंत्रण के तहत फ्लोरोसेंट प्रोटीन mCherry व्यक्त की तरह का उपहार स्वीकार करता है। इस परियोजना के पशु मॉडल और ऊतक संरचना और समारोह, तंत्रिका जीव विज्ञान, प्रायोगिक जीवविज्ञान के Nencki संस्थान के केंद्र की प्रयोगशाला की प्रयोगशाला के मूल सुविधाओं पर बाहर किया गया था, यूरोपीय संघ द्वारा वित्त पोषण घूमने के अलावा बुनियादी सुविधाओं के उपयोग के साथ - भीतर यूरोपीय क्षेत्रीय विकास निधि आपरेशनल कार्यक्रम "अभिनव अर्थव्यवस्था" 2007-2013 के लिए। यह काम राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था: सोनाटा बीआईएस 2012/05 / ई / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / एम / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / डब्ल्यू / NZ24 / 00,691 के.आर. और सोनाटा बीआईएस 2014 / 14 / ई / NZ4 / 00172 आर सी के लिए

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Drug
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 5-2% pre-operative
Isoflurane Baxter AErrane 8DG9623 1.5-2% during surgery
Dexametasone Scan Vet Dexasone 2mg/ml 0.2 mg/kg intramuscular
Baytril Bayer 2.50% 5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine Vetoquinol 4% 4 mg/kg subcutaneously
Butomidor Richter Pharma 10 mg/ml 2 mg/kg subcutaneously
Carprofen KRKA-Polska Rycarfa 50mg/ml 10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine Jelfa Lignocainum topically
Lidocaine Jelfa 20 mg/g topically
Surgery
Gelfoam Ethicon Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment Dedra Lubrithal topically
CA glue Pelikan Daniel 20G Huste
Dental acrylic SpofaDental Duracryl Plus
Stereotaxic frame Stoelting 51500D
Tool
Coverglass Harvard Apparatus HSE-64-0720 3 mm diameter
Dental drill Sigmed Keystone KVet
Fixation bar Custom made N/A M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps Renex PN-7B-SA
Micro scissors Falcon BM.183.180
Dissection microscope KOZO XTL6445T
Imaging
Holder frame Custom made N/A
Two-photon microscope Zeiss Upright Axio Examiner Z1 Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. 
Reagent
Virus gift from K. Deisseroth Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 109 Retrosplenial प्रांतस्था हिप्पोकैम्पस दो photon माइक्रोस्कोपी Thy1-GFP माउस, पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरस
एक साथ दो-फोटान<em&gt; Vivo</em&gt; माउस Retrosplenial कोर्टेक्स में अन्तर्ग्रथनी आदानों की इमेजिंग और postsynaptic लक्ष्य
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Łukasiewicz, K., Robacha, M.,… More

Łukasiewicz, K., Robacha, M., Bożycki, Ł., Radwanska, K., Czajkowski, R. Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex. J. Vis. Exp. (109), e53528, doi:10.3791/53528 (2016).

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