Introduction
Microscopia a due fotoni rivoluzionato l'osservazione di attività cerebrale nel vivere e di comportarsi animali. Dalla sua introduzione nel 1990 ha rapidamente guadagnato popolarità ed è ora implementato come uno degli approcci più interessanti e innovative verso l'esame di numerosi aspetti dell'attività cerebrale in vivo 1,2. Queste applicazioni includono le misurazioni del flusso sanguigno, attivazione neuronale (ad esempio, utilizzando indicatori di livello di calcio o di geni precoci immediati espressione) e la morfologia delle cellule neuronali. Un numero crescente di laboratori utilizzano microscopi a due fotoni, l'attuazione della tecnica in tutto il mondo scientifico come un nuovo standard per l'imaging in vivo del cervello.
L'approccio standard prevede l'impianto della finestra del cranio (un foro rotondo nel cranio coperto con una copertura in vetro) oltre il barile o corteccia visiva del cervello di topo 3. Successivamente, a seconda del protocollo sperimentale, il mouse subisce una serie di visualizzazione e allenamenti comportamentali, consentendo di monitorare i cambiamenti nell'attività cerebrale e la morfologia neuronale nel tempo 4,5. In entrambi i casi il craniotomia interessa solo l'osso parietale, senza attraversare le suture. È ampiamente ritiene che il principale svantaggio di questa tecnica è la limitata applicazione cortecce facilmente accessibili come il barile o corteccia visiva. L'impianto della finestra del cranio su altre regioni pone molte difficoltà, a causa di eccessivo sanguinamento e / o ostacoli spaziale.
In questo articolo si propone l'impianto della finestra del cranio sopra la corteccia retrosplenial (RSC) come un'altra possibile regione di interesse per due fotoni in vivo microscopia a 6. RSC è un elemento importante del circuito di cervello responsabile per la formazione della memoria spaziale. Anatomicamente, RSC è una parte di una rete neuronale che collega corticale, ippocampo, talamo e le regioni 7. Èpesantemente coinvolti in una serie di comportamenti, quali l'apprendimento spaziale e l'estinzione, così come la navigazione spaziale 6.
Al fine di visualizzare i cambiamenti morfologici dei neuroni che usiamo una linea di topo transgenico che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il promotore Thy1. In questi topi, GFP è espressa in circa il 10% dei neuroni nel cervello consentendo chiara visualizzazione degli assoni e dendriti corticali utilizzando microscopia a due fotoni 8. Un'altra innovazione che vi proponiamo è l'iniezione di un ricombinante adeno-associato virus sierotipo 2/1 (rAAV2 / 1) che codifica una proteina fluorescente rossa (mCherry) in una specifica-neurone CaMKII promotore 9 nelle strutture profonde del cervello sporgenti di RSC , come l'ippocampo. L'espressione di rAAV2 / 1 mCherry nell'ippocampo di topo Thy1-GFP permette la visualizzazione simultanea di elementi pre-e post-sinaptici del Hippocampo-cortical sinapsi 10. L'espressione rAAV-driven di mCherry richiede due o tre settimane per la proteina di raggiungere livello sufficiente nei terminali degli assoni. Questo periodo è coerente con il solito tempo richiesto per il recupero di craniotomia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure sperimentali descritte di seguito sono stati approvati dal Comitato Etico Locale presso l'Istituto Nencki of Experimental Biology, Accademia polacca delle scienze.
Nota: Alcune delle scene del video associato sono accelerati. Fattore di velocità è indicata in queste scene.
1. Chirurgia Preparazione
- Sterilizzare tutti gli strumenti, contenitori di vetro per liquidi e tamponi di cotone in autoclave. Utilizzare guanti superflui. Pulire il tavolo operatorio, il telaio stereotassico e tutta l'area circostante con il 70% di etanolo. Utilizzare un tampone sterile chirurgica per creare uno spazio sterile per tutte le attrezzature sterilizzato. Tagliare Gelfoam in piccoli pezzi e ammollo in soluzione fisiologica sterile.
Nota: Secondo la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, l'etanolo non è né un sterilizzante, né un disinfettante di alto livello. Dovrebbe essere usato solo come un detergente / sgrassante su superfici già sterilizzati. - Mettere l'animale in the camera di induzione e impostare il livello isoflurano al 5% e il flusso di ossigeno a 2 L / min. Questa procedura dovrebbe durare circa 3 min.
- Prendere l'animale dalla camera di induzione. Utilizzare coda o punta pizzicotti per garantire che l'animale è completamente sedato.
- Utilizzando un trimmer precisa radere i capelli dalla parte posteriore della testa (tra le orecchie) fino agli occhi.
- Posto l'animale nel telaio stereotassico e stabilizzare la testa con barre orecchio.
- Impostare i livelli di anestesia per 1,5-2% isoflurano e 0.3 L / min di ossigeno.
- Applicare l'unguento oculare.
- Iniettare il sottocutanea animale con Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) e Baytril (5 mg / kg) per prevenire l'infiammazione, il dolore e l'infezione, rispettivamente.
- Iniettare il intramuscolare animale con desametasone (0,2 mg / kg) per prevenire il gonfiore cervello.
Nota: È possibile iniettare desametasone per via sottocutanea o intraperitoneale per evitare danni muscolari. - Pulire la pelle con stamponi di cotone terile con Betadine seguita da etanolo al 70%.
- Cambiare i guanti e spruzzarli con il 70% di etanolo.
Nota: Durante l'utilizzo di guanti usa e getta non toccare il campo sterile. Toccare l'animale solo con le punte di strumenti chirurgici sterili e tamponi sterili.
Chirurgia 2. cranica finestra
- Sollevare la pelle con una pinza e utilizzando microorganismi forbici incidere la pelle orizzontalmente lungo la base della testa e poi obliquamente al punto fronte tra gli occhi. Rimuovere il lembo cutaneo.
- Applicare lidocaina pomata con un tampone sterile sul periostio per evitare un eccessivo sanguinamento e dolore.
- Usare tamponi di cotone sterili o un bisturi per rimuovere il periostio. Asciugare il cranio con tamponi sterili.
- Utilizzando un ago sterile applicare colla cianoacrilato densa sui bordi della pelle per immobilizzare loro e per evitare il contatto con il cemento dentale. Attendere che la colla si asciughi.
- Lay uno sterile 3 millimetri coprioggetti sopra tegli cranio anteriormente alla sutura lambdoidea. Centrare il vetrino a RSC coordinate: AP, bregma -2.8; ML, bregma 0. Mark bordi coprioggetto da graffiare la superficie del cranio con un ago sterile. Mettere il coprioggetti nel contenitore sterile, con il 70% di etanolo.
- Utilizzare un trapano dentistico ad alta velocità con una piccola bava di diametro per delineare un cerchio del diametro di 3 mm. Pulire il sito di perforazione dalla polvere di osso con soluzione salina sterile tamponi immersi. Utilizzare il Gelfoam e tamponi per fermare l'emorragia occasionale e pulire l'osso.
- Tra foratura controllare lo spessore osseo con una pinza sottile toccando delicatamente il cerchio dell'osso e controllando la sua mobilità. Tenere presente che l'osso è più spessa sulla superficie della sutura. Fermare la perforazione quando il cerchio osso è mobile e solo un pari, sottile strato di tessuto osseo viene lasciato sulla circonferenza. Pulire il campo operativo di tutta la polvere osso residuo con soluzione salina immerso tamponi.
- Eliminare la soluzione salina sterile nella zona di perforazione, che copre il cir foratoCLE. Scalzare con cura il cerchio osso con una pinza sottile e poi delicatamente ma con fermezza rimuovere l'osso sollevandolo verso l'alto. Fare attenzione a non inclinare il cerchio osso mentre lo si solleva per evitare possibili danni alla dura.
- applicare delicatamente la Gelfoam imbevuta di soluzione salina sterile sulla dura per aiutare a fermare l'emorragia. Attendere fino a quando tutto il sanguinamento è completamente interrotta. Rimuovere con attenzione il Gelfoam non disturbare il processo di coagulazione.
Nota: l'area di sutura è altamente vascolarizzata, in modo che il sanguinamento a questo punto potrebbe rivelarsi profonda. È indispensabile attendere il tempo sufficiente per il sanguinamento si fermi completamente. È utile mantenere l'Gelfoam imbevuta di soluzione salina raffreddato mettendolo in ghiaccio.
3. Virus iniezione
- Fissare la pompa di infusione alla torre stereotassica e collegare il controller.
- Inserire l'ago 35G nella siringa. Lavare la siringa 10 volte con etanolo per sterilizzare e 10 volte con soluzione salina sterile per rimuovere le tracce di ethanol. Rimuovere le bolle d'aria dalla siringa. Inserire la siringa nella pompa.
Nota: Si consiglia di utilizzare altri disinfettanti. - Scongelare una singola dose di rAAV2 / 1 preparazione mCherry (si consiglia 10 12 pfu) e tenerlo in ghiaccio. Riempire la siringa con la soluzione di virus.
- Centrare l'ago sulla bregma e quindi inserire delicatamente nella ippocampo utilizzando le seguenti coordinate: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. Queste coordinate saranno situati vicino al bordo della craniotomia. Attendere per 5 minuti per il tessuto si stabilizzi.
- Iniettare 0,7 ml di soluzione di rAAV2 / 1 mCherry alla velocità di 50 nl / min. Attendere 10 minuti per il virus di adsorbire completamente. Rimuovere delicatamente l'ago. Tamponare con Gelfoam in caso di sanguinamento. Ripetere con il sito controlaterale.
4. cranica Finestra Implantation
- Lay sterile, coverglass secca sulla parte superiore della dura nel telaio del cerchio forato. Tenere il coprioggetti con la forceps per appiattire delicatamente la dura e portare coverglass 'bordi più vicino alla superficie del cranio.
Nota: E 'possibile che il coprioggetti sconvolge il coagulo e la riprende sanguinamento. Se questo è il caso, sollevare il coprioggetti, metterlo in alcool, asciutto e tornare al punto 2.9. - Usando un ago sterile applicare la colla cianoacrilato densa sui bordi di coperture vetrose per il fissaggio al cranio. Attendere che la colla si asciughi.
- Mettere una barra di fissaggio (M2 dado o un disegno su ordine) nella parte anteriore del cranio. Applicare la colla cianoacrilato oltre i bordi della barra. Attendere che la colla si asciughi.
- Posizionare la barra di fissaggio in una posizione che consenta il posizionamento orizzontale della finestra cranica durante l'imaging sessione. Posizionare il più lontano possibile dal finestrino. Se è posizionato troppo vicino alla finestra, la barra e la vite di collegamento con il supporto misura potrebbero rappresentare un ostacolo per l'obiettivo durante il processo di imaging.
- Creare un berretto con l'acrilico dentale, che copre il resto della zona operativa, bordi cutanei, bar fissazione, rafforzando il cratere intorno alla finestra cranica. Attendere che il cemento dentale per indurire.
- Rimuovere l'animale dal telaio stereotassico e metterlo nella camera di recupero.
- Attendere che l'animale per recuperare da un intervento chirurgico nel rispetto delle funzioni fisiologiche.
- Applicare analgesia post-operatoria (carprofen, 10 mg / kg) e il trattamento antibiotici (Baytril, 5 mg / kg) per 48 ore.
5. Imaging
- Avviare il laser Ti: zaffiro, accendere il microscopio. Il sistema utilizzato in questo esperimento è dotato di un laser a due fotoni, sistema OPO e doppio PMT GaAsP.
- Mettere l'animale nella Induccamera di e indurre l'anestesia.
- Rimuovere l'animale dalla camera di induzione e posto nella maschera anestesia gas sotto il microscopio. Diminuire il flusso di ossigeno al 0,3 L / min e la concentrazione isoflurano al 1,5-2%.
- Fissare l'animale a stativo personalizzato con una vite M2 (o un altro sistema personalizzato). Livellare la finestra del cranio.
Nota: È possibile utilizzare il sistema di fissaggio della testa del produttore microscopio, anche se il telaio personalizzato specifico dà risultati migliori (migliore stabilità testa, costante posizionamento in più sessioni durante un esperimento cronica). - Utilizzando le impostazioni del microscopio widefield e un basso centro obiettivo di ingrandimento della vista su uno dei lati della corteccia retrosplenial e concentrarsi sulla superficie vetrino.
- Applicare una goccia d'acqua nel pozzo acrilico crateriforme. Passare a un obiettivo di immersione in acqua a lunga distanza. Spostare l'obiettivo verso la finestra del cranio fino a quando l'aria l'acqua del meniscoUnisce il campione e obiettivo.
- Passare alle impostazioni di due fotoni e iniziare la scansione del campione superiore a fondo utilizzando lo zoom più basso. La traversata di dura madre sarà visibile come un bagliore di segnale non specifico alta.
- Regolare le impostazioni di acquisizione microscopio in entrambi i canali (GFP e mCherry) secondo la potenza del segnale da cellule fluorescenti in modo da coprire l'intera gamma dinamica.
- Dopo aver trovato un neurone adeguata (con l'albero dendritiche separata da altre cellule) eseguire una scansione iniziale utilizzando solo il filterset GFP con lo zoom più basso e Z-distanza di 5 micron.
- Ottenere una proiezione massima dello stack scansionato e stamparlo per le annotazioni (utilizzando colori invertiti).
- Impostare lo zoom su un valore che permetterà di immagine i dettagli morfologici desiderati. Immagine l'intero albero dendritiche nei canali GFP e mCherry con proiezione massima di guida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L'espressione di GFP in un sottoinsieme di neuroni nel topo giornalista Thy1-GFP permette imaging in vivo dei dendriti corticali e proiezioni assonale locali a RSC. Figura 1A mostra proiezione massima di una pila di immagini con più dendriti GFP-positive visibili. Il corpo cellulare è oscurata da un'arteria. Figura 1B mostra un'immagine ingrandita solo piano (zoom digitale 3x) del ramo dendritico indicato 1A. Dettagli di morfologia dendritica (spine, filopodi) sono chiaramente visibili. Il canale GFP viene acquisita utilizzando il filtro passa banda di emissione 500-550 nm.
Un'iniezione di rAAV2 / 1 mCherry nelle dell'ippocampo dorsale permette la visualizzazione degli assoni dell'ippocampo e boutons sinaptica terminano in RSC. Questi terminali possono essere rilevati nel canale mCherry (l'emissione passa banda filtro 570-610 nm).
Figura 1. Due canali in vivo due fotoni di imaging di neuroni dell'ippocampo RSC e proiezioni a RSC. (A) Una panoramica delle cellule GFP che esprimono in un frammento di RSC (immagine mostrata in colori invertiti). sporgenza massima mostrato di una pila di spessore di 100 micron prese a basso ingrandimento (0,7x zoom digitale). (B) piano ottico standard del frammento indicato in (A) acquisita ad alto ingrandimento (3x zoom digitale) nel canale GFP. (C) singolo frammento piano ottico indicato in (A) utilizzando le impostazioni di acquisizione mCherry. Vedere Protocollo per i dettagli dei filtri di rilevamento. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nel documento corrente vi presentiamo un protocollo per la simultanea a due fotoni imaging in vivo degli ingressi sinaptici e gli obiettivi post-sinaptici in RSC attraverso una finestra cranica. La procedura di impianto è composto da diversi passaggi chiave. Innanzitutto, l'animale è profondamente anestetizzati e fissato nel telaio stereotassico, poi il cranio sopra RSC viene diluito con un trapano lungo le linee circolari segnalati e l'osso circolare viene rimosso. Dopo l'emorragia viene arrestato, il rAAV2 / 1 mCherry viene iniettato nel ippocampo, e il vetro di copertura è fissato al cranio sopra la zona forata. Infine la barra di fissaggio viene fissata sulla testa e l'animale viene posto nella camera di recupero per 48 ore. Dopo circa 2-3 settimane necessarie per l'espressione del virus, l'RSC può essere visualizzato. Il protocollo di imaging comprende i seguenti passaggi. Innanzitutto, l'animale è anestetizzato e fissato al microscopio. L'attenzione viene quindi impostato utilizzando il microscopio widefield, il sistema è SWItched nella modalità a due fotoni ei canali di interesse (GFP e mCherry) vengono visualizzati.
La tecnica presentata offre un notevole miglioramento rispetto ai protocolli descritti in precedenza. Nell'approccio standard solo tipo di etichetta potrebbe essere rilevato. Potrebbe essere usato per un'immagine locale proiezioni assonale e alberi dendritiche, ma non esistono studi a lungo raggio connettività fosse possibile. Grazie alla combinazione di due proteine fluorescenti abbiamo attivato tracciamento simultaneo di elementi pre-e post-sinaptici. Ciò consente il monitoraggio a lungo termine in vivo di connessioni sinaptiche putativi.
Per ottenere i risultati ottimali nella procedura descritta, è importante prestare attenzione a diversi passaggi critici. Durante il sollevamento del cerchio dell'osso nel passaggio 2.8 danni alla dura può causare infiammazione e compromettere la trasparenza della finestra cranica. arresto insufficiente delle emorragie in fase 2.9 o in qualsiasi altro punto della procedura si traduce in accumulat sangueione sotto la finestra e riduce significativamente il campo di vista. Dopo aver iniettato il virus è indispensabile attendere almeno 10 minuti prima di rimuovere l'ago, affinché il virus di infondere nel tessuto al solo sito di iniezione. Esso limita la possibilità di infezione indesiderata della corteccia con il virus durante la rimozione dell'ago. L'area della trasfezione virale dovrebbe essere esaminata con un'analisi post hoc istologica del tessuto cerebrale. Qualsiasi espressione mCherry nelle cellule lungo la traccia ago deve essere evitato. Il tempo di recupero standard è di 3 settimane. Tale periodo è sufficiente per il virus di raggiungere espressione stabile nelle proiezioni sinaptiche e per la finestra cranica di guarire completamente e stabilizzare. Gli animali dovranno essere singola alloggiati al fine di impedire la rimozione della finestra protesi cranica dai compagni di gabbia. L'impiego di una gabbia allargata potrebbe essere considerato per evitare danni accidentali della finestra cranica colpendo le barre metalliche. fissazione stabile del mouse al microscopio è essenziale. Qualsiasi movimento della testa, compresi i movimenti respiratori, può causare una significativa riduzione della qualità delle immagini ottenute. E 'anche utile per posizionare la finestra cranica orizzontale all'obiettivo, di limitare eventuali problemi all'acquisizione uguale attenzione per l'intero piano della finestra. criteri chiari per risolvere spine e boutons devono essere applicate. Generalmente, boutons sono definiti come gonfiori assonale aventi un diametro di almeno 3 volte più grande della fibra precedente 7. Spine sono definiti come sporgenze chiaramente distinguibile da l'albero dendrite che contiene la testa bulbosa. Ulteriori divisione in popolazioni di sottile, tozzo, funghi e spine ramificata è possibile 3.. A causa della risoluzione assiale relativamente povera della microscopia a due fotoni, analisi delle spine che proiettano lungo l'asse ottico deve essere evitato 3. Al fine di distinguere chiaramente boutons e spine funzionali, un post hoc immunomarcaturapuò essere effettuata per identificare marcatori pre e post-sinaptici 7.
Sebbene il protocollo presentato dimostrato di essere il più favorevole nei nostri disegni sperimentali, è possibile modificare in modo da adattarsi ai diversi obiettivi sperimentali. A volte è più adatto da usare anestesia iniettabile (come ketamina-xylasine) invece di isoflurano, ma è importante regolare adeguatamente la dose, tenendo presente le differenze nella sensibilità ai farmaci tra i topi di diversi ceppi, età e sesso. È possibile utilizzare un trapano fresa invece di una sfera per la perforazione, ma potrebbe aumentare il rischio di danni alla dura. salina sterile può essere sostituito con successo con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), ma è importante mantenere sterile in ogni momento durante la preparazione ed il funzionamento. ACSF è stabile per 3-4 settimane dopo la preparazione, e se la contaminazione si verifica prima di questo tempo dovrebbe essere immediatamente eliminata. Diversi fixati testasu dispositivi può essere applicato, a seconda del disegno sperimentale, compresa la possibilità di osservare il mouse sveglio al microscopio a due fotoni.
Come ogni altra tecnica, questo ha anche i suoi limiti. Il microscopio a due fotoni permette la visualizzazione del tessuto cerebrale fino a 500 micron in profondità dalla superficie dura. Per l'esame delle strutture cerebrali profonde devono essere applicate ulteriori modifiche. Il nostro protocollo permette l'accesso a più di RSC, ma la parte della struttura nascosta sotto il seno longitudinale superiore non è ancora accessibile. La risoluzione del microscopio a due fotoni non è sufficiente per l'identificazione di una sinapsi specifico, nonché analisi morfologica dettagliata delle spine dendritiche. Altre tecniche, come la microscopia elettronica correlativo devono essere applicate per confermare l'esistenza di una struttura sospetta. È inoltre importante ricordare che questa è una relativamente difficile tecnica chirurgica e non è recommended per un operatore inesperto.
La tecnica presentata può essere applicata in una vasta gamma di esperimenti. Esso può essere modificato per indagini di diverse regioni del cervello accessibili con il microscopio a due fotoni. Consente il monitoraggio simultaneo di assonale e alterazioni dendritiche durante varietà di stati fisiologici e patologici, tra cui i processi cognitivi e di invecchiamento o la progressione della neurologici e psichiatrici. Esso consente l'uso di promotori specifici delle cellule per visualizzare proiezioni originari in sottoinsiemi neuronali ben definite. Può anche essere regolato per adattarsi ai protocolli di esperimenti su animali svegli e di comportarsi. Inoltre, le proteine sensibili calcio-o del pH possono essere espressi nel cervello al fine di visualizzare non solo la morfologia dei neuroni ma anche cambiamenti nelle attività delle cellule e la funzione. Un'altra possibile modifica del metodo è l'uso di un differente sierotipo rAAV per l'espressione mCherry. Il chimerico pr 2/1 sierotipoovides robusta espressione al sito di iniezione con sufficientemente rapida insorgenza (2-3 settimane). I livelli mCherry è rimasto stabile per almeno 12 settimane dopo l'insorgenza iniziale e nessuna marcatura retrograda è stata rilevata nei nostri esperimenti. Per ottenere marcatura retrograda, un sierotipo differente potrebbe essere utilizzato, ad esempio rAAV9. Le sessioni immagini vengono eseguite a qualsiasi frequenza, comunque almeno intervallo di 24 ore è raccomandato per consentire il corretto recupero dell'animale dopo anestesia. Se applicato correttamente, questa tecnica permette di eseguire più sessioni di imaging della stessa regione nel corso di diversi mesi. Per esperimenti di lunga durata (superiore a 6 mesi), un sistema Cre / loxP può essere utilizzato con la ricombinasi consegnato con il vettore AAV in una linea GFP del mouse floxed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori (KL, MR, KR) hanno diritti di brevetto in sospeso (PL410001) per fotogramma Holder usato in questo articolo.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare M. Steczkowski per registrazioni vocali, M. Borczyk per i disegni, A. Trąbczyńska per la produzione di virus, M. Ziókowska per la genotipizzazione e A. Mirgos per l'assistenza con le riprese. KR riconosce il dono tipo di virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che esprime una proteina fluorescente mCherry sotto il controllo del promotore CaMK da K. Deisseroth. Questo progetto è stato realizzato presso le strutture fondamentali del Laboratorio di modelli animali e laboratorio di tessuti Struttura e funzione, Centro di Neurobiologia, Nencki Istituto di Biologia Sperimentale, con l'utilizzo delle infrastrutture Cept finanziato dall'Unione Europea - Fondo Europeo di Sviluppo regionale all'interno del programma operativo "Economia innovativa" per il periodo 2007-2013. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 per KR e Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
