Samtidig To-foton Published: March 13, 2016 doi: 10.3791/53528

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kacper Łukasiewicz*¹, Magdalena Robacha*¹, Łukasz Bożycki², Kasia Radwanska¹, Rafał Czajkowski³

¹Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, ²Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, ³Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

* These authors contributed equally

Introduction

To-foton mikroskopi revolusjonert observasjon av hjernens aktivitet i levende og oppfører seg dyr. Siden introduksjonen i 1990 det raskt vunnet popularitet og er nå implementert som en av de mest interessante og nyskapende tilnærminger til undersøkelse av mange aspekter av hjernens aktivitet in vivo ^1,2. Disse programmene omfatter blodstrømsmåling, neuronal aktivering (for eksempel ved hjelp av kalsium nivåindikatorer eller umiddelbare tidlige gener uttrykk) og morfologi av nerveceller. Et økende antall laboratorier bruker to-foton mikroskop, implementere teknikken i hele den vitenskapelige verden som en ny standard for in vivo avbildning av hjernen.

Standarden tilnærming innebærer implantering av kranie vinduet (et rundt hull i kraniet dekket med et dekkglass) over løpet eller visuelle cortex av mus hjernen ^tre. Neste, avhengig av den eksperimentelle protokollen, mouse gjennomgår en serie av visualisering og atferdsmessige kurs, slik at for å overvåke endringer i hjerneaktivitet og neuronal morfologi over tid ^4,5. I begge tilfeller kraniotomi påvirker bare isse benet, uten å krysse suturene. Det er i stor grad antas at den viktigste ulempen av teknikken er dens begrensede søknad til lett tilgjengelige cortexes eksempel fat eller visuell cortex. Implantasjon av kranie vinduet over andre områder utgjør en rekke vanskeligheter, på grunn av overdreven blødning og / eller romlig hindring.

I denne artikkelen foreslår implantasjon av den kraniale vinduet ovenfor retrosplenial cortex (RSC) som et annet mulig område av interesse for to-foton in vivo ⁶ mikroskopi. RSC er en viktig del av hjernen krets ansvarlig for romlig minne formasjon. Anatomisk, RSC er en del av en nevronale nettverk å koble cortical, hippocampus, og thalamic regioner ^7. Det ersterkt involvert i en rekke atferd, for eksempel romfølelse og utryddelse samt romlig navigasjon ^seks.

For å visualisere de morfologiske endringer av nevroner bruker vi en transgen muselinje som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under thy1 promoteren. I disse musene, er GFP uttrykt i omtrent 10% av nevronene i hjernen som muliggjør klar visualisering av kortikale aksoner og dendritter ved hjelp av to-foton mikroskopi ^8. En annen oppfinnelse som vi foreslår er injeksjon av en rekombinant adeno-assosiert virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) som koder et rødt fluorescerende protein (mCherry) under en neuron-spesifikk promoter CaMKII ⁹ inn i de dypere strukturer i hjernen som rager til RSC , slik som hippocampus. Ekspresjonen av rAAV2 / 1 ^mCherry i hippocampus av Thy1-GFP mus muliggjør samtidig visualisering av pre- og postsynaptisk elementer av Hippocampo-Cortiçal synapser ^10. Den rAAV-drevet ekspresjon av mCherry krever to til tre uker for proteinet for å oppnå et tilstrekkelig nivå i de aksonale terminalene. Denne perioden er i overensstemmelse med den vanlige tid som kreves for utvinning fra kraniotomi.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av lokale etiske komiteen ved NENCKI Institute of Experimental Biology, polske Academy of Sciences.

Merk: Noen av scenene i den tilhørende videoen blir akselerert. Hastighetsfaktor er angitt i disse scenene.

1. Kirurgi Forberedelse

1. Sterilisere alle verktøy, glass beholdere for væsker og bomullspinner i autoklaven. Bruk unnværlig hansker. Rengjør kirurgisk tabellen, stereotaxic ramme og hele området rundt med 70% etanol. Bruk en steril kirurgisk pad for å skape en steril plass for hele sterilisert utstyr. Skjær gelfoam i små biter og suge dem i sterilt saltvann.
   Merk: I henhold til Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr, er etanol verken en steriliserings eller et høyt nivå desinfeksjonsmiddel. Det bør bare brukes som en rengjøring / avfetting agent på forhånd steriliserte overflater.
2. Sett dyret i the induksjon kammeret og setter isofluran nivå til 5%, og oksygentilførselen til 2 l / min. Denne prosedyren bør ta ca 3 min.
3. Ta dyret ut av induksjonskammeret. Bruk hale eller tå klyper for å sikre at dyret er fullstendig bedøvet.
4. Ved hjelp av en presis trimmer barbere håret fra baksiden av hodet (mellom ørene) opp til øynene.
5. Plasser dyret i stereotaxic rammen og stabilisere hodet med øret barer.
6. Sett anestesi nivå til 1,5-2% isofluran og 0,3 l / min oksygen.
7. Påfør øye salve.
8. Injisere dyr subkutant med Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) og Baytril (5 mg / kg) for å forebygge inflammasjon, smerte og betennelse, respektivt.
9. Injisere dyr intramuskulært med Deksametason (0,2 mg / kg) for å forhindre hjerne svelling.
   Merk: Det er mulig å injisere Dexamethasone subkutant eller intraperitonealt å forebygge muskel skader.
10. Rens huden ved hjelp av sterile bomullspinner med Betadine etterfulgt av 70% etanol.
11. Endre hansker og spray dem med 70% etanol.
    Merk: Mens du bruker engangshansker ikke røre det sterile feltet. Trykk på dyret bare med tuppen av sterile kirurgiske instrumenter og sterile kompresser.

2. Kraniell Window Surgery

1. Løft huden med pinsett og ved hjelp av mikro saks innsnittet i huden horisontalt langs bunnen av hodet og deretter på skrå mot fronten punktet mellom øynene. Fjern skinnet klaff.
2. Påfør lidokain salve med en steril vattpinne på periosteum å hindre overdreven blødning og smerter.
3. Bruk sterile bomullspinner eller en skalpell for å fjerne periosteum. Tørk skallen med sterile kompresser.
4. Ved hjelp av en steril nål anvende tett cyanoakrylatlim på huden kantene for å immobilisere dem og for å hindre kontakt med dentalsement. Vent til limet tørke.
5. Legg en steril 3 mm dekkglass over hele than skallen anteriorly til bakhode sutur. Sentrer dekk på RSC Opplysninger: AP, bregma -2,8; ML, Bregma 0. Mark dekkglass kantene ved å skrape skallen overflaten med en steril nål. Sett coverglass tilbake i den sterile beholder med 70% etanol.
6. Bruk en høyhastighets dental drill med liten diameter Burr å skissere en sirkel 3 mm diameter. Rengjør borestedet fra bein støv med sterilt saltvann dyppet vattpinner. Bruk gelfoam og vattpinner til å stoppe en og annen blødning og rengjør bein.
7. I mellom boring sjekke benet tykkelse med fine tang ved å forsiktig berøre bein sirkel og sjekke sin mobilitet. Husk at beinet er tykkere på sutur område. Stoppe boringen når benet sirkelen er mobil, og bare et jevnt, tynt lag med beinet er igjen på omkretsen. Rengjør operative innen alle de gjenværende bein støv med saltvann dyppet vattpinner.
8. Slipp sterilt saltvann på boreområdet, som dekker boret CIRcle. lirke forsiktig bein sirkel med fin pinsett og deretter forsiktig, men bestemt fjerne beinet ved å løfte den oppover. Vær forsiktig med å forskyve bein sirkelen mens løfte det for å hindre mulig skade på dura.
9. gjelder forsiktig gelfoam dynket i sterilt saltvann på dura for å stoppe blødningen. Vent til alle blødninger er helt stoppet. Fjern forsiktig gelfoam ikke å forstyrre den clotting prosessen.
   Merk: sutur området er svært vascularized, slik at blødning på dette punktet kan vise seg å være dyp. Det er viktig å vente til tilstrekkelig tid til blødningen til å stoppe helt. Det er nyttig å holde saltvann-gjennomvåt gelfoam avkjølt ved å plassere den på is.

3. Virus Injection

1. Fest infusjonspumpe til stereotaktiske tårnet og koble kontrolleren.
2. Sett 35G nål inn i sprøyten. Spyl sprøyten 10 ganger med etanol for å sterilisere den og 10 ganger med sterilt saltvann for å fjerne spor av ethanol. Fjern luftbobler fra sprøyten. Sett sprøyten inn i pumpen.
   Merk: Vurder å bruke andre desinfeksjonsmidler.
3. Tine en enkelt dose av rAAV2 / 1 ^mCherry forberedelse (10 ¹² pfu anbefales) og holde den på is. Fylle sprøyten med virus løsning.
4. Sentrer nålen på bregma og deretter forsiktig sette inn i hippocampus ved hjelp av følgende koordinater: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Disse koordinatene vil bli plassert nær kanten av kraniotomi. Vent i 5 minutter for å stabilisere vevet.
5. Injiser 0,7 ul av rAAV2 / 1 ^mCherry oppløsning ved en hastighet på 50 nl / min. Vent 10 min for viruset å fullt absorbere. fjern nålen forsiktig. Blot med gelfoam hvis blødning oppstår. Gjenta med den kontralaterale nettstedet.

4. Kraniell Window Implantasjon

1. Lå den sterile, tørkes dekkglass på toppen av dura i det borede sirkel rammen. Hold coverglass med forceps å forsiktig flate dura og bringe dekkglass "kanter nærmere skallen overflaten.
   Merk: Det er mulig at coverglass forstyrrer blodpropp og blødning gjenopptas. Hvis det er tilfelle, løfte dekkglass, legg den i alkohol, tørr og gå tilbake til trinn 2.9.
2. Ved hjelp av en steril nål gjelder den tette cyanoakrylatlim på dekkglass kantene for å feste dem til skallen. Vent til limet tørke.
3. Plasser en fiksering bar (M2 mutter eller en skreddersydde design) i den fremre delen av hodeskallen. Påfør cyanoakrylatlim over kanten av baren. Vent til limet tørke.
   1. Plasser fiksering bar i en posisjon som gjør at horisontal posisjonering av kraniale vinduet under bildebehandling økten. Plasser den så fjernt som mulig fra vinduet. Hvis den er plassert for nær vinduet, kanskje baren og skruen som forbinder den med skreddersydde holder posere som et hinder for målet under bildeprosessen.
4. Lag en cap med dental akryl, som dekker resten av operasjonsområdet, hud kanter, fiksering bar, forsterkende krateret rundt kranie vinduet. Vent til dental sement å stivne.
5. Ta dyret fra stereotaxic ramme og sette det inn i recovery kammeret.
6. Vent for dyret å komme seg etter operasjonen mens observere fysiologiske funksjoner.
7. Anvende postoperativ analgesi (carprofen, 10 mg / kg) og antibiotikabehandling (Baytril, 5 mg / kg) i 48 timer.

5. Imaging

1. Start Ti: Sapphire laser, strøm opp mikroskopet. Systemet anvendt i dette eksperiment er utstyrt med en to-foton laser, OPO system og dobbel Gaasp PMT.
2. Sett dyret i induckammer og indusere anestesi.
3. Ta dyret fra induksjon kammer og plass i gassanestesi masken under mikroskopet. Redusere oksygenstrømmen til 0,3 l / min, og isofluran konsentrasjon til 1,5-2%.
4. Fest dyret til tilpasset mikroskop ramme med et M2 skrue (eller et annet tilpasset system). Nivå kranie vinduet.
   Merk: Det er mulig å bruke mikroskop produsentens hodet fiksering system, selv om den spesifikke tilpassede rammen gir bedre resultater (forbedret hodet stabilitet, konstant posisjonering i flere økter i løpet av en kronisk eksperiment).
5. Ved hjelp av de Vidfelt mikroskop innstillinger og en lav forstørrelse objektiv sentrere visning på en av sidene av retrosplenial cortex og fokusere den på dekkflaten.
6. Anvende en dråpe av vann inn i den kraterlignende akryl brønnen. Bytt til en lang avstand vann nedsenking objektiv. Flytt målet mot hjerne vinduet før vannet menisken connects prøven og objektiv.
7. Bytt til to-foton innstillinger og begynne å skanne prøve topp til bunn ved hjelp laveste zoom. Kryssing av dura mater vil være synlig som et gjenskinn av høy uspesifikk signal.
8. Juster mikroskop oppkjøps innstillingene i begge kanaler (GFP og mCherry) i henhold til signalstyrken fra fluorescerende celler for å dekke hele det dynamiske området.
9. Etter å finne en passende nevron (med dendrittiske tre skilt fra andre celler) utføre en innledende skanning ved hjelp av bare GFP filterset med lavest zoom og z-avstand på 5 mikron.
10. Skaff en maksimal projeksjon av det skannede stabelen og skrive den ut for merknader (med inverterte farger).
11. Sett zoom til en verdi som vil tillate å avbilde de ønskede morfologiske detaljer. Bilde hele dendrittiske tre i GFP og mCherry kanaler som bruker høyeste anslaget som guide.

Representative Results

Uttrykket av GFP i en undergruppe av nevroner i Thy1-GFP reporter mus tillater in vivo avbildning av kortikale dendritter og lokale aksonal anslagene i RSC. Figur 1A viser maksimal projeksjon av en bunke bilder med flere GFP-positive dendritter synlige. Cellen kroppen er skjult av en arterie. Figur 1B viser en enkelt plan zoomet bilde (digital zoom 3x) av dendrittiske gren angitt i 1A. Detaljer om dendrittiske morfologi (pigger, filopodia) er godt synlig. GFP kanalen er ervervet ved å bruke band pass utslipp filter 500-550 nm.

En injeksjon av rAAV2 / 1 ^mCherry inn i dorsal hippocampus tillater visualisering av hippokampale axoner og synaptiske boutons som ender i RSC. Disse terminalene kan påvises i mCherry kanal (band pass utslipp filtrere 570-610 nm).

Figur 1. Tokanals in vivo to-foton avbildning av RSC nevroner og hippocampus fremført til RSC. (A) En oversikt over de GFP-uttrykke celler i et fragment av RSC (bildet som vises i inverterte farger). Maksimal projeksjon vist av en 100 mikrometer tykk bunke tatt ved lav forstørrelse (0,7x digital zoom). (B) En optisk plan av fragmentet er angitt i (A) ervervet ved høy forstørrelse (3x digital zoom) i GFP kanalen. (C) En optisk plan fragment er angitt i (A) ved hjelp av innhentings innstillinger mCherry. Se protokoll for detaljer om deteksjonsfiltre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

I dagens papir presenterer vi en protokoll for simultan to-foton in vivo avbildning av de synaptiske innganger og postsynaptisk mål i RSC gjennom en cranial vindu. Den implanteringsoperasjon bestå av flere viktige trinn. Først blir dyret dypt bedøvet, og festet i stereotaktisk ramme, deretter skallen i løpet av RSC er fortynnet med en drill langs de merkede sirkulære linjer, og det sirkulære ben er fjernet. Etter at blødningen er stoppet, blir den rAAV2 / 1 ^mCherry injisert i hippocampus, og dekkglasset er festet til skallen over borede området. Endelig er festelinjen er festet på hodet og dyret blir plassert i gjenvinningskammeret for 48 timer. Etter 2-3 uker er nødvendig for at viruset uttrykk, kan RSC bli visualisert. Den avbildning protokollen består av følgende trinn. Først blir dyret bedøvet og fiksert under mikroskopet. Fokuset blir da satt med vidfelt mikroskop, er systemet SWIsys inn i to-foton-modus og kanaler av interesse (GFP og mCherry) er visualisert.

Den presenterte teknikken gir en vesentlig forbedring over de tidligere beskrevne protokoller. I standardmetoden, kan kun en type av en etikett skal detekteres. Det kan brukes til bilde lokal aksonal projeksjoner og dendrittiske trær, men ingen lang rekkevidde tilkoblings studiene var mulig. Ved å kombinere to fluorescerende proteiner vi aktivert samtidig sporing av pre- og postsynaptiske elementer. Dette gjør langsiktig in vivo overvåking av mulige synaptiske forbindelser.

For å oppnå optimale resultater i den beskrevne fremgangsmåten, er det viktig å ta hensyn til flere viktige trinn. Under løfte benet sirkel i trinn 2,8 skader på dura kan føre til betennelse og svekke transparens av kranie vinduet. Utilstrekkelig stans av blødninger i trinn 2.9 eller på et annet trinn i prosedyren resulterer i blod accumulation under vinduet og i betydelig grad reduserer synsfeltet. Etter injisering av viruset er det viktig å vente i minst 10 minutter før fjerning av nålen, for viruset for å sette inn i vevet ved bare injeksjonsstedet. Det begrenser muligheten for uønsket infeksjon av hjernebarken med viruset i løpet av nålen fjernes. Arealet av det virale transfeksjon bør undersøkes med en post hoc histologisk analyse av hjernevevet. Enhver mCherry ekspresjon i celler langs nålen spor bør unngås. Standarden utvinning tid er 3 uker. Denne perioden er tilstrekkelig for at viruset skal nå stabil ekspresjon i den synaptiske anslagene og for kranie vinduet til fullstendig leget og stabilisere seg. Dyrene bør være enkelt plassert for å hindre fjernelse av den kraniale vinduet implantatet ved buret mates. Bruken av et større bur kan anses for å unngå utilsiktet skade av kranie vinduet ved å trykke på metallstenger. Stabil fiksering av mouse under mikroskop er avgjørende. Enhver hodebevegelser, inkludert pustebevegelser, kan føre til betydelig reduksjon av kvaliteten av de oppnådde bildene. Det er også nyttig å posisjonere cranial vinduet horisontalt til målet, for å begrense mulige problemer med å skaffe lik fokus for hele planet av vinduet. Klare kriterier for å løse pigger og boutons bør brukes. Vanligvis er boutons definert som aksonal hevelser med en diameter på minst 3 ganger større enn den foregående fiber ^7. Pigger er definert som klart forskjellig utstikkere fra dendrite sjakt som inneholder den oppsvulmede hodet. Videre inndeling i bestander av tynne, stubby, sopp og forgrenet pigger er mulig ^tre. På grunn av den relativt dårlige aksielle oppløsning av to-foton mikroskopi, bør analyse av pigger som stikker langs den optiske aksen unngås ^tre. For å skille klart funksjonelle boutons og pigger, en post hoc immunolabelingkan utføres for å identifisere pre- og postsynaptisk markører ^7.

Selv om den fremlagte protokoll viste seg å være den mest fordelaktige i våre eksperimentelle design, er det mulig å modifisere det for å passe til forskjellige eksperimentelle mål. Noen ganger er det mer hensiktsmessig å bruke injiserbare anestesi (som ketamin-xylasine) i stedet for isofluran, men det er viktig å tilstrekkelig justere dosen og tatt hensyn til forskjeller i resistens mellom mus av forskjellige stammer, alder og kjønn. Det er mulig å anvende en trepan bur i stedet for en sfærisk en for boring, men det kan øke risikoen for skade på dura. Sterilt saltvann med hell kan erstattes med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), men det er viktig å holde det sterilt til enhver tid under fremstilling og drift. ACSF er stabil i 3-4 uker etter tilberedning, og hvis noen forurensning inntreffer før denne gangen bør umiddelbart kastes. Forskjellige hode fixatipå anordninger kan anvendes, avhengig av eksperimentell design, herunder mulighet for å observere den våkne mus i henhold til to-foton mikroskop.

Som en hvilken som helst annen teknikk, denne har også sine begrensninger. De to-foton mikroskop tillater visualisering av hjernevevet opp til 500 um dypt fra dura overflaten. For undersøkelse av de dypere strukturer i hjernen ytterligere endringer må påføres. Vår protokollen tillater tilgang til det meste av RSC, men den del av strukturen skjult under den overlegne sagittal sinus er ennå ikke tilgjengelig. Oppløsningen av de to-foton mikroskop er ikke tilstrekkelig for identifisering av en spesifikk synapse, så vel som detaljert morfologisk analyse av dendrittutløperne. Andre teknikker, slik som korrelerende elektronmikroskopi må anvendes for å bekrefte eksistensen av en mistenkt struktur. Det er også viktig å nevne at dette er en forholdsvis vanskelig kirurgisk teknikk, og det er ikke recommended for en unexperienced operatør.

Den presenterte teknikk kan anvendes i en lang rekke eksperimenter. Den kan modifiseres for undersøkelse av forskjellige hjerneregioner tilgjengelige med de to-foton mikroskop. Det muliggjør samtidig overvåking av aksonal og dendrittiske endringer under forskjellige fysiologiske og patologiske tilstander inkludert kognitive prosesser og aldring eller progresjon av nevrologiske og psykiatriske tilstander. Det tillater bruk av celle-spesifikke promotorer for å visualisere anslag som kommer i nøyaktig definerte neuronal undergrupper. Det kan også bli justert for å passe protokoller av eksperimenter på våken og oppfører dyr. Videre kan kalsium- eller pH- følsomme proteiner bli uttrykt i hjernen for å visualisere ikke bare det neuronal morfologi, men også endringer i celleaktivitet og funksjon. En annen mulig modifikasjon av den metode er bruken av en forskjellig rAAV serotype for mCherry ekspresjon. Det kimære 2/1 serotype provides robust uttrykk på injeksjonsstedet med tilstrekkelig raskt innsettende (2-3 uker). De mCherry nivåene holdt seg stabilt i minst 12 uker etter første utbruddet og ingen retrograd merking ble påvist i våre eksperimenter. For å oppnå retrograd merking, kan en annen serotype anvendes, slik som rAAV9. Imaging sesjoner kan utføres ved en hvilken som helst frekvens, men i det minste 24-timers intervall er anbefalt for å tillate riktig gjenvinning av dyret etter anestesi. Hvis brukt riktig, kan denne teknikken å utføre flere bildebehandlings økter av samme region i løpet av flere måneder. For langsiktige eksperimenter (mer enn 6 måneder), kan en Cre / loxP system brukes med rekombinase leveres med AAV vektor inn i en floxed GFP mus linje.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drug
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pre-operative
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1.5-2% during surgery
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0.2 mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg subcutaneously
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subcutaneously
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine	Jelfa	Lignocainum	topically
Lidocaine	Jelfa	20 mg/g	topically
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment	Dedra	Lubrithal	topically
CA glue	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrylic	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	3 mm diameter
Dental drill	Sigmed	Keystone KVet
Fixation bar	Custom made	N/A	M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps	Renex	PN-7B-SA
Micro scissors	Falcon	BM.183.180
Dissection microscope	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Custom made	N/A
Two-photon microscope	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.
Reagent
Virus	gift from K. Deisseroth		Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter