Introduction
Двухфотонное микроскопии революцию в наблюдении активности мозга в живых и ведет себя животных. С момента своего появления в 1990 году она быстро завоевала популярность и в настоящее время осуществляется в качестве одного из наиболее интересных и инновационных подходов к рассмотрению многочисленных аспектов деятельности мозга в естественных условиях 1,2. Эти приложения включают в себя измерения кровотока, нейронную активацию (например, с использованием индикаторов уровня кальция или непосредственных ранних генов экспрессии) и морфологии нервных клеток. Все большее число лабораторий используют два фотонных микроскопов, реализующие технику на протяжении всего научного мира в качестве нового стандарта для естественных изображений мозга в.
Стандартный подход включает в себя имплантацию черепной окна (круглое отверстие в черепе , покрытом покровным стеклом) над стволом или зрительной коре головного мозга мыши 3. Далее, в зависимости от протокола эксперимента, в МОДSE претерпевает ряд визуализации и поведенческих тренировок, что позволяет отслеживать изменения в активности мозга и нервных клеток с течением времени морфологии 4,5. В обоих случаях краниотомия влияет только на теменной кости, не пересекая швы. Он в значительной степени полагают, что основным недостатком этого метода является ограниченное применение в легко доступных кор, таких как ствол или зрительной коры. Имплантация черепной окна по сравнению с другими регионами создает много трудностей, из-за чрезмерного кровотечения и / или пространственное препятствие.
В данной работе мы предлагаем имплантацию черепной окна над ретроспленальной коры (RSC) в качестве еще одной возможной области , представляющей интерес для двухфотонного в естественных условиях микроскопии 6. RSC является важным элементом схемы головного мозга, ответственных за формирование пространственной памяти. Анатомически, RSC является частью нейронной сети , соединяющей корковых, гиппокаппальных и таламуса регионов 7. этоактивно участвует в различных поведений, таких как пространственное обучение и исчезновения, а также пространственной навигации 6.
Для того , чтобы визуализировать морфологические изменения нейронов мы используем трансгенной линии мышей , выражающую зеленый флуоресцентный белок (GFP) под промотором Thy1. У этих мышей GFP выражается в примерно 10% нейронов в головном мозге , позволяющих четкой визуализации корковых аксонов и дендритов с использованием двух-фотонной микроскопии 8. Еще одно новшество , что мы предлагаем является введение рекомбинантного адено-ассоциированный вирус серотипа 2/1 (rAAV2 / 1) , кодирующего красный флуоресцентный белок (mCherry) под нейрон конкретных CaMKII промотора 9 в более глубокие структуры головного мозга , выступающими в RSC , такие, как гиппокамп. Выражение rAAV2 / 1 mCherry в гиппокампе Thy1-GFP мыши позволяет одновременно визуализации пре- и постсинаптических элементов hippocampo-corticaл синапсы 10. Раав инициативе выражение mCherry требует от двух до трех недель для белок, чтобы достичь достаточного уровня в аксонов терминалов. Этот период соответствует обычному времени, необходимого для восстановления после краниотомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры, описанные ниже, были одобрены локальными этическими комитета на Nencki Института экспериментальной биологии Польской академии наук по.
Примечание: Некоторые сцены в связанном видео ускоряются. Коэффициент скорости указывается в этих сценах.
1. Хирургия Подготовка
- Стерилизовать все инструменты, стеклянные контейнеры для жидкостей и ватные тампоны в автоклаве. Используйте перчатки выдаваемые. Очистите операционный стол, стереотаксической рамы и все окружающее пространство с 70% этанола. Используйте стерильную хирургическую площадку для создания стерильного пространства для всех стерилизованного оборудования. Вырезать Gelfoam на мелкие кусочки и замочить их в стерильном физиологическом растворе.
Примечание: В соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, этанол не является ни стерилизующего, ни дезинфицирующее высокого уровня. Его следует использовать только в качестве очистки / обезжиривания агента по предварительно стерилизованных поверхностей. - Поместите животное в гое индукции камеры и установить уровень изофлуран до 5% и поток кислорода до 2 л / мин. Эта процедура должна занять около 3 мин.
- Возьмите животное из индукции камеры. Используйте хвост или палец ноги щепотки для того, чтобы гарантировать, что животное полностью успокоительное.
- Используя точный триммер бреют волосы от задней части головы (между ушами) до глаз.
- Поместите животное в стереотаксической рамы и стабилизировать голову с ушными решеткой.
- Установить анестезии уровни 1,5-2% изофлуран и 0,3 л / мин кислорода.
- Нанесите мазь для глаз.
- Вводят животным подкожно Tolfedine (4 мг / кг), Butomidor (2 мг / кг) и Baytril (5 мг / кг), чтобы предотвратить воспаление, боль и инфекции, соответственно.
- Вводят животным внутримышечно дексаметазон (0,2 мг / кг), чтобы предотвратить набухание головного мозга.
Примечание: Можно вводить дексаметазон подкожно или внутрибрюшинно , чтобы предотвратить повреждение мышц. - Очистите кожу с помощью Sterile ватные тампоны с последующим Бетадин 70% этанола.
- Измените перчатки и распылите их с 70% -ным этанолом.
Примечание: При использовании одноразовых перчаток не прикасайтесь к стерильное поле. Нажмите на животное только с кончиков стерильных хирургических инструментов и стерильных тампонов.
2. Черепно Окно хирургии
- Подтяжка кожи пинцетом и с помощью микро ножницы надрезать кожу в горизонтальном направлении вдоль основания головы, а затем наклонно к передней точке между глазами. Снимите крышку кожи.
- Нанесите мазь лидокаина со стерильным тампоном на надкостницу, чтобы предотвратить чрезмерное кровотечение и боль.
- Используйте стерильные ватные тампоны или скальпель, чтобы удалить надкостницы. Сушат череп с стерильных тампонов.
- Использование стерильной иглой применять плотную цианакрилатный клей по краям кожи, чтобы обездвижить их и предотвратить от контакта с зубным цементом. Подождите, пока клей высохнуть.
- Положите стерильную 3 мм покровного стекла над тон кпереди череп ламбдовидного швом. Сосредоточьте покровное в RSC координаты: AP, брегма -2,8; ML, брегмы 0. Взять покровное края, царапая поверхность черепа стерильной иглой. Поместите покровного стекла обратно в стерильный контейнер с 70% -ным этанолом.
- Используйте высокоскоростной бормашины с малым заусенцев диаметром очертить круг диаметром 3 мм. Очистите место бурения от костной пыли стерильным физиологическим раствором, опускают мазков. Используйте Gelfoam и тампоны, чтобы остановить кровотечение иногда и очистить кости.
- В перерывах между бурением проверить толщину кости с тонким пинцетом, осторожно касаясь круг костей и проверяя его подвижность. Имейте в виду, что кости толще на площади шовного материала в. Прекратить бурение, когда кость круг подвижен и только равномерным тонким слоем кости оставляют на окружности. Очистите поле оперативной всей оставшейся костной пыли с засоленных погружают мазков.
- Отбросьте стерильного физиологического раствора на участке бурения, покрывая пробурена CIRНКУ. Осторожно отогните костный круг с тонким пинцетом, а затем осторожно, но твердо удалить кости, подняв его вверх. Будьте осторожны, чтобы не искажать круг кости при подъеме его, чтобы предотвратить возможные повреждения твердой мозговой оболочки.
- Осторожно применять Gelfoam смоченную в стерильный физиологический раствор на твердую мозговую оболочку, чтобы помочь остановить кровотечение. Подождите, пока все кровотечение полностью не прекратилось. Осторожно удалите Gelfoam, чтобы не нарушить процесс свертывания крови.
Примечание: Область Шов насыщена сосудами, поэтому кровотечение в этот момент может оказаться глубоким. Крайне важно, чтобы дождаться времени, достаточного для кровотечение полностью остановить. Полезно держать солевым пропитанной Gelfoam остудить, поместив его на льду.
3. Вирус Инъекции
- Прикрепите инфузионный насос к стереотаксической башни и подключить контроллер.
- Вставьте иглу 35G в шприц. Промывка шприца в 10 раз с этанолом, чтобы стерилизовать и в 10 раз стерильным физиологическим раствором, чтобы удалить следы еthanol. Удалить пузырьки воздуха из шприца. Вставьте шприц в насос.
Примечание: Рассмотрите возможность использования других дезинфицирующих средств. - Оттепель разовая доза rAAV2 / 1 препарата mCherry (рекомендуется 10 12 КОЕ) и держать его на льду. Заполните шприц с раствором вируса.
- Сосредоточьте иглу на темени, а затем аккуратно вставить в гиппокампе, используя следующие координаты: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Эти координаты будут располагаться вблизи края трепанации. Подождите в течение 5 мин для стабилизации ткани.
- Вводят 0,7 мкл раствора rAAV2 / 1 mCherry со скоростью 50 л / мин. Подождите 10 минут для вируса полностью адсорбировать. Аккуратно удалите иглу. Промокните Gelfoam, если происходит кровотечение. Повторите с контралатеральной сайта.
4. Черепно Окно Имплантация
- Уложить стерильный, сушеной покровного стекла на верхней части твердой мозговой оболочки в просверленное круг кадр. Держите покровного стекла с ForcEPS аккуратно придавить твердую мозговую оболочку и принести покровного стекла 'края ближе к поверхности черепа.
Примечание: Возможно , что покровного стекла разрушает тромб и кровотечение возобновляется. Если это так, поднимите покровного стекла, поместите его в спирте, сухой и вернуться к шагу 2.9. - Использование стерильной иглой применять плотный цианакрилатный клей на края покровного стекла, чтобы прикрепить их к черепу. Подождите, пока клей высохнуть.
- Поместите фиксирующую планку (M2 гайку или выполненный на заказ дизайн) в передней части черепа. Нанесите цианакрилатный клей по краям панели. Подождите, пока клей высохнуть.
- Поместите планку фиксации в положении, которое позволит горизонтальное позиционирование черепной окна во время сеанса визуализации. Поместите его как можно дальше от окна. Если он расположен слишком близко к окну, бар и винт связывая его с заказного держателя может представлять как препятствие для объектива во время процесса формирования изображения.
- Создать колпачок с зубной акрила, покрывающий остальную часть рабочей зоны, края кожи, фиксации панели, усиливая кратер вокруг черепа окна. Подождите, пока зубной цемент затвердеет.
- Удалить животное от стереотаксической рамы и поместить его в камеру восстановления.
- Подождите, пока животное, чтобы оправиться от операции, соблюдая физиологические функции.
- Применение послеоперационную анальгезию (карпрофен, 10 мг / кг) и лечение антибиотиками (Baytril, 5 мг / кг) в течение 48 часов.
5. обработки изображений
- Начало Ti: Sapphire лазер, мощностью до микроскопа. Система, используемая в этом эксперименте оснащен двухфотонного лазера, система ОРО и двойной GaAsP ФЭУ.
- Поместите животное в inducции камеры и вызывают анестезию.
- Удалить животное от индукции камеры и места в противогазе анестезии под микроскопом. Уменьшение расхода кислорода до 0,3 л / мин и изофлуран концентрации 1,5-2%.
- Зафиксируйте животное в пользовательский корпуса микроскопа с помощью винта M2 (или другой пользовательской системы). Уровень черепной окно.
Примечание: Можно использовать систему фиксации головки производителя микроскопа, хотя конкретный пользовательский кадр дает лучшие результаты (улучшенную стабильность головки, постоянное позиционирование в нескольких сеансов во время хронического эксперимента). - Использование Widefield настройки микроскопа и низкий коэффициент увеличения объективный центр взгляд на одной из сторон ретроспленальной коры и сфокусировать его на поверхности покровного.
- Нанесите каплю воды в кратер типа акрилового скважины. Переключение на большие расстояния цели погружения в воду. Передвигайте цель к черепной окна, пока вода мениска Connects образца и цель.
- Переход к настройкам двухфотонными и начать сканирование верхней образца вниз, используя наименьшее увеличение. Пересечение твердой мозговой оболочки будет виден как блики высокой неспецифической сигнала.
- Настройка параметров приобретения микроскопа в обоих каналах (GFP и mCherry) в соответствии с уровнем сигнала от флуоресцентных клеток для того, чтобы охватить весь динамический диапазон.
- После нахождения подходящего нейрон (с дендритной дерева, отделенной от других клеток) выполнить первоначальное сканирование с использованием только GFP filterset с наименьшим увеличением и г-на расстоянии 5 мкм.
- Получить максимальную проекцию отсканированного стека и распечатать его для аннотаций (с использованием перевернутых цветов).
- Установите масштаб на значение, которое позволит изображению желаемые морфологические детали. Изображение весь дендритные дерево в каналах и GFP mCherry с использованием максимальной проекции в качестве руководства.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экспрессия GFP в субпопуляции нейронов в репортерной мыши Thy1-GFP позволяет в естественных изображений корковых дендритов и аксонов местных выступов в ОПЗ. На рисунке 1А показывает максимальный выступ стек изображений с несколькими GFP-положительных дендритов видимых. Тело клетки затемняется артерии. Фигура 1В показывает одну плоскость увеличенное изображение (цифровой зум 3x) дендритной ветви , указанной в 1А. Подробная информация о дендритной морфологии (колючек, филоподий) отчетливо видны. Канал GFP приобретается с помощью фильтра твердых полосовым 500-550 нм.
Инъекция rAAV2 / 1 mCherry в дорсального гиппокампа позволяет визуализировать гиппокампа аксонов и синапсов бутонов , заканчивающихся в ОПЗ. Эти терминалы могут быть обнаружены в канале mCherry (испускание полосовой фильтр 570-610 нм).
Рисунок 1. Два канала в естественных условиях двухфотонного визуализации RSC нейронов и гиппокампа проекций на RSC. (A) обзор из GFP-экспрессирующих клеток во фрагменте (RSC изображения показаны в перевернутых цветах). Максимальная проекция показан толстой стопки 100 мкм, принятых при малом увеличении (0.7x цифровой зум). (В) , одного оптического плоскость фрагмента , указанного в пункте (а) , полученные при большом увеличении (3x цифровое увеличение) в канале GFP. (C) , один фрагмент оптической плоскости указано в пунктах (а) с использованием параметров приобретения mCherry. См Протокол о деталях фильтров обнаружения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящей работе мы приводим протокол для одновременного двухфотонного в естественных изображений синаптических входов и постсинаптических мишеней в RSC через черепной окно. Процедура имплантации состоит из нескольких основных этапов. Во-первых, животное глубоко под наркозом и фиксируется в стереотаксической рамы, то череп над RSC разбавлена с дрелью вдоль отмеченных круговых линий и круговая кость удалена. После того, как кровотечение остановлено, rAAV2 / 1 mCherry впрыскивается в гиппокампе, и покровное стекло крепится к черепу через просверленное области. Наконец бар крепление крепится на голове, и животное помещается в камере регенерации в течение 48 часов. Примерно через 2-3 недели необходимо для экспрессии вирусов, RSC можно визуализировать. Протокол формирования изображения содержит следующие этапы. Во-первых, животное находится под наркозом и фиксируется под микроскопом. Упор затем устанавливается с помощью микроскопа с широким полем зрения, система SWItched в режиме двухфотонного и каналы интереса (GFP и mCherry) визуализируются.
Представленная методика предлагает значительное улучшение по сравнению с ранее описанными протоколами. В стандартном подходе, можно было обнаружить только один тип метки. Он может быть использован для изображения локального аксонов проекций и дендритных деревьев, но никаких исследований подключения дальнего радиуса действия были невозможны. Объединив две флуоресцентные белки мы включили одновременное отслеживание до и постсинаптических элементов. Это позволяет долгосрочный мониторинг естественных условиях предполагаемых синаптических соединений.
Для достижения оптимальных результатов в описанной выше процедуре, важно обратить внимание на несколько важных этапов. Во время подъема круг кости на шаге 2.8 повреждения твердой мозговой оболочки может вызвать воспаление и ухудшить прозрачность черепной окна. Недостаточная остановка кровотечения в шаге 2.9 или в любом другом шаге процедуры приводит к accumulat кровиионному под окном и значительно уменьшает поле зрения. После инъекции вируса крайне важно подождать, по крайней мере 10 минут, прежде чем снимать иглу, для того, чтобы вирус влить в ткань на только в месте инъекции. Это ограничивает возможность нежелательной инфекции коры с вирусом во время удаления иглы. Площадь вирусной трансфекцией следует рассматривать с постфактум гистологический анализ ткани мозга. Любое выражение mCherry в клетках вдоль иглы следа следует избегать. Стандартное время восстановления составляет 3 недели. Этот период достаточен для вируса, чтобы достичь стабильной экспрессии в синаптических проекций и черепной окна, чтобы полностью залечить и стабилизации. Животные должны быть единичными размещены для того, чтобы предотвратить удаление черепной окна имплантата по клетке товарищей. Использование увеличенного клетки можно было бы рассмотреть, чтобы избежать случайного повреждения черепной окна, нажав металлические стержни. Стабильная фиксация МОВсе под микроскопом имеет важное значение. Любое движение головы, в том числе дыхательных движений, может привести к значительному снижению качества получаемых изображений. Это также полезно для позиционирования черепной окно по горизонтали к цели, чтобы ограничить возможные проблемы с приобретением равное внимание на всей плоскости окна. Четкие критерии для решения колючками и бутонов следует применять. Как правило, бутоны определяются как аксонов вздутий , имеющих диаметр , по меньшей мере в 3 раза больше , чем предыдущее волокно 7. Шипы определяются как четко различимых выступов от дендритов вала, которые содержат выпуклую головку. Дальнейшее деление на популяции тонких, Stubby, грибов и разветвленного шипов возможно 3. Из - за относительно низкого осевого разрешения двухфотонной микроскопии, анализ шипы , которые торчат вдоль оптической оси , следует избегать 3. Для того , чтобы четко различать функциональные бутоны и колючек, пост специального иммунноокрашиваниямогут быть выполнены для того , чтобы идентифицировать до- и постсинаптических маркеры 7.
Хотя представленный протокол оказался наиболее благоприятным в наших экспериментальных конструкций, можно изменить его, чтобы соответствовать различных экспериментальных целей. Иногда он больше подходит для использования инъекционной анестезии (например, кетамин-xylasine) вместо изофлуран, но важно, чтобы адекватно регулировать дозировку, принимая во внимание различия в лекарственной чувствительности у мышей различных штаммов, возраста и пола. Можно использовать Трепан бур вместо сферической для сверления, но это может увеличить риск повреждения твердой мозговой оболочки. Стерильный физиологический раствор, может быть с успехом заменен искусственной цереброспинальной жидкости (ACSF), но важно, чтобы держать его бесплодным в любое время во время подготовки и эксплуатации. ACSF стабилен в течение 3-4 недель после приготовления, и, если любое загрязнение происходит до этого времени, оно должно быть немедленно отброшены. Различные fixati головына устройствах могут быть применены, в зависимости от экспериментального проектирования, в том числе возможность наблюдения за просыпаются мышь под двухфотонного микроскопа.
Как и любой другой техники, на этот раз также имеет свои ограничения. Двухфотонный микроскоп позволяет для визуализации мозга ткани на глубину до 500 мкм от поверхности твёрдой. Для изучения более глубоких структур мозга дополнительные модификации должны быть применены. Наш протокол обеспечивает доступ к большинству RSC, но часть структуры скрытой под верхнего сагиттального синуса до сих пор не доступны. Разрешение двухфотонного микроскопа не является достаточным для идентификации конкретного синапса, а также детального морфологического анализа дендритных шипиков. Дополнительные методы, такие как соотносительной электронной микроскопии должен быть применен для того, чтобы подтвердить наличие подозреваемого структуры. Важно также отметить, что это является относительно сложным хирургическая техника и она не выздоровеетmmended для неопытный оператора.
Представленная методика может быть применен в широком диапазоне экспериментов. Он может быть изменен для исследования различных областей мозга, доступных с двухфотонного микроскопа. Она позволяет одновременный мониторинг аксонов и дендритных изменений при различных физиологических и патологических состояний, в том числе когнитивные процессы и старение или прогрессирование неврологических и психических заболеваний. Это позволяет использовать клеточные промоторы для визуализации проекций, происходящих при точно определенных нейрональных подмножеств. Он также может быть скорректирована в соответствии с протоколами экспериментов на бодрствующих и ведущих себя животных. Кроме того, кальций-либо чувствительные белки pH-могут быть выражены в мозге того, чтобы визуализировать не только нейронную морфологию, но также изменения активности клеток и функции. Другая возможная модификация подхода является использование другого Раав серотипа для экспрессии mCherry. Химерные 2/1 серотип прovides надежные выражение в месте инъекции с достаточно быстрым началом (2-3 недели). Уровни mCherry оставались стабильными в течение по крайней мере 12 недель после первоначального начала и не ретроградной маркировки не было обнаружено в наших опытах. Для того чтобы получить ретроградной маркировки, другой серотип могут быть использованы, например, rAAV9. Сеансы формирование изображений может выполняться на любой частоте, тем не менее, по крайней мере интервал 24-ч, рекомендуется для того, чтобы обеспечить надлежащее восстановление животного после наркоза. Если применяется должным образом, этот метод позволяет проводить несколько сеансов обработки изображений одного и того же региона в течение нескольких месяцев. Для долгосрочных экспериментов (более 6 месяцев), система Cre / LoxP может использоваться с рекомбиназы, поставляемом с вектором AAV в floxed линии GFP мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы (KL, MR, KR), имеют право на подана заявка на патент (PL410001) для держателя кадра, используемого в этой статье.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить М. Steczkowski для записи голоса, М. Borczyk для рисунков, А. Trąbczyńska для производства вируса, M. Ziókowska для генотипирования и А. Mirgos за помощью съемок. КР признает своеобразным подарком рекомбинантного адено-ассоциированный вирус (Раав), выражающая флуоресцентный белок mCherry под контролем промотора CaMK от К. Дейссерот. Этот проект был осуществлен на основных объектах лаборатории животных моделей и лаборатории тканевой структуры и функции, Центр нейробиологии, Nencki Института экспериментальной биологии, с использованием инфраструктуры СЕРТ, финансируемой Европейским Союзом - Европейский фонд регионального развития в рамках Оперативная программа «Инновационная экономика» на 2007-2013 годы. Эта работа была поддержана грантами от Национального научного центра: Соната Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 до КР и Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
