Introduction
Två-foton mikroskopi revolutionerade observation av hjärnans aktivitet i levande och beter djur. Sedan introduktionen 1990 snabbt vunnit popularitet och är nu genomförs som ett av de mest intressanta och innovativa strategier för undersökning av många aspekter av hjärnaktivitet in vivo 1,2. Dessa applikationer inkluderar blodflödesmätningar, neuronal aktivering (t.ex. med hjälp av indikatorer kalcium nivå eller omedelbara tidiga gener uttryck) och morfologi av neuronala celler. Ett ökande antal laboratorier använder två-photon mikroskop för genomförande av tekniken i hela den vetenskapliga världen som en ny standard för in vivo hjärnavbildning.
Standardförfarandet innebär implantation av hjärn fönster (ett runt hål i kraniet täckt med ett täckglas) över tunnan eller syncentrum av mushjärna 3. Nästa, beroende på det experimentella protokollet, MOUSE genomgår en serie av visualisering och beteende träningspass, gör det möjligt att övervaka förändringar i hjärnans aktivitet och neuronal morfologi över tid 4,5. I båda fallen endast kraniotomi påverkar hjässben, utan att passera suturerna. Det är till stor del antas att den huvudsakliga nackdelen med tekniken är dess begränsade tillämpning på lättillgängliga cortexes såsom eldröret eller syncentrum. Implantation av kraniala fönstret över andra regioner utgör en hel del svårigheter, på grund av kraftig blödning och / eller rumsliga hinder.
I detta dokument föreslår vi implantation av kraniala fönstret ovanför retrosplenial cortex (RSC) som en annan möjlig region av intresse för två-foton-in vivo-mikroskopi 6. RSC är en viktig del av hjärnan kretsen med ansvar för fysisk minnesbildning. Anatomiskt är RSC en del av en neuronal nätverk som förbinder kortikala, hippocampus, och talamiska områden 7. Det ärstarkt engagerad i en rad olika beteenden, såsom spatial inlärning och utrotning samt spatial navigering sex.
För att visualisera de morfologiska förändringarna av neuronerna använder vi en transgen mus som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under thy1 promotorn. I dessa möss, är GFP uttrycks i ca 10% av neuronerna i hjärnan som möjliggör tydlig visualisering av de kortikala axoner och dendriter som använder två-foton-mikroskopi 8. En annan nyhet som vi föreslår är injektion av ett rekombinant adenoassocierat virus serotyp 2/1 (rAAV2 / 1) som kodar en röd fluorescerande protein (mCherry) under ett neuronspecifikt CaMKII promotor 9 in i de djupare strukturer i hjärnan som skjuter ut till RSC , såsom hippocampus. Uttrycket av rAAV2 / 1 mCherry i hippocampus hos Thy1-GFP mus möjliggör samtidig visualisering av pre-och postsynaptiska element i Hippocampo-cortical synapser 10. RAAV-drivna uttrycket av mCherry kräver två till tre veckor för proteinet att nå tillräcklig nivå i axonal terminaler. Denna period är förenligt med den vanliga tid som krävs för återhämtning från kraniotomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experimentella procedurer som beskrivs nedan godkändes av regionala etikprövningsnämnden i Nencki Institute of Experimental Biology, polska vetenskapsakademin.
Obs! Vissa av scenerna i tillhörande video accelereras. Hastighetsfaktor anges i dessa scener.
1. Kirurgi Framställning
- Sterilisera alla verktyg, glasbehållare för vätskor och bomullspinnar i autoklaven. Använd umbärliga handskar. Rengöra operationsbordet, stereotaxic ramen och alla det omgivande området med 70% etanol. Använd en steril kirurgisk dyna för att skapa en steril plats för alla steriliserad utrustning. Skär Gelfoam i små bitar och blöta dem i steril saltlösning.
Obs: Enligt Guide för skötsel och användning av försöksdjur, är etanol varken en steriliserings eller en hög nivå desinfektionsmedel. Det bör endast användas som en rengöring / avfettning agent på tidigare steriliserade ytor. - Avliva djuret i the induktionskammare och ställ in isofluran nivån till 5% och flödet av syre till 2 l / min. Detta förfarande bör ta cirka 3 minuter.
- Ta djuret ut ur induktionskammaren. Använd svans eller tå nypor för att se till att djuret är helt sövd.
- Med hjälp av en exakt trimmer raka håret från baksidan av huvudet (mellan öronen) upp till ögonen.
- Placera djuret i stereotaxic ramen och stabilisera huvudet med örat barer.
- Ställ anestesinivåer till 1,5-2% isofluran och 0,3 l / min syre.
- Applicera ögonsalva.
- Injicera djuret subkutant med Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) och Baytril (5 mg / kg) för att förhindra inflammation, smärta och infektion, respektive.
- Injicera djur intramuskulärt med dexametason (0,2 mg / kg) för att förhindra hjärnsvullnad.
Obs: Det är möjligt att injicera Dexamethasone subkutant eller intraperitonealt för att förhindra muskelskador. - Rengör huden med sterile bomullspinnar med Betadine följt av 70% etanol.
- Byt handskarna och spraya dem med 70% etanol.
Obs: När du använder engångshandskar inte röra det sterila området. Tryck på djur endast med tips av sterila kirurgiska instrument och sterila kompresser.
2. Kraniell fönster Kirurgi
- Lyfta huden med pincett och genom att använda mikro sax incisionsfilm huden horisontellt längs basen av huvudet och sedan snett mot den främre punkten mellan ögonen. Ta bort huden luckan.
- Applicera lidokain salva med ett sterilt kompress på benhinnan att förhindra överdriven blödning och smärta.
- Använd sterila bomullspinnar eller en skalpell för att ta bort benhinnan. Torka skallen med sterila kompresser.
- Med hjälp av en steril nål tillämpa tät cyanoakrylatlim på huden kanterna för att immobilisera dem och förhindra kontakt med dentalcement. Vänta tills limmet torka.
- Lägg en steril 3 mm coverglass över than skalle anteriort till den lambdoid sutur. Centrera täck på RSC koordinater: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Mark täck kanterna genom att skrapa skallen ytan med en steril nål. Sätta coverglass tillbaka in i sterila behållare med 70% etanol.
- Använd en hög hastighet tandläkarborr med Burr liten diameter för att beskriva en cirkel 3 mm diameter. Rengör borrplatsen från benet damm med steril saltlösning doppade kompresser. Använd Gelfoam och svabbar för att stoppa enstaka blödning och rengör benet.
- Mellan borrning kontrollera benet tjocklek med fin pincett genom att försiktigt röra benet cirkeln och kontrollera sin rörlighet. Tänk på att benet är tjockare på suturen område. Stoppa borrningen när benet cirkeln är mobil och endast ett jämnt, tunt lager av ben är kvar på omkretsen. Rengör verksamhetsområdet av alla återstående ben damm med saltlösning doppade kompresser.
- Släpp steril saltlösning på borrområdet, som omfattar det borrade circle. Försiktigt bända ben cirkel med fin pincett och sedan försiktigt men bestämt bort ben genom att lyfta det uppåt. Var noga med att inte skeva ben cirkel samtidigt lyfta den för att förhindra eventuell skada på dura.
- Försiktigt Gelfoam indränkt i steril koksaltlösning på dura för att stoppa blödningen. Vänta tills all blödning är helt stoppas. Försiktigt bort gelfoam inte störa koagulationsprocessen.
Notera: Suturen området är höggradigt vaskulariserad, så blödningen vid denna punkt skulle kunna visa sig vara djupgående. Det är viktigt att vänta på tillräckligt med tid för blödningen att sluta helt. Det är bra att hålla saltindränkt Gelfoam kyls genom att placera den på is.
3. Virus Injektion
- Fäst infusionspump till stereotaktisk tornet och anslut kontrollenheten.
- För in 35G nål i sprutan. Spola sprutan 10 gånger med etanol för att sterilisera den och 10 gånger med steril koksaltlösning för att avlägsna spår av ethanol. Avlägsna luftbubblor från sprutan. För in sprutan i pumpen.
Obs: Du kan använda andra desinfektionsmedel. - Tina en enda dos av rAAV2 / 1 mCherry preparat (10 12 pfu rekommenderas) och hålla den på is. Fyll sprutan med viruset lösning.
- Centrera nålen på bregma och sedan försiktigt in i hippocampus med användning av följande koordinater: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Dessa koordinater kommer att ligga nära kanten av kraniotomi. Vänta i 5 min för vävnaden stabiliseras.
- Injicera 0,7 pl av rAAV2 / 1 mCherry lösning med en hastighet av 50 nl / min. Vänta 10 min för viruset att helt absorbera. Försiktigt bort nålen. Blot med Gelfoam om blödningen inträffar. Upprepa med den kontralaterala sida.
4. Kraniell fönster Implantation
- Lägga den sterila, torkades coverglass på toppen av dura i det borrade cirkeln ramen. Håll coverglass med Forceps att försiktigt platta dura och föra coverglass "kanter närmare skallen ytan.
Obs: Det är möjligt att coverglass stör proppen och blödnings återupptas. Om så är fallet, lyft coverglass, placera den i alkohol, torr och återgå till steg 2,9. - Med hjälp av en steril nål tillämpa den täta cyanoakrylatlim på coverglass kanterna att fästa dem till skallen. Vänta tills limmet torka.
- Placera en fixerings bar (M2 mutter eller en specialtillverkad design) i den främre delen av skallen. Applicera cyanoakrylatlim över kanterna på baren. Vänta tills limmet torka.
- Placera fixerings bar i ett läge som gör det möjligt för horisontell positionering av kraniala fönstret under avbildning session. Placera den så långt bort som möjligt från fönstret. Om den är placerad för nära fönstret, kan baren och skruven som förbinder den med skräddarsydda innehavaren utgör ett hinder för målet under avbildningsprocessen.
- Skapa ett lock med den dentala akryl, som täcker resten av det operativa området, hudkanterna, fixering bar, förstärkande kratern runt kraniala fönstret. Vänta på dentala cement härda.
- Ta bort djuret från stereotaxic ramen och lägg den i återvinningskammaren.
- Vänta för djuret att återhämta sig från operationen med beaktande av de fysiologiska funktioner.
- Tillämpa postoperativ smärtlindring (karprofen, 10 mg / kg) och antibiotika-behandling (Baytril, 5 mg / kg) under 48 timmar.
5. Imaging
- Starta Ti: Sapphire laser, uppstart mikroskopet. Det system som används i detta experiment är utrustad med en två-foton-laser, OPO-system och dual GaAsP PMT.
- Avliva djuret i Inductionskammare och inducera anestesi.
- Ta bort djuret från induktionskammare och plats i gasen anestesi masken under mikroskop. Minska flödet av syre till 0,3 L / min och Isoflurankoncentration till 1,5-2%.
- Fäst djuret till anpassade mikroskopstativet med en M2 skruv (eller något annat anpassat systemet). Nivå hjärn fönstret.
Obs: Det är möjligt att använda mikroskop tillverkarens huvud fixeringssystem, även om de speciella Anpassningsbar Ram ger bättre resultat (förbättrad huvud stabilitet konstant positionering i flera sessioner under en kronisk experiment). - Använda Widefield mikroskop inställningar och en låg förstoring objektiv centrum Synen på en av sidorna av retrosplenial cortex och fokusera det på täckytan.
- Applicera en vattendroppe i kratern liknande akryl brunn. Byt till en långdistans nedsänkning i vatten mål. Flytta målet mot hjärn fönstret tills vattnet menisken conbinder samman provet och objektiv.
- Växla till två-photon inställningar och börja skanna provet topp till botten med hjälp av lägsta zoom. Korsningen av dura mater kommer att vara synlig som en reflexer av hög icke-specifik signal.
- Justera mikroskop förvärvet inställningar i båda kanalerna (GFP och mCherry) enligt signalstyrkan från fluorescerande celler för att täcka hela det dynamiska omfånget.
- Efter att hitta en lämplig neuron (med den dendritiska träd separeras från andra celler) utföra en första genomsökning med enbart GFP filterset med lägsta zoom och z-avstånd av 5 mikrometer.
- Skaffa en maximal projektion av den skannade stapeln och skriva ut den för anteckningar (med inverterade färger).
- Ställ zoom till ett värde som gör det möjligt att avbilda de önskade morfologiska detaljer. Bild hela dendritiska träd i GFP och mCherry kanaler med maximal projektion som guide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrycket av GFP i en delmängd av nervceller i Thy1-GFP reporter mus tillåter in vivo avbildning av kortikala dendriter och lokala axonal prognoser i RSC. Figur 1A visar maximal projektion av en bunt med bilder med flera GFP-positiva dendriter synliga. Cellkroppen skyms av en artär. Figur 1B visar ett enda plan zoomas bilden (digital zoom 3x) av den dendritiska grenen anges i 1A. Uppgifter om dendritiska morfologi (ryggar, filopodia) syns tydligt. GFP kanal förvärvas med hjälp av bandpassemissionsfilter 500-550 nm.
En injektion av rAAV2 / 1 mCherry i rygg hippocampus möjliggör visualisering av hippocampus axoner och synaptiska boutons slutar i RSC. Dessa terminaler kan detekteras i mCherry kanalen (emission bandpassfiltret 570 till 610 nm).
Figur 1. Tvåkanals in vivo två photon avbildning av RSC nervceller och hippocampus prognoser till RSC. (A) En översikt av GFP-uttryckande celler i ett fragment av RSC (bilden som visas i inverterade färger). Största projektions visas av en 100 um tjock bunt tagen vid låg förstoring (0,7x digital zoom). (B) Singel optisk plan fragmentet anges i (A) förvärvade vid hög förstoring (3x digital zoom) i GFP-kanalen. (C) Single optisk plan fragment anges i (A) enligt förvärvs inställningar mCherry. Se protokoll för detaljer om detektionsfilter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I det nuvarande papperspresenterar vi ett protokoll för samtidig två-photon in vivo avbildning av synaptiska ingångar och postsynaptiska mål i RSC genom en kraniell fönster. Implanteringsproceduren består av flera viktiga steg. Först djuret djupt sövda och fixeras i den stereotaktiska ramen, då skallen över RSC förtunnas med en borr längs de markerade cirkulära linjer och den cirkulära benet avlägsnas. Efter blödningen stoppas, den rAAV2 / 1 mCherry injiceras i hippocampus, och täckglaset är fixerat till skallen över det borrade området. Slutligen fixeringsfältet är fäst på huvudet, och djuret placeras i återvinningskammaren under 48 timmar. Efter cirka 2-3 veckor som behövs för virusuttryck kan RSC visualiseras. Den bildprotokoll består av följande steg. Först djuret bedövas och fast under mikroskop. Fokus är sedan in med widefield mikroskop, är systemet switched i två foton läge och kanalerna av intresse (GFP och mCherry) visualiseras.
Den presenterade tekniken erbjuder en stor förbättring jämfört med de tidigare beskrivna protokoll. I standardförfarandet kan endast en typ av en etikett detekteras. Den skulle kunna användas för att avbilda lokala axonal prognoser och dendritiska träd, men inga långväga anslutnings studier var möjligt. Genom att kombinera två fluorescerande proteiner aktiverade vi samtidig spårning av pre-och postsynaptiska element. Detta medger långsiktig in vivo övervakning av förmodade synaptiska förbindelser.
För att få optimala resultat i den beskrivna metoden, är det viktigt att uppmärksamma flera viktiga steg. Under lyfta benet cirkeln i steg 2,8 skador på dura kan orsaka inflammation och försämrar insynen i hjärn fönstret. Otillräcklig stopp av blödning i steg 2,9 eller vid något annat steg av förfarandet resulterar i blod accumulation under fönstret och minskar synfältet. Efter injektion av viruset är det viktigt att vänta minst 10 minuter innan du tar bort nålen, för viruset att ingjuta i vävnaden vid injektions enda plats. Det begränsar möjligheten för oönskad infektion av hjärnbarken med viruset under nålen bort. Det område av det virala transfektion bör undersökas med en post hoc-histologisk analys av hjärnvävnad. Någon mCherry expression i celler utmed nålen spår bör undvikas. Standardåterhämtningstiden är 3 veckor. Denna period är tillräcklig för viruset att nå stabilt uttryck i de synaptiska prognoser och för hjärn fönstret helt läka och stabilisera. Djuren ska enda inrymt i syfte att förhindra avlägsnande av hjärn fönstret implantatet av burkamrater. Användningen av en förstorad bur kan övervägas för att undvika oavsiktlig skada på hjärn fönster genom att slå metallstänger. Stabil fixering av mouse i mikroskop är viktigt. Alla huvudrörelse, inklusive andningsrörelser, kan orsaka betydande minskning av kvaliteten på de erhållna bilderna. Det är också bra att placera hjärn fönstret horisontellt till målet att begränsa eventuella problem med att skaffa lika fokus för hela planet i fönstret. Tydliga kriterier för att lösa ryggar och boutons bör tillämpas. Generellt är boutons definieras som axonala svullnader som har en diameter på minst 3 gånger större än den föregående fibern 7. Ryggar definieras som klart urskiljbara utsprång från Dendrite axel som innehåller en kupig huvud. Ytterligare uppdelning i populationer av tunn, trubbiga, svamp och grenade ryggar är möjligt 3. På grund av den relativt dåliga axiella upplösningen av två foton mikroskopi, bör analys av ryggar som skjuter längs den optiska axeln undvikas 3. För att tydligt skilja funktionella boutons och ryggar, en post hoc immunomärkningkan utföras för att identifiera pre-och postsynaptiska markörer 7.
Även den presenterade protokollet visat sig vara det mest fördelaktiga i våra experimentell design, är det möjligt att ändra den för att passa olika experimentella mål. Ibland är det mer lämpligt att använda injicerbara anestesi (t.ex. ketamin-xylasine) i stället för isofluran, men det är viktigt att på ett adekvat justera dosen, med tanke på skillnader i drogkänslighet mellan möss av olika stammar, ålder och kön. Det är möjligt att använda en TREPANERA bur i stället för en sfärisk en för borrningen, men det skulle kunna öka risken för skada på dura. Steril koksaltlösning kan med framgång ersättas med artificiell cerebrospinalvätska (ACSF), men det är viktigt att hålla den steril vid alla tidpunkter under framställning och drift. ACSF är stabil under 3-4 veckor efter beredning, och om någon kontaminering sker innan den här gången bör omedelbart kasseras. Olika huvud fixatipå enheter kan användas, beroende på experimentell design, inklusive möjligheten att observera vaken mus under två-photon mikroskop.
Som någon annan teknik, har detta en också sina begränsningar. De två-photon mikroskop möjliggör visualisering av hjärnvävnad upp till 500 um djup från dura ytan. För undersökning av de djupare hjärnstrukturer ytterligare ändringar måste tillämpas. Vår protokoll ger tillgång till de flesta av RSC, men den del av strukturen dold under sinus sagittalis superior är fortfarande inte tillgänglig. Upplösningen av de två-photon mikroskop är inte tillräcklig för att identifiera en specifik synaps samt detaljerade morfologisk analys av Dendritutskotten. Ytterligare tekniker, såsom korrelat elektronmikroskopi måste tillämpas för att bekräfta förekomsten av en misstänkt struktur. Det är också viktigt att nämna att detta är en relativt svår kirurgisk teknik och det är inte recommended för en oerfaren operatör.
Den presenterade tekniken kan tillämpas i en mängd olika experiment. Det kan modifieras för undersökning av olika hjärnregioner tillgängliga med två-photon mikroskop. Den möjliggör samtidig övervakning av axonal och dendritiska förändringar under olika fysiologiska och patologiska tillstånd inklusive kognitiva processer och åldrande eller progression av neurologiska och psykiatriska tillstånd. Det möjliggör användning av cellspecifika promotorer för att visualisera prognoser ursprung på exakt definierade neuronala delmängder. Det kan också justeras för att passa protokollen för experiment på vakna och beter djur. Vidare kan kalcium- eller pH- känsliga proteiner uttryckas i hjärnan för att visualisera inte bara den neuronala morfologi utan även förändringar i cellaktivitet och funktion. En annan möjlig modifiering av tillvägagångssättet är att använda en annan rAAV serotyp för mCherry uttryck. Den chimära 2/1 serotyp provides robust uttryck vid injektionsstället med tillräckligt snabbt insättande (2-3 veckor). De mCherry förblev stabil under minst 12 veckor efter första starten och ingen retrograd märkning detekterades i våra experiment. För att erhålla retrograd märkning, kanske en annan serotyp kan användas, såsom rAAV9. De avbildning sessioner kan utföras vid vilken som helst frekvens, men åtminstone 24-tim-intervall rekommenderas för att möjliggöra tillfredsställande återvinning av djuret efter anestesi. Om tillämpas korrekt, tillåter denna teknik utför flera avbildning sessioner i samma region under loppet av flera månader. För långtidsförsök (längre än 6 månader), kan en Cre / LoxP systemet användas med rekombinaset levereras med AAV-vektor i en floxed GFP mus linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna (KL, MR, KR) har rättigheter för patentsökta (PL410001) för Holder ram som används i denna artikel.
Acknowledgments
Författarna vill tacka M. Steczkowski för röstinspelningar, M. Borczyk för ritningar, A. Trąbczyńska för virusproduktion, M. Ziókowska för genotypning och A. Mirgos för att få hjälp med att filma. KR erkänner vänlig gåva från det rekombinanta adeno-associerat virus (rAAV) som uttrycker fluorescerande protein mCherry under kontroll av CaMK promotorn från K. Deisseroth. Detta projekt genomfördes vid kärnanläggningar för laboratoriedjurmodeller och Laboratoriet för vävnadsstruktur och funktion, Centrum för neurobiologi, Nencki Institute of Experimental Biology, med användning av CEPT infrastruktur som finansieras av Europeiska unionen - Europeiska regionala utvecklingsfonden inom det operativa programmet "Innovativ ekonomi" för 2007-2013. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00.691 till KR och Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 till RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
