Samtidig To-foton Published: March 13, 2016 doi: 10.3791/53528

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kacper Łukasiewicz*¹, Magdalena Robacha*¹, Łukasz Bożycki², Kasia Radwanska¹, Rafał Czajkowski³

¹Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, ²Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, ³Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

* These authors contributed equally

Introduction

To-foton mikroskopi revolutionerede observation af hjernens aktivitet i levende og opfører dyr. Siden introduktionen i 1990 det hurtigt vundet popularitet og er nu implementeret som et af de mest interessante og nyskabende tilgange til undersøgelse af mange aspekter af hjernens aktivitet in vivo ^1,2. Disse anvendelser omfatter blod flowmålinger, neuronal aktivering (fx under anvendelse af calcium niveau indikatorer eller umiddelbare tidlige gener ekspression) og morfologien af neuronale celler. Et stigende antal laboratorier bruge to-foton mikroskoper, gennemføre teknikken hele den videnskabelige verden som en ny standard for in vivo hjernescanning.

Standarden tilgang indebærer implantation af kranie vindue (et rundt hul i kraniet dækket med et dækglas) over tønden eller visuelle cortex af musen hjernen ^3. Næste, afhængigt af forsøgsprotokollen, at mouSE gennemgår en serie af visualisering og adfærdsmæssige træningssessioner, gør det muligt at overvåge ændringer i hjernen aktivitet og neuronal morfologi over tid ^4,5. I begge tilfælde kraniotomi påvirker kun parietale knogler, uden at krydse suturerne. Det er i vid udstrækning menes, at den største ulempe ved teknikken er dens begrænset anvendelse til lettilgængelige cortexes såsom tønde eller visuelle cortex. Implantation af kranie vinduet over andre regioner udgør en masse problemer, på grund af overdreven blødning og / eller rumlig hindring.

I dette papir foreslår vi implantation af kraniale vinduet ovenfor retrospenialis cortex (RSC) som en anden mulig region af interesse for to-foton in vivo mikroskopi ^6. RSC er et vigtigt element i hjernen kredsløb med ansvar for fysisk hukommelse dannelse. Anatomisk, RSC er en del af en neuronal netværk, som forbinder cortical, hippocampal, og thalami regioner ^7. det erstærkt involveret i en række adfærd, såsom rumlig indlæring og udslettelse samt rumlig navigation ^6.

For at visualisere de morfologiske ændringer af neuroner bruger vi en transgen mus, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under Thy1 promotoren. I disse mus er GFP udtrykt i ca. 10% af neuronerne i hjernen muliggør klar visualisering af kortikale axoner og dendritter under anvendelse af to-foton mikroskopi ^8. En anden nyskabelse, som vi foreslår er injektion af et rekombinant adenoassocieret virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1), der koder et rødt fluorescerende protein (mCherry) under en neuron-specifik CaMKII promotor ⁹ ind i de dybere strukturer i hjernen som rager til RSC , såsom hippocampus. Ekspressionen af rAAV2 / 1 ^mCherry i hippocampus fra Thy1-GFP mus giver mulighed for samtidig visualisering af præ- og postsynaptiske elementer i Hippocampo-Cortical synapser ^10. Den rAAV-drevne ekspression af mCherry kræver to til tre uger for proteinet at nå det niveau af de axonale terminaler. Denne periode er i overensstemmelse med den sædvanlige tid, der kræves til nyttiggørelse fra kraniotomi.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer beskrevet nedenfor, blev godkendt af Kommunernes Etisk udvalg ved Nencki Institut for Eksperimentel Biologi, polske videnskabsakademi.

Bemærk: Nogle af scenerne i den tilhørende video accelereres. Speed ​​faktor er angivet i disse scener.

1. Kirurgi Forberedelse

1. Sterilisere alle redskaber, glas beholdere til væsker og vatpinde i autoklaven. Brug undværlige handsker. Rengør operationsbordet, den stereotaktisk ramme og alle de omkringliggende område med 70% ethanol. Brug en steril kirurgisk pad til at skabe et sterilt rum for alt det steriliseret udstyr. Skær Gelfoam i små stykker og suge dem i sterilt saltvand.
   Bemærk: I henhold til vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, ethanol er hverken en steriliserende eller et højt niveau desinfektionsmiddel. Det bør kun bruges som en rengøring / affedtning agent på tidligere steriliserede overflader.
2. Sæt dyret i the induktion kammer og indstil isofluran niveauet til 5% og oxygen flow til 2 l / min. Denne procedure bør tage omkring 3 min.
3. Tag dyret ud af induktion kammeret. Brug hale eller tå trykker for at sikre, at dyret er fuldt bedøvet.
4. Ved hjælp af en præcis trimmer barbere hår fra bagsiden af ​​hovedet (mellem ørerne) op til øjnene.
5. Sende dyret i stereotaktisk ramme og stabilisere hovedet med øre barer.
6. Set anæstesi niveauer til 1,5-2% isofluran og 0,3 l / min oxygen.
7. Påfør øjensalve.
8. Injicere dyret subkutant med Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) og Baytril (5 mg / kg) for at forhindre inflammation, smerte og infektion, hhv.
9. Injicere dyret intramuskulært med dexamethason (0,2 mg / kg) for at forhindre hævelse af hjernen.
   Bemærk: Det er muligt at injicere Dexamethasone subkutant eller intraperitonealt at forhindre muskelskader.
10. Rens huden ved hjælp af sterile vatpinde med Betadine, efterfulgt af 70% ethanol.
11. Skift handskerne og sprøjte dem med 70% ethanol.
    Bemærk: Mens du bruger engangshandsker ikke røre det sterile område. Tryk på dyret kun med spidserne af sterile kirurgiske instrumenter og sterile vatpinde.

2. Kranie Window Surgery

1. Løft huden med pincet og anvendelse af mikro saks incise huden vandret langs bunden af ​​hovedet og derefter skråt til den forreste punkt mellem øjnene. Fjerne huden flap.
2. Påfør lidocainsalve med en steril vatpind på periosteum at forhindre voldsom blødning og smerte.
3. Brug sterile vatpinde eller en skalpel til at fjerne periost. Tør kraniet med sterile vatpinde.
4. Ved hjælp af en steril nål anvende tætte cyanoacrylatlim på huden kanter for at immobilisere dem og forhindre kontakt med dental cement. Vent på limen tørre.
5. Læg en steril 3 mm dækglas løbet than kranium anteriort til lambdoid sutur. Centrer dækglasset på RSC koordinater: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Mark dækglasset kanter ved at skrabe kraniet overflade med en steril nål. Sæt dækglasset tilbage i steril beholder med 70% ethanol.
6. Brug en høj hastighed tandlægebor med grat lille diameter til at skitsere en cirkel diameter 3 mm. Rengør borestedet fra knoglen støv med sterilt saltvand dyppet podninger. Brug Gelfoam og svaberprøver at stoppe lejlighedsvis blødning og rengør knoglen.
7. I mellem boring kontrollere knoglen tykkelse med fine pincet ved forsigtigt at røre knoglerne cirkel og kontrollere dens mobilitet. Husk, at knoglen er tykkere på suturen område. Stop boringen når knoglen cirkel er mobilt og kun et jævnt, tyndt lag af knogle efterlades på omkredsen. Rengør operationelle felt af alle de resterende knogle støv med saltvand dyppet podninger.
8. Drop den sterilt saltvand på boring område, der dækker det borede circle. lirke forsigtigt knoglen cirkel med fine pincet og derefter forsigtigt, men fast fjerne knoglen ved at løfte det opad. Pas på ikke at forvrænge knoglen cirkel, mens du løfter den for at forhindre eventuelle skader på dura.
9. anvende forsigtigt Gelfoam dyppet i sterilt saltvand på dura at hjælpe med at stoppe blødningen. Vent indtil alle blødningen er helt stoppet. Fjern forsigtigt Gelfoam ikke at forstyrre størkningsprocessen.
   Bemærk: sutur området er yderst vaskulariseret, så blødning på dette tidspunkt kan vise sig at være dyb. Det er vigtigt at vente på den tilstrækkelig tid til blødningen til at stoppe helt. Det er nyttigt at holde saltvand-gennemvædet Gelfoam afkølet ved at placere den på is.

3. Virus Injection

1. Fastgør infusionspumpe til stereotaktisk tårn og tilslut controlleren.
2. Sæt 35G nål ind i sprøjten. Skyl sprøjten 10 gange med ethanol for at sterilisere den og 10 gange med sterilt saltvand til fjernelse af spor af ethanol. Fjern luftbobler fra sprøjten. Sæt sprøjten ind i pumpen.
   Bemærk: Overvej at bruge andre desinfektionsmidler.
3. Optø en enkelt dosis af rAAV2 / 1 ^mCherry forberedelse (10 ¹² pfu anbefales), og holde den på is. Fyld sprøjten med virus løsning.
4. Centrer nålen på bregma og derefter forsigtigt indsætte i hippocampus ved hjælp af følgende koordinater: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Disse koordinater vil blive placeret i nærheden af ​​kanten af ​​kraniotomi. Vent i 5 minutter for vævet at stabilisere.
5. Indsprøjtes 0,7 ul af rAAV2 / 1 ^mCherry løsning med en hastighed på 50 nl / min. Vente 10 min for at virus kan fuldt adsorbere. Fjern forsigtigt nålen. Dup med Gelfoam hvis blødningen forekommer. Gentag med den kontralaterale side.

4. Kranie Window Implantation

1. Lå den sterile, tørrede dækglas på toppen af ​​dura i det borede cirkel ramme. Hold dækglasset med kræfeps til forsigtigt flade dura og bringe dækglas 'kanter tættere på kraniet overflade.
   Bemærk: Det er muligt, at dækglasset forstyrrer blodprop og blødende genoptages. Hvis det er tilfældet, skal du løfte dækglasset, placere den i alkohol, tørt og vende tilbage til trin 2.9.
2. Ved hjælp af en steril nål anvende den tætte cyanoacrylat lim på dækglasset kanter for at fastgøre dem til kraniet. Vent på limen tørre.
3. Placer en fiksering bar (M2 møtrik eller en skræddersyet design) i den forreste del af kraniet. Påfør cyanoacrylatlim over kanterne af overliggeren. Vent på limen tørre.
   1. Placer fiksering bar i en position, der vil gøre det muligt horisontal placering af kranie vindue under billeddannelse session. Placer den så fjernt som muligt fra vinduet. Hvis den er placeret for tæt på vinduet, kan baren og skruen forbinder det med skræddersyet holder udgøre som en hindring for målet under billeddannende proces.
4. Opret en cap med dental akryl, der dækker resten af ​​den operationelle område, hud kanter, fiksering bar, styrkelse krateret omkring kraniel vindue. Vent på dentalcement at hærde.
5. Fjern dyret fra stereotaktisk ramme og sætte det ind i recovery kammer.
6. Vent på, at dyret kan komme fra kirurgi under iagttagelse af fysiologiske funktioner.
7. Påfør postoperativ analgesi (carprofen, 10 mg / kg) og antibiotika behandling (Baytril, 5 mg / kg) i 48 timer.

5. Imaging

1. Start Ti: Sapphire laser, tænd for mikroskopet. Den i dette forsøg anvendte system er udstyret med en to-foton laser, OPO-system og dobbelt Gaasp PMT.
2. Aflive dyret i induction kammer og inducere anæstesi.
3. Fjern dyret fra induktion kammeret og sted i gassen anæstesi masken under mikroskopet. Formindsk ilt flow til 0,3 l / min og isofluran koncentration til 1,5-2%.
4. Fastgør dyret til den brugerdefinerede mikroskop ramme med en M2 skrue (eller en anden brugerdefineret system). Niveau den kraniel vindue.
   Bemærk: Det er muligt at bruge mikroskopet producentens hoved fiksering-system, selv om den specifikke brugerdefinerede ramme giver bedre resultater (forbedret hoved stabilitet, konstant positionering i flere sessioner i løbet af en kronisk eksperiment).
5. Brug af Vidvinklet mikroskop indstillinger og en lav forstørrelse objektiv center visningen på en af ​​siderne af retrospenialis cortex og fokusere den på dækglasset overflade.
6. Påfør en dråbe vand i krateret-lignende akryl brønd. Skift til en lang distance nedsænkning i vand mål. Flyt målet mod kraniel vindue indtil vandet menisken connects prøven og objektiv.
7. Skift til to-foton-indstillinger og begynde at scanne prøven top til bund ved hjælp laveste zoom. Den passage af dura mater vil være synlig som en blænding af høj non-specifikt signal.
8. Juster erhvervelse mikroskop i begge kanaler (GFP og mCherry) ifølge signalstyrken fra fluorescerende celler for at dække hele det dynamiske område.
9. Efter at have fundet en egnet neuron (med den dendritiske træ adskilt fra andre celler) udfører en indledende scanning ved hjælp af kun GFP filterset med laveste zoom og z-afstand på 5 mikron.
10. Anskaf en maksimal projektion af det scannede stakken og udskrive det for anmærkninger (ved hjælp af omvendte farver).
11. Indstil zoom til en værdi, der vil gøre det muligt at billedet af de ønskede morfologiske detaljer. Billede hele dendritiske træ i GFP og mCherry kanaler ved hjælp maksimal projektion som guide.

Representative Results

Ekspressionen af GFP i en delmængde af neuroner i Thy1-GFP reporter mus tillader in vivo-billeddannelse af kortikale dendritter og lokale axonale projektioner i RSC. Figur 1A viser maksimal projektion af en stabel af billeder med flere GFP-positive dendritter synlige. Cellelegemet sløres af en arterie. Figur 1B viser et enkelt plan zoomet billede (digital zoom 3x) af den dendritiske gren angivet i 1A. Nærmere oplysninger om dendritisk morfologi (pigge, filopodia) er klart synlige. GFP kanal er erhvervet ved hjælp af band pass emission filter 500-550 nm.

En injektion af rAAV2 / 1 ^mCherry i den dorsale hippocampus tillader visualisering af hippocampale axoner og synaptiske boutons ender i RSC. Disse klemmer kan detekteres i mCherry kanal (den band pass emission filter 570-610 nm).

Figur 1. To kanal in vivo to-foton billeddannelse af RSC neuroner og hippocampus fremskrivninger til RSC. (A) En oversigt over de GFP-udtrykkende celler i et fragment af RSC (billedet vist i omvendte farver). Maksimal projektion vist af en 100 um tyk stak taget ved lav forstørrelse (0,7x digital zoom). (B) Single optisk plan af fragmentet anført i (A) opnået ved stor forstørrelse (3x digital zoom) i GFP kanal. (C) Single optisk plane fragment er angivet i (A) ved hjælp af indstillinger mCherry erhvervelse. Se Protokol for oplysninger om afsløring filtre. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

I den aktuelle afhandling præsenterer vi en protokol til samtidig to-foton in vivo billeddannelse af de synaptiske input og postsynaptiske mål i RSC gennem en kraniel vindue. Proceduren for implantation består af flere vigtige skridt. Først dyret dybt bedøvet og fikseret i stereotaktisk ramme, så kraniet over RSC fortyndes med et bor langs de markerede cirkulære linjer og den cirkulære knogle er fjernet. Efter blødningen er stoppet, er rAAV2 / 1 ^mCherry injiceret i hippocampus, og dækglasset er fastgjort til kraniet over det borede område. Endelig fikseringen bar er fastgjort på hovedet og dyret anbringes i opsvinget kammer i 48 timer. Efter ca. 2-3 uger er nødvendige for virus-ekspression, kan RSC visualiseres. Den billeddannende Protokollen består af følgende trin. Først bliver dyret bedøvet og fikseret under mikroskopet. Fokus er derefter indstilles ved hjælp af Vidvinklet mikroskop, at systemet er switched ind i de to-foton mode og kanalerne af interesse (GFP og mCherry) visualiseres.

Den præsenterede teknik giver en væsentlig forbedring i forhold til de tidligere beskrevne protokoller. I standard tilgang, kunne kun én type af en etiket påvises. Det kan bruges til at afbilde lokal axonale projektioner og dendritiske træer, men ingen stor rækkevidde undersøgelser var muligt. Ved at kombinere to fluorescerende proteiner aktiveret vi samtidig sporing af præ- og postsynaptiske elementer. Dette tillader langvarig in vivo monitorering af formodede synaptiske forbindelser.

For at opnå de optimale resultater i den beskrevne procedure, er det vigtigt at være opmærksom på flere kritiske trin. Under løfte knoglen cirkel i trin 2.8 eventuelle skader på dura kan forårsage betændelse og forringe gennemsigtigheden af ​​kranie vindue. Utilstrækkelig standsning af blødning i trin 2.9 eller på ethvert andet trin i proceduren resulterer i blod accumulation under vinduet og reducerer synsfeltet betydeligt. Efter indsprøjtning af virus er det afgørende at vente mindst 10 min inden nålen fjernes, for at virusset til infusion ind i vævet på injektionsstedet eneste sted. Det begrænser muligheden for uønsket smitte af cortex med virus under nålen fjernelse. Det område af viral transfektion bør undersøges med en post hoc histologisk analyse af hjernevæv. bør undgås Enhver mCherry udtryk i celler langs nålen spor. Standarden restitutionstid er 3 uger. Denne periode er tilstrækkelig for at virus kan nå stabil ekspression i de synaptiske fremspring og for den kraniale vinduet til fuldt ud at helbrede og stabilisere. Dyrene enkelt opstaldet for at forhindre fjernelse af kraniale vinduet implantatet ved burets hjælpere. Brugen af ​​en udvidet bur kunne overvejes for at undgå utilsigtet beskadigelse af kranie vindue ved at ramme metalstænger. Stabil fiksering af mouse under mikroskop er afgørende. Enhver hoved bevægelse, herunder vejrtrækning bevægelser, kan forårsage betydelig reduktion i kvaliteten af ​​de opnåede billeder. Det er også nyttigt at placere kraniel vindue vandret til målet, at begrænse eventuelle problemer med at erhverve lige fokus for hele flyet af vinduet. Klare kriterier for løsning af pigge og boutons bør anvendes. Generelt er boutons defineres som axonale hævelser med en diameter på mindst 3 gange større end den foregående fiber ^7. Pigge defineres som klart adskilte fremspring fra dendritceller aksel, der indeholder en pæreformet hoved. Yderligere opdeling i populationer af tynde, stumpet, champignon og forgrenede pigge er muligt ^3. På grund af den relativt dårlige aksiale løsning af to-foton mikroskopi, bør undgås analyse af pigge, der strækker langs den optiske akse ^3. For klart at skelne funktionelle boutons og pigge, en post hoc immunolabelingkan udføres for at identificere præ- og postsynaptiske markører ^7.

Selv om den præsenterede protokol viste sig at være den mest favorable i vore eksperimentelle design, er det muligt at modificere det for at passe forskellige eksperimentelle mål. Nogle gange er det mere passende at bruge injicerbar anæstesi (såsom ketamin-xylasine) i stedet for isofluran, men det er vigtigt at tilstrækkeligt justere doseringen, holde huske forskelle i narkotika modtagelighed mellem mus af forskellige stammer, alder og køn. Det er muligt at anvende en trepan bur i stedet for en sfærisk én for boring, men det kan øge risikoen for beskadigelse af dura. Sterilt saltvand med held kan erstattes med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), men det er vigtigt at holde den steril hele tiden under fremstilling og drift. ACSF er stabil i 3-4 uger efter tilberedning, og hvis nogen forurening sker før dette tidspunkt skal det straks kasseres. Forskellige hoved fixatipå enheder kan anvendes, afhængigt af den eksperimentelle design, herunder muligheden for at observere vågen mus under to-foton mikroskop.

Som enhver anden teknik, denne ene har også sine begrænsninger. De to-foton mikroskop muliggør visualisering af hjernevæv op til 500 um dyb fra dura overflade. For undersøgelse af de dybere hjernens strukturer skal anvendes yderligere ændringer. Vores protokol giver adgang til de fleste af RSC, men den del af strukturen skjult under den overlegne sinus sagittalis er stadig ikke tilgængelig. Løsningen af ​​de to-foton mikroskop er ikke tilstrækkeligt til identifikation af et bestemt synapse samt detaljeret morfologisk analyse af dendritiske pigge. Yderligere teknikker, såsom korrelativ elektronmikroskopi skal anvendes med henblik på at bekræfte eksistensen af ​​en formodet struktur. Det er også vigtigt at nævne, at dette er en relativt vanskelig kirurgisk teknik, og det er ikke recommended for en unexperienced operatør.

De præsenterede teknik kan anvendes på en lang række eksperimenter. Den kan modificeres til undersøgelse af forskellige hjerneregioner tilgængelige med to-foton mikroskop. Det muliggør samtidig overvågning af axonal og dendritiske ændringer under forskellige fysiologiske og patologiske tilstande, herunder kognitive processer og aldrende eller progression af neurologiske og psykiatriske lidelser. Det tillader brug af cellespecifikke promotorer at visualisere fremspring oprindelse på præcist definerede neuronale delmængder. Det kan også justeres til at passe protokollerne for eksperimenter på vågen og opfører dyr. Endvidere kan calcium- eller pH- følsomme proteiner udtrykkes i hjernen for at visualisere ikke blot neuronale morfologi men også ændringer i celleaktivitet og funktion. En anden mulig ændring af tilgangen er brugen af ​​en anden rAAV serotype for mCherry udtryk. Det kimære 2/1 serotype provides robust udtryk på injektionsstedet med tilstrækkeligt hurtigt indsættende (2-3 uger). De mCherry niveauer forblev stabil i mindst 12 uger efter indledende udbrud, og ingen retrograd mærkning blev påvist i vores eksperimenter. For at opnå retrograd mærkning, kan en anden serotype anvendes, såsom rAAV9. Billeddannelsesproduktet sessioner kan udføres ved alle frekvenser, dog anbefales mindst 24 timers interval for at muliggøre korrekt genvinding af dyret efter bedøvelse. Hvis de anvendes korrekt, denne teknik tillader at udføre flere billeddiagnostiske sessioner i samme region i løbet af flere måneder. For langsigtede forsøg (mere end 6 måneder), kan en Cre / LoxP systemet, anvendes med rekombinasen leveres med AAV vektoren i en floxed GFP mus linje.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Drug
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	5-2% pre-operative
Isoflurane	Baxter	AErrane 8DG9623	1.5-2% during surgery
Dexametasone	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0.2 mg/kg intramuscular
Baytril	Bayer	2.50%	5 mg/kg subcutaneously
Tolfedine	Vetoquinol	4%	4 mg/kg subcutaneously
Butomidor	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg subcutaneously
Carprofen	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg subcutaneously
Lidocaine	Jelfa	Lignocainum	topically
Lidocaine	Jelfa	20 mg/g	topically
Surgery
Gelfoam	Ethicon	Spongostan dental; REF MS0005
Eye ointment	Dedra	Lubrithal	topically
CA glue	Pelikan Daniel	20G Huste
Dental acrylic	SpofaDental	Duracryl Plus
Stereotaxic frame	Stoelting	51500D
Tool
Coverglass	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	3 mm diameter
Dental drill	Sigmed	Keystone KVet
Fixation bar	Custom made	N/A	M2 or M3 screw nuts could be used
Forceps	Renex	PN-7B-SA
Micro scissors	Falcon	BM.183.180
Dissection microscope	KOZO	XTL6445T
Imaging
Holder frame	Custom made	N/A
Two-photon microscope	Zeiss	Upright Axio Examiner Z1	Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors.
Reagent
Virus	gift from K. Deisseroth		Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter