Introduction
Twee-foton microscopie een revolutie in de observatie van de hersenactiviteit in levende en gedragen dieren. Sinds de introductie in 1990 al snel aan populariteit gewonnen en wordt nu geïmplementeerd als een van de meest interessante en innovatieve benaderingen in de richting van het onderzoek van een groot aantal aspecten van de hersenactiviteit in vivo 1,2. Deze toepassingen omvatten metingen van de bloedstroming, neuronale activering (bijvoorbeeld met behulp van calcium niveau-indicatoren of onmiddellijke vroege genen expressie) en de morfologie van neuronale cellen. Steeds laboratoria twee-foton microscopen, waarmee de techniek gehele wetenschap als een nieuwe standaard voor in vivo beeldvorming van de hersenen.
De standaard aanpak omvat de implantatie van het craniale venster (een rond gat in de schedel bedekt met een deksel glas) over het vat of de visuele cortex van de hersenen van muizen 3. Volgende, afhankelijk van de experimentele protocol, het mouse ondergaat een reeks visualisatie en gedragsmatige trainingen, zodat de veranderingen in de hersenactiviteit en neuronale morfologie tijd 4,5 volgen. In beide gevallen craniotomie alleen invloed op de pariëtale botten, zonder over de hechtingen. Het is grotendeels aangenomen dat de belangrijkste nadeel van deze techniek is de beperkte toepassing er eenvoudig cortex als het vat of visuele cortex. Implantatie van het craniale raam over andere gebieden vormt veel moeilijkheden vanwege overmatig bloeden en / of ruimtelijke belemmering.
In dit artikel stellen we de inplanting van de craniale raam boven de retrospleniale cortex (RSC) als een andere mogelijke regio van belang voor twee-foton in vivo microscopie 6. RSC is een belangrijk onderdeel van de hersenen circuit verantwoordelijk voor ruimtelijke geheugenvorming. Anatomisch, RSC is een onderdeel van een neuronaal netwerk tussen corticale, hippocampus en thalamus regio's 7. Het issterk betrokken bij een reeks van gedrag, zoals ruimtelijke leren en uitsterven, evenals ruimtelijke navigatie 6.
Om de morfologische veranderingen van de neuronen te visualiseren gebruiken we een transgene muis tot expressie groen fluorescerend eiwit (GFP) onder de thy1 promoter. In deze muizen wordt GFP tot expressie gebracht in ongeveer 10% van de neuronen in de hersenen waardoor duidelijke visualisatie van de corticale axons en dendrieten behulp van twee-foton microscopie 8. Een andere innovatie die we voorstellen is de injectie van een recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 2/1 (rAAV2 / 1) codeert een rood fluorescerend eiwit (mCherry) onder een neuron-specifieke promoter 9 CaMKII in de diepere structuren van de hersenen projecteert RSC zoals de hippocampus. De expressie van rAAV2 / 1 mCherry in de hippocampus van Thy1-GFP muis maakt gelijktijdige visualisatie van pre- en postsynaptische elementen van de Hippocampo-Cortical synapsen 10. De rAAV-gestuurde expressie van mCherry vereist twee tot drie weken voor het eiwit voldoende niveau te bereiken in het axonale terminals. Deze periode is niet ongebruikelijk vereiste tijd voor herstel van craniotomie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hieronder beschreven experimentele procedures werden goedgekeurd door Lokale Ethische Commissie aan de Nencki Institute of Experimental Biology, Poolse Academie van Wetenschappen.
Opmerking: Sommige van de scènes in de bijbehorende video worden versneld. Snelheid factor wordt aangegeven in deze scènes.
1. chirurgie voorbereiding
- Steriliseren alle gereedschappen, glazen verpakkingen voor vloeistoffen en wattenstaafjes in de autoclaaf. Gebruik overbodig handschoenen. Reinig de operatietafel, het stereotactische frame en de omgeving met 70% ethanol. Gebruik een steriele chirurgische pad naar een steriele ruimte te creëren voor de gesteriliseerde apparatuur. Snijd gelfoam in kleine stukjes en week ze in een steriele zoutoplossing.
Let op: Volgens de Gids voor de Zorg en gebruik van proefdieren, ethanol is noch een sterilisatiemiddel, noch een hoog niveau ontsmettingsmiddel. Het mag alleen worden gebruikt als een reiniging / ontvetting agent op eerder gesteriliseerde oppervlakken. - Zet het dier the inductie kamer en stelt de isofluraan niveau 5% en zuurstoftoevoer tot 2 l / min. Deze procedure duurt ongeveer 3 minuten.
- Neem het dier uit de inductie kamer. Gebruik tail of teen knijpt om te verzekeren dat het dier volledig verdoofd.
- Met een nauwkeurige trimmer scheren het haar van de rug van de kop (tussen de oren) tot aan de ogen.
- Plaats het dier in de stereotaxische frame en stabiliseert de kop met oor bars.
- Stel anesthesie niveaus 1,5-2% isofluraan en 0,3 l / min zuurstof.
- Breng de oogzalf.
- Injecteer het dier subcutaan Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) en Baytril (5 mg / kg) ter voorkoming van ontsteking, pijn en infectie, respectievelijk.
- Injecteer het dier intramusculair met dexamethason (0,2 mg / kg) aan hersenen zwelling te voorkomen.
Opmerking: Het is mogelijk dexamethason subcutaan injecteren of intraperitoneaal spierschade voorkomen. - Reinig de huid met behulp van sterile wattenstaafjes met Betadine, gevolgd door 70% ethanol.
- Verander de handschoenen en spuit ze met 70% ethanol.
Opmerking: Tijdens het gebruik van wegwerphandschoenen hoeft het steriele veld niet aan. Raak het dier alleen met de toppen van steriele chirurgische instrumenten en steriele wattenstaafjes.
2. Cranial Window Surgery
- Til de huid met een tang via micro schaar incisie de huid horizontaal langs de basis van de kop en vervolgens schuin naar voren punt tussen de ogen. Verwijder de huid flap.
- Toepassen lidocaïne zalf met een steriel wattenstaafje over de periosteum overmatig bloeden en pijn te voorkomen.
- Gebruik steriele wattenstaafjes of een scalpel aan het beenvlies te verwijderen. Droog de schedel met steriele wattenstaafjes.
- Met behulp van een steriele naald toepassen dichte cyanoacrylaat lijm op de huid randen te immobiliseren en te voorkomen dat het contact met tandheelkundig cement. Wacht tot de lijm te drogen.
- Leg een steriele 3 mm dekglaasje op tHij schedel naar voren om de lambdoïde hechtdraad. Centreer het dekglaasje bij RSC coördinaten: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Mark de dekglaasje randen door krabben de schedel oppervlak met een steriele naald. Zet het dekglaasje terug in de steriele container met 70% ethanol.
- Gebruik een high-speed tandheelkundige boor met kleine diameter braam een cirkel met een diameter van 3 mm te schetsen. Maak de boorlocatie van het bot stof met een steriele zoutoplossing gedompeld swabs. Gebruik de Gelfoam en swabs om de occasionele bloeden te stoppen en het reinigen van de bot.
- Tussen het boren te controleren op het bot dikte met fijne tang door zachtjes aanraken van de bot cirkel en het controleren van de mobiliteit. Houd in gedachten dat het bot dikker is op gebied van de hechtdraad's. Stop met het boren wanneer het bot cirkel mobiel is en slechts een gelijkmatige, dunne laag van het bot is links op de omtrek. Maak de operationele gebied van alle resterende bot stof met een zoutoplossing gedompeld swabs.
- Laat de steriele zoutoplossing op het boren gebied, die het geboorde circle. Wrik voorzichtig het bot cirkel met fijn pincet en dan zachtjes maar stevig op het bot te verwijderen door naar boven te tillen. Wees voorzichtig het bot cirkel niet te scheef terwijl het opheffen van om mogelijke schade aan de dura te voorkomen.
- Voorzichtig toe te passen de gelfoam gedrenkt in steriele zoutoplossing op de dura te helpen stoppen met het bloeden. Wacht tot alle bloeden volledig is gestopt. Haal de gelfoam niet om het stollingsproces verstoren.
Opmerking: De hechtdraad gebied is zeer gevasculariseerde, zodat de bloeding op dit punt kunnen blijken diepgaand te zijn. Het is essentieel om te wachten op het wachten tot het bloeden stilstaan. Het is nuttig om de zoutoplossing gedrenkte Gelfoam gekoeld door het op ijs te houden.
3. Virusinjectie
- Bevestig de infuuspomp aan de stereotactische toren en sluit de controller.
- Steek de 35G naald in de spuit. Spoel de injectiespuit 10 maal met ethanol te steriliseren en 10 maal met steriele zoutoplossing om sporen te verwijderen ethanol. Verwijder luchtbellen uit de spuit. Breng de spuit in de pomp.
Opmerking: Overweeg het gebruik van andere desinfectiemiddelen. - Ontdooi een enkele dosis van rAAV2 / 1 mCherry bereiding (10 12 pfu wordt aanbevolen) en houd het op ijs. Vul de spuit met de virusoplossing.
- Centreer de naald op de bregma en vervolgens voorzichtig te voegen in de hippocampus met de volgende coördinaten: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Deze coördinaten worden in de buurt van de rand van de craniotomie. Wacht 5 minuten om het weefsel te stabiliseren.
- Injecteer 0,7 ul van de rAAV2 / 1 mCherry oplossing met een snelheid van 50 nl / min. Wacht 10 min voor het virus volledig te adsorberen. Verwijder voorzichtig de naald. Blot met gelfoam als bloeden optreedt. Herhaal dit met de contralaterale website.
4. Cranial Window Implantatie
- Leg de steriele, gedroogd dekglaasje op de top van de dura in de geboorde cirkellijst. Houd de dekglaasje met de krachteeps om voorzichtig plat de dura en breng coverglass 'randen dichter bij de schedel oppervlak.
Opmerking: Het is mogelijk dat de dekglaasje verstoort het stolsel en het bloeden hervat. Als dat het geval is, tilt u de dekglaasje, plaats hem in alcohol, droog en terug te keren naar stap 2.9. - Met behulp van een steriele naald gelden de dichte cyanoacrylaat lijm op de dekglaasje randen om ze te hechten aan de schedel. Wacht tot de lijm te drogen.
- Plaats een fixatiesteunen (M2 bout of een custom made ontwerp) in het voorste deel van de schedel. Breng de cyanoacrylaat lijm over de randen van de bar. Wacht tot de lijm te drogen.
- Plaats de fixatie bar in een positie die horizontaal positioneren van de craniale venster bij beeldvormend sessie mogelijk. Plaats deze zo ver mogelijk van het venster. Als het te dicht bij het raam is geplaatst, kan de bar en de schroef te verbinden met de op maat gemaakte houder zich voordoen als een obstakel voor het doel tijdens het beeldvormingsproces.
- Maak een pet met de tandheelkundige acryl, die de rest van de operationele omgeving, de huid randen, fixatie bar, de versterking van de krater rond de craniale venster. Wacht tot het tandheelkundig cement uitharden.
- Verwijder het dier uit de stereotaxische frame en zet het in het herstel kamer.
- Wacht totdat het dier herstellen van de operatie met inachtneming van de fysiologische functies.
- Toepassen postoperatieve analgesie (carprofen, 10 mg / kg) en behandeling met antibiotica (Baytril, 5 mg / kg) gedurende 48 uur.
5. Imaging
- Start de Ti: Sapphire laser, de macht van de microscoop. Het systeem dat in dit experiment is uitgerust met een twee-foton laser OPO systeem en dubbele GaAsP PMT.
- Zet het dier in de inductie kamer en induceren anesthesie.
- Verwijder het dier uit de inductie kamer en plaats in de gas anesthesie masker onder de microscoop. Verlaag de zuurstoftoevoer naar 0,3 l / min en de isofluraan concentratie 1,5-2%.
- Bevestig het dier aan de aangepaste microscoop frame met een M2 schroef (of een ander aangepast systeem). Niveau van de craniale venster.
Opmerking: Het is mogelijk om het hoofd fixatie de microscoop fabrikant systeem, hoewel het specifieke custom lijst geeft betere resultaten (verhoogde schuimkraag stabiliteit constante positionering in meerdere sessies chronisch experiment). - Met de groothoek microscoop instellingen en lage vergroting doelstelling center het uitzicht op een van de zijden van de retrospleniale cortex en focussen op het dekglaasje oppervlak.
- Breng een druppel water in de krater-achtige acryl ook. Overschakelen naar een lange afstand water immersie objectief. Verplaats het doel de richting van de craniale venster totdat het water meniscus connects het monster en objectief.
- Schakel over naar twee-foton instellingen en beginnen met het scannen van het monster boven naar beneden met de laagste zoom. De oversteek van de dura mater wordt zichtbaar als een schittering van hoge niet-specifieke signaal.
- Pas de microscoop acquisitie instellingen in beide kanalen (GFP en mCherry) volgens de signaalsterkte van fluorescerende cellen om het gehele dynamische bereik dekken.
- Na het vinden van een geschikte neuron (met de dendritische boom gescheiden van andere cellen) uitvoeren van een eerste scan met alleen de GFP filterset met de laagste zoom en z-afstand van 5 micron.
- Zorg voor een maximale projectie van de gescande stack en print het voor annotaties (met behulp van omgekeerde kleuren).
- Stel zoom in op een waarde die het mogelijk maakt om het beeld van de gewenste morfologische details. Het imago van de gehele dendritische boom in het GFP en mCherry kanalen met een maximale projectie als gids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De expressie van GFP in een subset van neuronen in de Thy1-GFP reporter muis maakt in vivo beeldvorming van de corticale dendrieten en lokale axonale projecties RSC. Figuur 1A toont maximale projectie van een stapel van beelden met meerdere GFP-positieve dendrieten toegankelijk. De cel lichaam wordt verduisterd door een slagader. Figuur 1B toont een enkel vlak ingezoomd beeld (digitale zoom 3x) van de dendritische tak aangegeven in 1A. Details van dendritische morfologie (stekels, filopodia) duidelijk zichtbaar. De GFP-kanaal wordt verkregen met behulp van de band pass filter emissie 500-550 nm.
Een injectie rAAV2 / 1 mCherry in de dorsale hippocampus maakt visualisatie van de hippocampus axonen en synaptische boutons eindigend in RSC. Deze terminals kunnen worden gedetecteerd in de mCherry kanaal (de band pass filter emissie 570-610 nm).
Figuur 1. Tweekanaals in vivo twee-foton beeldvorming van RSC en hippocampus neuronen uitsteeksels RSC. (A) Een overzicht van de GFP tot expressie brengende cellen in een fragment van RSC (afbeelding gemarkeerd weergegeven). Maximale projectie getoond van een 100 um dikke stapel genomen bij een lage vergroting (0.7x digitale zoom). (B) Enkelvoudige optische vlak van de in (A) fragment verworven bij een hoge vergrotingsfactor (3x digitale zoom) in het GFP-kanaal. (C) Enkelvoudige optische vlak fragment aangegeven in (A) met de acquisitie instellingen mCherry. Zie protocol voor meer informatie over de detectie filters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In het huidige artikel presenteren we een protocol voor simultane twee-foton in vivo beeldvorming van de synaptische ingangen en postsynaptische targets in RSC door een craniale raam. De implantatieprocedure bestaan uit een aantal belangrijke stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en diep in de stereotactische raamwerk aangebrachte vervolgens de schedel over RSC verdund met een boor langs de gemarkeerde cirkellijnen en de cirkelvormige bot wordt verwijderd. Nadat het bloeden is gestopt, wordt de rAAV2 / 1 mCherry geïnjecteerd in de hippocampus en het dekglaasje bevestigd aan de schedel over de geanalyseerde gebied. Tenslotte wordt de fixatiesteunen is bevestigd op de kop en het dier wordt geplaatst in het herstel kamer voor 48 uur. Na ongeveer 2-3 weken nodig voor het virus expressie, kan de RSC worden gevisualiseerd. De beeldvorming protocol bestaat uit de volgende stappen. Eerst wordt het dier verdoofd en onder de microscoop vastgesteld. De focus wordt vervolgens met behulp van de groothoek microscoop, het systeem is switched in de twee-foton modus en de kanalen van belang (GFP en mCherry) gevisualiseerd.
De gepresenteerde techniek biedt een belangrijke verbetering ten opzichte van de eerder beschreven protocollen. In de standaardbenadering, kon slechts één type label worden gedetecteerd. Het kan worden gebruikt om het plaatselijke axonale en dendritische uitsteeksels bomen, maar geen lange afstand verbinding studies mogelijk waren. Door twee fluorescerende eiwitten nodig we gelijktijdig opsporen van pre- en postsynaptische elementen. Dit maakt het mogelijk op lange termijn in vivo monitoring van vermoedelijke synaptische verbindingen.
Om optimale resultaten in de beschreven werkwijze te verkrijgen, is het belangrijk om aandacht te geven aan verschillende kritische stappen. Tijdens het tillen het bot cirkel in stap 2,8 schade aan de dura ontsteking kunnen leiden waardoor de transparantie van de craniale venster. Onvoldoende stopzetting van bloeding in stap 2,9 of op een andere stap van de procedure resulteert in bloed accumulation onder het raam en vermindert het gezichtsveld. Na het injecteren van het virus is het essentieel om te wachten gedurende ten minste 10 minuten voordat de naald, zodat het virus doordringen in het weefsel op slechts de injectieplaats. Het beperkt de mogelijkheid van ongewenste infectie van de cortex met het virus tijdens de naald te verwijderen. Het gebied van het virale transfectie worden onderzocht met een post hoc histologische analyse van het hersenweefsel. Elke mCherry expressie in cellen langs de naald spoor worden vermeden. De standaard hersteltijd is 3 weken. Deze periode is voldoende om het virus stabiele expressie komen in de synaptische projecties en de craniale venster volledig genezen en te stabiliseren. De dieren moeten enkel worden gehuisvest om verwijdering van de craniale venster implantaat te voorkomen door de kooi mates. Het gebruik van een uitgebreide kooi zou kunnen worden overwogen om onopzettelijke beschadiging van de craniale venster te vermijden door het raken van de metalen staven. Stabiele fixatie van de mouse onder de microscoop essentieel. Elke beweging van het hoofd, met inbegrip adembewegingen kunnen significante vermindering van de kwaliteit van de verkregen beelden veroorzaken. Het is ook nuttig om de craniale venster horizontaal positioneren het doel, om mogelijke problemen met het verkrijgen gelijk focus voor het gehele vlak van het venster beperken. Duidelijke criteria voor het oplossen van stekels en boutons moeten worden toegepast. In het algemeen worden gedefinieerd als boutons axonale zwelling met een diameter van ten minste 3 maal groter zijn dan voorgaande vezel 7. Stekels worden gedefinieerd als duidelijk te onderscheiden uitsteeksels van de dendrite schacht die een bolle kop bevatten. Verdere opdeling in populaties van dunne, stompe, champignons en vertakte stekels is mogelijk 3. Door de relatief slechte axiale resolutie van de twee-foton microscopie, zou analyse van stekels die uitsteken langs de optische as 3 worden vermeden. Om duidelijk onderscheid te maken functionele boutons en stekels, een post hoc immunokleuringkan worden uitgevoerd om pre- en postsynaptische markers 7 identificeren.
Hoewel de gepresenteerde protocol bleek de sterkste van onze experimentele ontwerpen, is het mogelijk om het om verschillende experimentele doelen passen wijzigen. Soms is geschikt voor injecteerbare narcose (bijvoorbeeld ketamine-xylasine) in plaats van isofluraan, maar het is belangrijk om de dosering voldoende passen, rekening houdend met de verschillen in drug gevoeligheid tussen muizen van verschillende stammen, leeftijd en geslacht. Het is mogelijk om een trepan gebruiken boor in plaats van een bolvormige een voor het boren, maar het zou het risico van schade aan de dura verhogen. Steriele zoutoplossing succes kan worden vervangen met kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF), maar het is belangrijk om deze steriel te allen tijde tijdens bereiding en gebruik. ACSF is stabiel gedurende 3-4 weken na de bereiding, en eventuele besmetting plaatsvindt vóór die tijd moet het onmiddellijk worden weggegooid. Verschillende hoofd fixatiop inrichtingen kunnen worden toegepast, afhankelijk van het experimentele ontwerp, inclusief de mogelijkheid van het waarnemen van de wakkere muis onder de twee-foton microscoop.
Als een andere techniek, deze heeft ook beperkingen. De twee-foton microscoop maakt visualisatie van het hersenweefsel tot 500 pm diep vanaf het dura oppervlak. Voor het onderzoek van de diepere hersenstructuren moeten aanvullende wijzigingen worden aangebracht. Ons protocol biedt toegang tot de meeste RSC, maar het deel van de constructie verborgen onder de bovenste sagittale sinus is nog niet toegankelijk. De resolutie van de twee-foton microscoop niet voldoende is voor de identificatie van een specifieke synaps evenals gedetailleerde morfologische analyse van dendritische stekels. Aanvullende technieken, zoals correlatieve elektronenmicroscopie worden toegepast om de aanwezigheid van een vermoedelijke structuur te bevestigen. Het is ook belangrijk om te vermelden dat dit een relatief moeilijke chirurgische techniek en het is niet recommended voor een onervaren operator.
De voorgestelde techniek kan worden toegepast in een groot aantal experimenten. Het kan worden aangepast voor het onderzoeken van verschillende hersengebieden toegankelijk met de twee-foton microscoop. Het maakt gelijktijdige monitoring van axonen en dendrieten veranderingen tijdens verschillende fysiologische en pathologische toestanden met inbegrip van cognitieve processen en veroudering of progressie van neurologische en psychiatrische aandoeningen. Het maakt het gebruik van celspecifieke promoters projecties oorsprong op nauwkeurig bepaalde neurale subsets visualiseren. Het kan ook worden aangepast aan de protocollen experimenten passen op wakker en gedragen dieren. Bovendien kunnen calcium- of pH- gevoelige eiwitten worden tot expressie gebracht in de hersenen om niet alleen visualiseren neuronale morfologie, maar ook veranderingen in celactiviteit en functie. Een andere mogelijke modificatie van de benadering is het gebruik van verschillende rAAV serotype mCherry voor expressie. Chimeer 2/1 serotype provides robuuste uitdrukking op de injectieplaats met een voldoende snelle aanvang (2-3 weken). De mCherry bleven stabiel gedurende tenminste 12 weken na de eerste begin en geen retrograde labeling werd waargenomen in onze experimenten. Om retrograde labeling verkrijgen, kan een ander serotype te gebruiken, zoals rAAV9. De imaging-sessies kunnen worden uitgevoerd op een bepaalde frequentie, maar ten minste 24-uur interval is aan te bevelen om een goede herstel van het dier na de verdoving toe te staan. Als dit goed wordt toegepast, deze techniek maakt het uitvoeren van meerdere beeldvorming sessies van dezelfde regio in de loop van enkele maanden. Voor langdurige experimenten (langer dan 6 maanden), kan een van Cre / loxP systeem gebruikt met de bij het AAV vector in een floxed GFP muizenlijn recombinase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs (KL, MR, KR) rechten hebben voor patent pending (PL410001) voor Holder kader gebruikt in dit artikel.
Acknowledgments
De auteurs willen graag M. Steczkowski bedanken voor stemopnames, M. Borczyk voor tekeningen, A. Trąbczyńska voor virus productie, M. Ziókowska voor genotypering en A. Mirgos voor hulp bij het filmen. KR erkent de vriendelijke gift van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) tot expressie mCherry fluorescerend eiwit onder de controle van CaMK promoter van K. Deisseroth. Dit project werd uitgevoerd bij de kernfaciliteiten van Laboratorium diermodellen en Laboratorium voor Tissue Structure and Function, Centrum voor Neurobiologie, Nencki Institute of Experimental Biology uitgevoerd, met het gebruik van de CEPT de infrastructuur door de Europese Unie wordt gefinancierd - het Europees Fonds voor Regionale ontwikkeling binnen het operationeel programma "innovatieve economie" voor de periode 2007-2013. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Science Centre: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02.996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00.861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00.691 tot KR en Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
