Introduction
La microscopie à deux photons a révolutionné l'observation de l'activité cérébrale dans la vie et de se comporter animaux. Depuis son introduction en 1990 , il a rapidement gagné en popularité et est maintenant mis en œuvre comme l' une des approches les plus intéressantes et novatrices en vue de l' examen de nombreux aspects de l' activité cérébrale in vivo 1,2. Ces applications comprennent des mesures du flux sanguin, l' activation des neurones (par exemple, en utilisant des indicateurs de niveau de calcium ou des gènes précoces immédiats expression) et la morphologie des cellules neuronales. Un nombre croissant de laboratoires utilisent des microscopes à deux photons, la mise en œuvre de la technique à travers le monde scientifique comme une nouvelle norme pour l'imagerie in vivo du cerveau.
L'approche standard consiste à l' implantation de la fenêtre crânienne (un trou rond dans le crâne recouvert d'un couvercle en verre) sur le canon ou le cortex visuel du cerveau de la souris 3. Ensuite, selon le protocole expérimental, le MOUSE subit une série de visualisation et des séances de formation de comportement, ce qui permet de suivre l'évolution de l'activité du cerveau et de la morphologie neuronale au cours du temps 4,5. Dans les deux cas, la craniotomie affecte uniquement l'os pariétal, sans traverser les sutures. Il est notoire que le principal inconvénient de cette technique est limitée à son application cortexes facilement accessible tel que le canon ou le cortex visuel. Implantation de la fenêtre crânienne par rapport aux autres régions pose beaucoup de difficultés, en raison de saignements excessifs et / ou entrave spatiale.
Dans cet article , nous proposons l'implantation de la fenêtre crânienne au- dessus du cortex rétrosplénial (RSC) comme une autre région d'intérêt possible pour les deux photons en microscopie in vivo 6. RSC est un élément important du circuit responsable de la formation de la mémoire spatiale du cerveau. Anatomiquement, RSC est une partie d'un réseau neuronal de connexion corticale, hippocampique et régions thalamiques 7. C'estfortement impliqué dans une gamme de comportements, tels que l' apprentissage spatial et de l' extinction, ainsi que la navigation spatiale 6.
Afin de visualiser les changements morphologiques des neurones , nous utilisons une lignée de souris transgéniques exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous le promoteur de Thy1. Chez ces souris, la GFP est exprimée dans environ 10% des neurones dans le cerveau permettant une visualisation claire des axones et des dendrites corticaux utilisant microscopie à deux photons 8. Une autre innovation que nous proposons est l'injection d'un virus adéno-associé recombinant de sérotype 01/02 (rAAV2 / 1) codant pour une protéine fluorescente rouge (mCherry) sous une CaMKII promoteur spécifique des neurones 9 dans les structures plus profondes du cerveau faisant saillie vers le RSC telles que l'hippocampe. L'expression de rAAV2 / 1 mCherry dans l'hippocampe de souris Thy1-GFP permet la visualisation simultanée des éléments de pré- et post - synaptiques de la hippocampo-cortical synapses 10. L'expression rAAV mécanique de mCherry nécessite deux à trois semaines pour la protéine d'atteindre un niveau suffisant dans les terminaisons axonales. Cette période est conforme à l'heure habituelle nécessaire pour la récupération de craniotomie.
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Protocol
Toutes les procédures expérimentales décrites ci-dessous ont été approuvés par le comité d'éthique local à l'Institut Nencki de biologie expérimentale, Académie polonaise des sciences.
Note: Certaines des scènes dans la vidéo associée sont accélérés. Facteur de vitesse est indiqué dans ces scènes.
1. Chirurgie Préparation
- Stériliser tous les outils, les récipients en verre pour les liquides et les tampons de coton dans l'autoclave. Utiliser des gants dispensables. Nettoyer la table chirurgicale, le cadre stéréotaxique et toute la zone environnante avec 70% d'éthanol. Utiliser un tampon chirurgical stérile pour créer un espace stérile pour tout l'équipement stérilisé. Couper Gelfoam en petits morceaux et les faire tremper dans une solution saline stérile.
Remarque: Selon le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire, l'éthanol est ni un stérilisant ni un désinfectant de haut niveau. Il ne doit être utilisé comme agent de nettoyage / de dégraissage sur des surfaces préalablement stérilisés. - Mettre l'animal dans echambre d'induction de e et définir le niveau de l'isoflurane à 5% et le débit d'oxygène à 2 L / min. Cette procédure devrait prendre environ 3 min.
- Prenez l'animal hors de la chambre d'induction. Utilisez la queue ou orteil pincements afin de veiller à ce que l'animal est complètement sous sédation.
- L'utilisation d'un trimmer précis raser les cheveux à l'arrière de la tête (entre les oreilles) jusqu'aux yeux.
- Placer l'animal dans le cadre stéréotaxique et à stabiliser la tête avec des barres d'oreilles.
- Définir les niveaux d'anesthésie à 1,5-2% d'isoflurane et de 0,3 L / min d'oxygène.
- Appliquer la pommade oculaire.
- Injecter le animale sous-cutanée avec Tolfedine (4 mg / kg), Butomidor (2 mg / kg) et Baytril (5 mg / kg) pour prévenir l'inflammation, de la douleur et de l'infection, respectivement.
- Injecter la voie intramusculaire des animaux avec la dexaméthasone (0,2 mg / kg) pour empêcher un gonflement du cerveau.
Note: Il est possible d'injecter dexaméthasone sous - cutanée ou intrapéritonéale pour prévenir les dommages musculaires. - Nettoyer la peau à l'aide dedes tampons de coton avec de la bétadine terile suivies de 70% d'éthanol.
- Changez les gants et les pulvériser avec 70% d'éthanol.
Remarque: Lors de l' utilisation des gants jetables ne pas toucher le champ stérile. Touchez l'animal seulement avec les pointes des instruments chirurgicaux stériles et des écouvillons stériles.
Chirurgie 2. Cranial Fenêtre
- Soulever la peau avec une pince et l'aide de micro ciseaux incise la peau horizontalement le long de la base de la tête, puis oblique vers le point de front entre les yeux. Retirez le lambeau de peau.
- Appliquer une pommade lidocaïne avec un écouvillon stérile sur le périoste pour prévenir les saignements excessifs et la douleur.
- Utilisez des cotons-tiges stériles ou un scalpel pour enlever le périoste. Sécher le crâne avec des écouvillons stériles.
- À l'aide d'une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la peau pour les immobiliser afin de prévenir tout contact avec le ciment dentaire. Attendez que la colle sèche.
- Posez une stérile de 3 mm sur lamelle til crâne en avant de la suture lambdoïde. Centre de la lamelle au RSC coordonne: AP, bregma -2,8; ML, bregma 0. Marquez les bords de lamelle en grattant la surface du crâne avec une aiguille stérile. Mettez la lamelle dans le récipient stérile avec 70% d'éthanol.
- Utilisez une perceuse dentaire à haute vitesse avec une petite fraise de diamètre pour décrire un cercle de 3 mm de diamètre. Nettoyer le site de forage à partir de la poussière d'os avec une solution saline stérile écouvillons trempés. Utilisez le Gelfoam et tampons pour arrêter le saignement occasionnel et nettoyer l'os.
- Entre forage vérifier l'épaisseur de l'os avec une pince fine en touchant légèrement le cercle d'os et de vérifier sa mobilité. Gardez à l'esprit que l'os est plus épaisse sur la zone de la suture. Arrêtez le forage lorsque le cercle des os est mobile et seulement encore, mince couche d'os est laissé sur la circonférence. Nettoyez le champ opérationnel de tout le reste de la poussière de l'os avec une solution saline trempé écouvillons.
- Déposez la solution saline stérile sur la zone de forage, couvrant la cir forécle. Retirez délicatement le cercle de l'os avec une pince fine et puis doucement mais fermement retirer l'os en le soulevant vers le haut. Veillez à ne pas fausser le cercle de l'os en le soulevant pour éviter d'endommager la dure.
- Appliquez doucement le Gelfoam trempé dans une solution saline stérile sur la dure-mère pour aider à arrêter le saignement. Attendre jusqu'à ce que tout saignement est complètement arrêté. Retirez délicatement le Gelfoam de ne pas perturber le processus de coagulation.
Remarque: La zone de suture est très vascularisé, de sorte que le saignement à ce point pourrait se révéler être profonde. Il est essentiel d'attendre que le temps suffisant pour que le saignement cesse complètement. Il est utile de garder le Gelfoam saline imbibés refroidi en le plaçant sur la glace.
3. Virus Injection
- Fixer la pompe à perfusion à la tour stéréotaxique et connecter le contrôleur.
- Insérez l'aiguille 35G dans la seringue. Rincer la seringue 10 fois avec de l'éthanol pour la stériliser et 10 fois avec une solution saline stérile pour éliminer les traces d'ethanol. Retirer les bulles d'air de la seringue. Insérer la seringue dans la pompe.
Remarque: Pensez à utiliser d'autres désinfectants. - Décongeler une dose unique de rAAV2 / 1 mCherry préparation (10 12 pfu est recommandé) et le garder sur la glace. Remplir la seringue avec la solution de virus.
- Centrer l'aiguille sur le bregma, puis insérez doucement dans l'hippocampe en utilisant les coordonnées suivantes: AP -2, ML +/- 1,0, DV -1. Ces coordonnées seront situés près du bord de la craniotomie. Attendez 5 min pour le tissu se stabiliser.
- Injecter 0,7 pl de la solution rAAV2 / 1 mCherry au taux de 50 nl / min. Attendre 10 min pour que le virus adsorber pleinement. Retirez délicatement l'aiguille. Éponger avec Gelfoam si le saignement se produit. Répéter avec le site controlatéral.
4. Cranial fenêtre Implantation
- Poser le, lamelle stérile séchée sur le dessus de la dure-mère dans le cadre du cercle percé. Tenir la lamelle avec le forcEPS pour aplatir légèrement la dure-mère et amener coverglass 'des bords plus proche de la surface du crâne.
Remarque: Il est possible que la lamelle perturbe le caillot et les curriculum vitae de saignement. Si tel est le cas, soulever la lamelle, placez-le dans l'alcool, sec et revenir à l'étape 2.9. - En utilisant une aiguille stérile appliquer la colle cyanoacrylate dense sur les bords de la lamelle de les attacher au crâne. Attendez que la colle sèche.
- Placez une barre de fixation (M2 écrou ou une conception sur mesure) dans la partie avant du crâne. Appliquer la colle cyanoacrylate sur les bords de la barre. Attendez que la colle sèche.
- Placez la barre de fixation dans une position qui permettra un positionnement horizontal de la fenêtre crânienne lors de l'imagerie session. Placez-le aussi éloigné que possible de la fenêtre. Si elle est placée trop près de la fenêtre, la barre et la vis de connexion avec le support sur mesure pourrait poser comme un obstacle à l'objectif au cours du processus d'imagerie.
- Créer un bouchon avec l'acrylique dentaire, couvrant le reste de la zone opérationnelle, les bords de la peau, barre de fixation, ce qui renforce le cratère autour de la fenêtre crânienne. Attendez que le ciment dentaire à durcir.
- Retirer l'animal du cadre stéréotaxique et le mettre dans la chambre de récupération.
- Attendez que l'animal de récupérer de la chirurgie tout en observant les fonctions physiologiques.
- Appliquer l'analgésie post-opératoire (carprofène, 10 mg / kg) et le traitement des antibiotiques (Baytril, 5 mg / kg) pendant 48 heures.
5. Imaging
- Démarrez le laser Ti: saphir, la mise sous tension du microscope. Le système utilisé dans cette expérience est équipée d'un laser à deux photons, un système à double BOA et GaAsP PMT.
- Mettre l'animal dans le inducchambre de tion et induire une anesthésie.
- Retirer l'animal de la chambre d'induction et place dans le masque d'anesthésie de gaz sous le microscope. Diminuer le débit d'oxygène à 0,3 L / min et la concentration d'isoflurane à 1,5-2%.
- Fixer l'animal sur le cadre de microscope personnalisé avec une vis M2 (ou un autre système personnalisé). Niveau de la fenêtre crânienne.
Remarque: Il est possible d'utiliser le système tête de fixation du fabricant de microscope, bien que le cadre personnalisé spécifique donne de meilleurs résultats (amélioration de la stabilité de la tête, le positionnement constant dans plusieurs sessions au cours d' une expérience chronique). - En utilisant les réglages du microscope Widefield et un centre objectif faible grossissement de la vue sur l'un des côtés du cortex rétrosplénial et de se concentrer sur la surface de la lamelle.
- Appliquer une goutte d'eau dans le puits acrylique cratère. Basculer vers un objectif d'immersion dans l'eau à longue distance. Déplacer l'objectif vers la fenêtre crânienne jusqu'à ce que le ménisque de l'eau conconnecte l'échantillon et objectif.
- Passez aux réglages à deux photons et commencer à numériser le sommet de l'échantillon vers le bas en utilisant le plus bas zoom. La traversée de la dure-mère sera visible comme un éclat de haute signal non spécifique.
- Réglez les paramètres d'acquisition du microscope dans les deux canaux (GFP et mCherry) selon la puissance du signal à partir de cellules fluorescentes afin de couvrir toute la gamme dynamique.
- Après avoir trouvé un neurone approprié (avec l'arbre dendritique séparés des autres cellules) effectuer une analyse initiale en utilisant uniquement le filterset GFP avec zoom plus bas et z-distance de 5 microns.
- Obtenir une projection maximale de la pile numérisée et l'imprimer pour les annotations (en utilisant des couleurs inversées).
- Réglez le zoom sur une valeur qui permettra à l'image les détails morphologiques souhaités. Image l'ensemble de l'arbre dendritique dans les canaux GFP et mCherry utilisant la projection maximale de guide.
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Representative Results
L'expression de la GFP dans un sous - ensemble de neurones dans le reporteur souris Thy1-GFP permet l'imagerie in vivo des dendrites corticales et les projections axonales locales dans le RSC. La figure 1A montre la projection maximale d'une pile d'images avec de multiples dendrites GFP-positives visibles. Le corps cellulaire est obscurcie par une artère. Figure 1B montre une image plane unique zoom (zoom numérique 3x) de la branche dendritique indiqué dans 1A. Détails de la morphologie dendritique (épines, filopodia) sont clairement visibles. Le canal de GFP est acquise à l'aide du filtre d'émission passe-bande de 500 à 550 nm.
Une injection de la rAAV2 / 1 mCherry dans l'hippocampe dorsal permet la visualisation des axones hippocampiques et boutons synaptiques se terminant par RSC. Ces terminaux peuvent être détectés dans le canal mCherry (l'émission de filtre passe-bande 570-610 nm).
Figure 1. Deux canaux in vivo à deux photons imagerie des neurones RSC et projections hippocampiques à la SRC. (A) Un aperçu des cellules exprimant la GFP dans un fragment de la SRC (image affichée en couleurs inversées). projection maximale montré d'une pile épaisse de 100 um prise à faible grossissement (0.7x zoom numérique). (B) de plan optique unique du fragment indiqué dans (A) acquis à fort grossissement (3x zoom numérique) dans le canal de la GFP. (C) fragment de plan optique unique indiqué dans (A) en utilisant les paramètres d'acquisition mCherry. Voir Protocole pour les détails des filtres de détection. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans le présent document , nous présentons un protocole pour l'utilisation simultanée de deux photons dans l' imagerie in vivo des entrées synaptiques et des cibles postsynaptiques dans RSC à travers une fenêtre crânienne. La procédure d'implantation se composent de plusieurs étapes clés. Tout d'abord, l'animal est profondément anesthésié et fixé dans le cadre stéréotaxique, puis le crâne sur le RSC est amincie avec un foret le long des lignes circulaires marquées et l'os circulaire est retiré. Après que le saignement est arrêté, le rAAV2 / 1 mCherry est injecté dans l'hippocampe et le verre de protection est fixé sur le crâne au- dessus de la zone de forage. Enfin, la barre de fixation est fixé sur la tête et l'animal est placé dans la chambre de récupération pendant 48 heures. Au bout d'environ 2-3 semaines nécessaires pour l'expression du virus de la SRC peut être visualisée. Le protocole d'imagerie comprend les étapes suivantes. En premier lieu, l'animal est anesthésié et fixée au microscope. L'accent est ensuite mis à l'aide du microscope Widefield, le système est switched en mode à deux photons et les canaux d'intérêt (GFP et mCherry) sont visualisés.
La technique présentée offre une amélioration importante par rapport aux protocoles décrits précédemment. Dans l'approche classique, un seul type d'étiquette peut être détectée. Il pourrait être utilisé pour l'image locale projections axonales et des arbres dendritiques, mais aucune étude de connectivité à longue distance était possible. En combinant deux protéines fluorescentes nous avons permis le suivi simultané des éléments pré- et post-synaptiques. Cela permet à long terme dans le suivi in vivo des connexions synaptiques putatifs.
Afin d'obtenir les meilleurs résultats dans la procédure décrite, il est important de prêter attention à plusieurs étapes critiques. Au cours de la levée du cercle d'os à l'étape 2.8 tout dommage causé à la dure peut causer une inflammation et nuire à la transparence de la fenêtre crânienne. arrêt insuffisant de saignement à l'étape 2.9 ou à toute autre étape de la procédure aboutit à accumulat de sangions dans la fenêtre et réduit considérablement le champ de vision. Après l'injection du virus, il est essentiel d'attendre au moins 10 minutes avant de retirer l'aiguille, pour que le virus à infuser dans le tissu au niveau du site d'injection seulement. Cela limite la possibilité d'une infection non désirée du cortex avec le virus pendant le retrait de l'aiguille. La zone de la transfection virale devrait être examinée par une analyse histologique post hoc du tissu cérébral. Toute expression mCherry dans les cellules le long de la trace de l'aiguille doit être évitée. Le temps de récupération standard est de 3 semaines. Cette période est suffisante pour que le virus pour atteindre une expression stable dans les projections synaptiques et pour la fenêtre crânienne pour guérir complètement et de se stabiliser. Les animaux doivent être logés unique afin d'empêcher le retrait de la fenêtre implant crânien par les compagnons de cage. L'utilisation d'une cage élargie pourrait être envisagée afin d'éviter les dommages accidentels de la fenêtre crânienne en appuyant sur les barres métalliques. Fixation stable du mouse sous le microscope est essentiel. Tout mouvement de la tête, y compris les mouvements de respiration, peut entraîner une réduction significative de la qualité des images obtenues. Il est également utile pour positionner la fenêtre crânienne horizontalement vers l'objectif, afin de limiter les problèmes possibles à l'acquisition de focalisation égales pour l'ensemble du plan de la fenêtre. Des critères clairs pour épines résolution et boutons doivent être appliqués. En général, les boutons sont définis comme des gonflements axonaux ayant un diamètre d' au moins 3 fois plus grand que la fibre 7 précédentes. Épines sont définis comme des saillies clairement distinctes de l'arbre de dendrites qui contiennent une tête en forme de bulbe. En outre la division dans les populations de minces, trapus, de champignons et d' épines ramifiées est possible 3. En raison de la résolution axiale relativement faible de la microscopie biphotonique, l' analyse des épines qui font saillie le long de l'axe optique doit être évitée 3. Afin de distinguer clairement boutons et des épines fonctionnelles, un post hoc immunomarquagepeut être réalisée afin d'identifier les marqueurs pré et post - synaptiques 7.
Bien que le protocole présenté avéré être le plus favorable dans nos modèles expérimentaux, il est possible de le modifier afin d'adapter différents objectifs expérimentaux. Parfois, il est plus approprié d'utiliser l'anesthésie injectable (comme la kétamine-xylasine) au lieu de l'isoflurane, mais il est important d'ajuster de manière adéquate le dosage, en gardant à l'esprit les différences de sensibilité aux médicaments entre les souris de différentes souches, l'âge et le sexe. Il est possible d'utiliser un trépan bur au lieu d'un sphérique pour le forage, mais il pourrait augmenter le risque de dommages à la dure. Une solution saline stérile peut être remplacé avec succès par le liquide céphalorachidien artificiel (ACSF), mais il est important de maintenir stérile à tout moment pendant la préparation et le fonctionnement. ACSF est stable pendant 3-4 semaines après la préparation, et le cas échéant la contamination se produit avant que cette fois-ci doit être immédiatement éliminé. Différents FIXATI têtesur les appareils peuvent être appliqués, en fonction de la conception expérimentale, y compris la possibilité d'observer la souris éveillé au microscope à deux photons.
Comme toute autre technique, celle-ci a aussi ses limites. Le microscope à deux photons permet la visualisation du tissu cérébral jusqu'à 500 um en profondeur à partir de la surface de la dure-mère. Pour l'examen des structures cérébrales profondes modifications supplémentaires doivent être appliquées. Notre protocole permet d'accéder à la plupart des RSC, mais la partie de la structure cachée sous le sinus longitudinal supérieur est toujours pas accessible. La résolution du microscope à deux photons ne suffit pas pour l'identification d'une synapse spécifique ainsi que l'analyse morphologique détaillée des épines dendritiques. D'autres techniques, telles que la microscopie électronique corrélatif doivent être appliqués dans le but de confirmer l'existence d'une structure présumée. Il est également important de mentionner que c'est une technique chirurgicale relativement difficile et il ne recommended pour un opérateur inexpérimenté.
La technique présentée peut être appliquée dans un grand nombre d'expériences. Il peut être modifié pour l'étude des différentes régions du cerveau accessibles avec le microscope à deux photons. Il permet la surveillance simultanée des axones et des altérations dendritiques lors de divers états physiologiques et pathologiques, y compris les processus cognitifs et le vieillissement ou la progression des neurologiques et psychiatriques. Il permet l'utilisation de promoteurs spécifiques à une cellule pour visualiser les projections provenant des sous-ensembles à des neurones précisément définis. Il peut également être ajustée pour adapter les protocoles des expériences sur des animaux éveillés et de se comporter. En outre, les protéines sensibles en calcium ou Ph- peuvent être exprimés dans le cerveau afin de visualiser non seulement la morphologie neuronale, mais aussi des changements dans l'activité et la fonction cellulaire. Une autre modification possible de l'approche est l'utilisation d'un sérotype différent pour rAAV expression mCherry. La chimère 2/1 sérotype provides expression robuste au niveau du site d'injection avec un début suffisamment rapide (2-3 semaines). Les niveaux mCherry sont restés stables pendant au moins 12 semaines après l'apparition initiale et aucun marquage rétrograde a été détectée dans nos expériences. Afin d'obtenir un marquage rétrograde, un sérotype différent pourrait être utilisé, par exemple rAAV9. Les séances d'imagerie peuvent être effectuées à une fréquence quelconque, mais au moins l'intervalle de 24 heures est recommandée afin de permettre une bonne récupération de l'animal après l'anesthésie. Si elle est appliquée correctement, cette technique permet d'effectuer plusieurs séances d'imagerie de la même région au cours de plusieurs mois. Pour les expériences à long terme (plus de 6 mois), un système Cre / LoxP peut être utilisé avec la recombinase livré avec le vecteur AAV dans une lignée GFP de la souris floxés.
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Disclosures
Les auteurs (KL, MR, KR) ont des droits de brevet en instance (PL410001) pour cadre porteur utilisé dans le présent article.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier M. Steczkowski pour les enregistrements vocaux, M. Borczyk pour les dessins, A. Trąbczyńska pour la production de virus, M. Ziókowska pour le génotypage et A. Mirgos de l'aide pour le tournage. KR reconnaît le genre don du virus recombinant adéno-associé (rAAV) exprimant la protéine fluorescente mCherry sous le contrôle du promoteur de CaMK de K. Deisseroth. Ce projet a été réalisé dans les installations de base de laboratoire de modèles animaux et de laboratoire de la structure des tissus et de la fonction, Centre de neurobiologie, Nencki Institut de biologie expérimentale, avec l'utilisation de l'infrastructure CePT financé par l'Union européenne - le Fonds européen de développement régional au sein le programme opérationnel «économie innovatrice» pour la période 2007-2013. Ce travail a été soutenu par des subventions du Centre national des sciences: Sonata Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00691 à KR et Sonata Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
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