Introduction
שני הפוטונים מיקרוסקופיה מהפכת התצפית של פעילות המוח הן חי ופועל חיות. מאז השקתו בשנת 1990 הוא במהירות לפופולריות והוא מיושם כיום כאחת הגישות המעניינות והחדשניות ביותר כלפי בחינת היבטים רבים של פעילות מוח in vivo 1,2. יישומים אלה כוללים מדידות זרימת דם, הפעלת נוירונים (למשל, באמצעות אינדיקטורים רמת סידן או ביטוי גנים מוקדם מיידיים) ואת המורפולוגיה של תאים עצביים. מספר גדל והולך של מעבדות להשתמש מיקרוסקופי שני פוטונים, יישום הטכניקה ברחבי העולם המדעי כסטנדרט חדש עבור הדמיה המוחית in vivo.
הגישה הסטנדרטית כוללת השתלה של החלון גולגולתי (חור עגול הגולגולת מכוסית זכוכית לכסות) מעל החבית או בקליפת המוח הראייתית של עכבר המוח 3. לאחר מכן, בהתאם לפרוטוקול הניסוי, mouse עובר סדרה של ויזואליזציה והדרכות התנהגותי, המאפשר לעקוב אחר השינויים בפעילות המוח והמורפולוגיה עצבית לאורך זמן 4,5. בשני המקרים craniotomy משפיע רק על עצם הקודקוד, מבלי לחצות את התפרים. הוא האמין בעיקר כי החיסרון העיקרי של השיטה הוא היישום שלה מוגבל cortexes ונגיש כגון חבית או בקליפת המוח הראייתית. השרשה של החלון גולגולתי על פני אזורים אחרים מציבה הרבה קשיים, עקב דימום יתר ו / או הפרעה מרחבית.
במאמר זה אנו מציעים את ההשתלה של החלון גולגולתי מעל הקורטקס retrosplenial (RSC) כעוד באזור ריבית אפשרי עבור שני פוטונים in vivo מיקרוסקופיה 6. RSC היא מרכיב חשוב של המעגל במוח האחראי על היווצרות הזיכרון המרחבי. אנטומית, RSC היא חלק מהרשת עצבית חיבור קליפת מוח, בהיפוקמפוס, ואזורים התלמוס 7. זהבכבדות מעורב במגוון של התנהגויות, כגון לימוד ושינון הכחדה המרחבית וכן ניווט מרחבית 6.
על מנת להמחיש את השינויים המורפולוגיים של נוירונים אנו משתמשים קו עכבר מהונדס מבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) תחת אמרגן Thy1. בעכברים אלו, GFP מתבטא כ 10% של הנוירונים במוח המאפשרים להדמיה ברורה של אקסונים קליפת המוח דנדריטים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים 8. חידוש נוסף שאנו מציעים הוא הזרקה של סרוטיפ וירוס adeno הקשורים רקומביננטי 2/1 (מרמת rAAV2 / 1) קידוד חלבון פלואורסצנטי אדום (mCherry) תחת האמרגן camkii ספציפי נוירון 9 לתוך המבנים העמוקים יותר של המוח מקרין RSC , כגון ההיפוקמפוס. הביטוי של מרמת rAAV2 / 1 mCherry בהיפוקמפוס של העכבר Thy1-GFP מאפשר להדמיה סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic של hippocampo-cortical הסינפסות 10. הביטוי rAAV מונחה של mCherry דורש שבועיים עד שלושה שבועות לחלבון להגיע לרמה מספקת במסופים אקסונלית. תקופה זו עולה בקנה אחד עם הזמן הרגיל הנדרש להתאוששות מן craniotomy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית במכון Nencki לביולוגיה ניסויית, פולנית האקדמיה הלאומית למדעים.
הערה: החלק מן הקלעים של הווידאו הקשור מואץ. גורם מהירות מותווה בסצנות אלה.
1. ניתוח הכנה
- לעקר את כל הכלים, מיכלי זכוכית עבור נוזלים צמר גפן ב החיטוי. יש להשתמש בכפפות אפשר לוותר עליהן. נקו את שולחן הניתוחים, מסגרת stereotaxic וכל האזור שמסביב עם אתנול 70%. השתמש כרית כירורגית סטרילית ליצור מרחב סטרילי עבור כל הציוד המעוקר. חותכים gelfoam לחתיכות קטנות להשרות אותם מלח סטרילית.
הערה: על פי המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה, אתנול אינו מהווה sterilant ולא חיטוי ברמה גבוהה. זה אמור לשמש רק כסוכן ניקוי / defatting על משטחים מעוקרים בעבר. - שים את החיה הדואר בתא האינדוקציה ולהגדיר את רמת isoflurane עד 5% ו זרימת חמצן 2 ליטר / דקה. הליך זה צריך לקחת כ -3 דקות.
- קח את החיה מתוך חדר האינדוקציה. השתמש צובט זנב או הבוהן על מנת להבטיח כי בעל החיים הוא מסומם לגמרי.
- שימוש גוזם מדויק לגלח את השיער מהחלק האחורי של הראש (בין האוזניים) עד העיניים.
- מניח את החיה בתוך מסגרת stereotaxic ולייצב את הראש עם ברי אוזניים.
- כיוון דרגת הרדמה isoflurane 1.5-2% ו -0.3 ליטר / דקה חמצן.
- החל את משחת עיניים.
- להזריק את תת עורי חיה עם Tolfedine (4 מ"ג / ק"ג), Butomidor (2 מ"ג / ק"ג) ו Baytril (5 מ"ג / ק"ג) כדי למנוע דלקת, כאב וזיהום, בהתאמה.
- להזריק את לשריר חיה עם Dexamethasone (0.2 מ"ג / ק"ג) כדי למנוע נפיחות במוח.
הערה: אפשר להזריק תת עורי Dexamethasone או intraperitoneally למנוע נזק לשרירים. - נקו את העור באמצעות sצמר גפן terile בבטאדין ואחריו אתנול 70%.
- שנה את הכפפות ולרסס אותם עם אתנול 70%.
הערה: בעת שימוש בכפפות חד פעמיות אין לגעת שדה סטרילי. גע החיה היחידה בקצות מכשירי ניתוח סטרילי ספוגיות סטרילי.
כירורגיה 2. חלון גולגולתי
- הרם את העור עם מלקחיים באמצעות מספרי מייקרו לחתוך את העור בצורה אופקית לאורך בבסיס הראש ולאחר מכן באלכסון עד לנקודת החזית בין העיניים. הסר את דש העור.
- החל משחה לידוקאין עם ספוגית סטרילית על קרום העצם כדי למנוע דימום וכאב מוגזם.
- השתמש צמר גפן סטרילי או אזמל כדי להסיר את קרום העצם. לייבש את הגולגולת עם צמר סטרילי.
- באמצעות מחט סטרילית להחיל דבק cyanoacrylate צפוף על קצות העור לשתק אותם ולמנוע ממגע במלט שיניים. חכו הדבק להתייבש.
- נח coverglass 3 מ"מ סטרילית על tהוא גולגולת קדמית אל תפר lambdoid. מרכז את coverslip ב RSC קואורדינטות: AP, גבחת -2.8; ML, גבחת 0. סמן את הקצוות coverslip ידי מגרד את פני הגולגולת עם מחט סטרילית. שים את coverglass בחזרה לתוך המיכל סטרילית עם 70% אתנול.
- השתמש מקדח שיניים במהירות גבוהה עם בר קוטר קטן לשרטט מעגל בקוטר 3 מ"מ. נקה את הקידוח מעפר העצם עם מטליות טבולות תמיסת מלח סטרילית. השתמש gelfoam ו מטליות כדי לעצור את הדימום מדי פעם ולנקות את העצם.
- בין לבין הקידוח לבדוק את עובי העצם עם מלקחיים בסדר על ידי נגיעת מעגל העצם בעדינות ובדיקת הניידות שלה. זכור כי העצם עבה על האזור של התפר. עצור את הקידוח כאשר מעגל העצם הוא נייד ורק בשכבה אחידה, דקה של עצם נשארת על ההיקף. נקה את השדה התפעולי של כל אבק העצם הנותרים עם מטליות טבלו מלוחות.
- זרוק את תמיסת מלח סטרילית על אזור הקידוח, המכסה את CIR קדחCLE. בזהירות לחטט מעגל העצם עם מלקחיים בסדר ואז בעדינות אך בתקיפות להסיר את העצם על ידי הרמתו כלפי מעלה. היזהר שלא להטות את מעגל העצם כשאני מרים אותה כדי למנוע נזק אפשרי הדורה.
- בעדינות להחיל את gelfoam ספוגה תמיסת מלח סטרילית על הדורה כדי לעזור לעצור את הדימום. חכו עד שכל הדימום נעצר לחלוטין. מוציאים בזהירות את gelfoam לא להפריע בתהליך הקרישה.
הערה: אזור התפר הוא vascularized מאוד, כך את הדימום בנקודה זו עלולה להתברר עמוק. זה חיוני כדי לחכות מספיק זמן הדימום להפסיק לחלוטין. זה עוזר לשמור על gelfoam המלוח ספוג מקורר על ידי הצבתו על קרח.
3. הזרקת וירוס
- צרף משאבת עירוי למגדל stereotactic ולחבר את הבקר.
- הכנס את מחט 35G לתוך המזרק. שטוף את המזרק 10 פעמים עם אתנול לעקר אותו 10 פעמים עם תמיסת מלח סטרילית כדי להסיר עקבות של דוארthanol. הסר בועות אוויר מן המזרק. הכנס את המזרק לתוך המשאבה.
הערה: יש לשקול שימוש בחומרי חיטוי אחר. - להפשיר מנה בודדת של הכנה מרמת rAAV2 / 1 mCherry (10 12 pfu מומלץ) ולשמור אותו על קרח. מלאו את המזרק עם פתרון וירוס.
- מרכז את המחט על גבחת ואז בעדינות להכניס לתוך ההיפוקמפוס באמצעות הקואורדינטות הבאות: AP -2, ML +/- 1.0, DV -1. נקודות ציון אלה יהיו ממוקמים ליד קץ craniotomy. מתן 5 דקות עבור הרקמות לייצב.
- להזריק 0.7 μl של פתרון mCherry מרמת rAAV2 / 1 בשיעור של 50 nl / min. חכה 10 דקות עבור הווירוס לספוג באופן מלא. הוצא בעדינות את המחט. כתם עם gelfoam אם הדימום מתרחש. חזור עם האתר הנגדי.
4. גולגולתי חלון השרשה
- הנח את coverglass סטרילי, מיובשים על גבי הדורה בפריים מעגל קדח. החזק את coverglass עם forceps לשטח ההדור בעדינות ולהביא coverglass 'קצוות קרובים לפני שטח הגולגולת.
הערה: יתכן כי coverglass משבש את הקריש ואת קורות חיים הדימום. אם זה המקרה, להרים את coverglass, למקם אותו באלכוהול, יבש ולחזור לשלב 2.9. - באמצעות מחט סטרילית להחיל את דבק cyanoacrylate צפוף בשולי coverglass לצרף אותם אל הגולגולת. חכו הדבק להתייבש.
- מניחים בר קיבעון (אגוז M2 או עיצוב בהתאמה אישית) בחלק הקדמי של הגולגולת. החל את דבק cyanoacrylate על הקצוות של הבר. חכו הדבק להתייבש.
- מניחים את בר קיבעון בעמדה שתאפשר מיקום האופקי של החלון גולגולתי במהלך ההדמיה הפגישה. מניח אותו כמו רחוק ככל האפשר מן החלון. אם היא ממוקמת קרוב מדי אל החלון, הבר ואת הבורג חיבורו עם בעל מחוייט עלול להוות מכשול עבור המטרה במהלך תהליך ההדמיה.
- צור כובע עם אקריליק השיניים, המכסה את שאר השטח המבצעי, קצות עור, בר קיבעון, חיזוק המכתש סביב החלון גולגולתי. חכה מלט השיניים להתקשות.
- הסר את החיה מן המסגרת stereotaxic והכניס אותו לחדר התאוששות.
- חכו החיה להתאושש מהניתוח תוך שמירה על תפקודים פיזיולוגיים.
- החל שיכוך כאבים שלאחר הניתוח (carprofen, 10 מ"ג / ק"ג) וטיפול אנטיביוטי (Baytril, 5 מ"ג / ק"ג) במשך 48 שעות.
הדמיה 5.
- הפעל את טי: ספיר לייזר, כוח את המיקרוסקופ. המערכת השתמשה בניסוי זה מצוידת ליזר שני פוטונים, מערכת OPO ו PMT Gaasp הכפול.
- שים את החיה inducתא tion ולגרום הרדמה.
- הסר את החיה מן חדר האינדוקציה ומכניס את מסכת גז ההרדמה מתחת למיקרוסקופ. להקטין את זרימת החמצן 0.3 L / min ואת ריכוז isoflurane ל 1.5-2%.
- תקן החיה למסגרת מיקרוסקופ המותאם אישית עם בורג M2 (או אחר מערכת מותאמת אישית). אזנו את החלון גולגולתי.
הערה: אפשר להשתמש במערכת קיבוע הראש של מיקרוסקופ היצרן, למרות המסגרת המותאמת אישית המסוימת נותנת תוצאות טובות יותר (יציבות ראש משופרת, מיצוב קבוע בפגישות מרובות במהלך ניסוי כרוני). - שימוש בהגדרות מיקרוסקופ widefield ומרכז המטרה בהגדלה נמוכה הנוף על אחד הצדדים של קליפת retrosplenial ולהתמקד אותו על פני השטח coverslip.
- החל טיפה של מים לתוך הבאר אקריליק דמוי מכתש. Switch to טבילה אובייקטיבי מים למרחקים ארוכים. הזז את המטרה לעבר החלון גולגולתי עד con המניסקוס מיםnects הדגימה ואובייקטיבית.
- עבור להגדרות שני הפוטונים ולהתחיל סריקה העליון הדגימה למטה באמצעות זום הנמוך ביותר. המעבר של דורה מאטר יהיה גלוי כמו בוהק של אות גבוהה שאינו ספציפית.
- התאם את הגדרות הרכישה מיקרוסקופ בשני הערוצים (GFP ו mCherry) על פי עוצמת האות מתאי ניאון כדי לכסות את הטווח הדינמי.
- לאחר מציאת נוירון מתאים (עם העץ הדנדריטי להפריד תאים אחרים) לבצע סריקה ראשונית רק באמצעות GFP filterset עם זום z למרחקים הנמוך של 5 מיקרון.
- השג השלכה מרבית של ערימת סרוקים ולהדפיס אותו על הערות (באמצעות צבעים הפוכים).
- גדר זום לערך שיאפשר לתדמית פרטי מורפולוגיים הרצויים. תמונת העץ הדנדריטי כולו בערוצי GFP ו mCherry באמצעות הקרנה מרבית כמדריך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הביטוי של ה- GFP משנה של נוירונים עכבר כתב Thy1-GFP מאפשר in vivo ההדמיה של דנדריטים קליפת המוח ותחזיות axonal המקומיות RSC. איור 1 א מציג הקרנה מקסימלי של ערימה של תמונות עם דנדריטים GFP חיובים מרובים גלויים. גוף התא הוא מוסתר על ידי עורק. 1B האיור מראה תמונה אחת מטוס תקריב (זום דיגיטלי 3x) של סניף הדנדריטים המצוין 1A. פרטים של מורפולוגיה הדנדריטים (קוצים, filopodia) נראים בבירור. ערוץ GFP נרכש באמצעות מסנן הפליטה לעבור להקת 500-550 ננומטר.
זריקה של mCherry מרמת rAAV2 / 1 אל ההיפוקמפוס הגבה מאפשרת הדמיה של אקסונים בהיפוקמפוס boutons הסינפטי המסתיימות RSC. מסופים אלה ניתן לאתר ערוץ mCherry (פליטת לעבור הלהקה לסנן 570-610 ננומטר).
ss = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> 
איור 1. שני ערוץ שני הפוטונים הדמיה vivo של נוירונים RSC ותחזיות בהיפוקמפוס כדי RSC. (א) סקירה של התאים המבטאים-GFP ב שבר של RSC (התמונה המוצגת בצבעים הפוכים). הקרנה מקסימלי לראות ערימה עבה 100 מיקרומטר נלקחה ב בהגדלה נמוכה (זום דיגיטלי 0.7x). (ב) מטוס אופטי יחיד של שהבר מצוין (א) רכשו בהגדלה גדולה (זום דיגיטלי 3x) בערוץ ה- GFP. (C) שבר מטוס אופטי יחיד מצוין (א) תוך שימוש בהגדרות רכישת mCherry. ראה פרוטוקול לפרטים מסננים זיהוי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר הנוכחי אנו מציגים פרוטוקול עבור שני הפוטונים סימולטני in vivo הדמיה של תשומות הסינפטי מטרות postsynaptic ב RSC דרך חלון גולגולתי. הליך ההשתלה להשתרע על פני כמה שלבים עיקריים. ראשית, החיה בהרדמה עמוקה וקבוע בפריים stereotactic, אז הגולגולת מעל RSC היא דלילה עם מקדחה בנוסח החוזר המסומן ואת העצם העגול מוסר. לאחר דימום פסק, mCherry מרמת rAAV2 / 1 מוזרקת לתוך ההיפוקמפוס, וכן מכסה זכוכית מקובע הגולגולת מעל אזור הקדח. לבסוף לבר הקיבעון מאובטח על ראש החיה מושמת בתא ההתאוששות במשך 48 שעות. לאחר כ 2-3 שבועות דרושים ביטוי הווירוס, ניתן דמיין והוב"א. פרוטוקול ההדמיה כולל את השלבים הבאים. ראשית, החיה הוא מורדם קבוע תחת המיקרוסקופ. הפוקוס ואז להגדיר באמצעות מיקרוסקופ widefield, המערכת היא switched למצב שני הפוטונים ואת ערוצי עניין (GFP ו mCherry) הם דמיינו.
הטכניקה הציגה מציעה שיפור גדול על פני הפרוטוקולים שתוארו קודם לכן. בגישה הסטנדרטית, רק סוג אחד של תווית ניתן היה לזהות. זה יכול לשמש כדי תחזיות axonal מקומי תמונה ועצים הדנדריטים, אבל אין מחקרי קישוריות לטווח ארוך היו אפשריים. על ידי שילוב של שני חלבוני ניאון אפשרנו מעקב סימולטני של אלמנטים טרום postsynaptic. זה מאפשר לטווח ארוך ניטור vivo של קשרים סינפטיים משוערים.
על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר של ההליך המתואר, חשוב לשים לב לכמה שלבים קריטיים. במהלך הרמת מעגל העצם בשלב 2.8 נזק הדורה עלול לגרום לדלקת ולפגוע השקיפות של החלון גולגולתי. הפסקה מספקת של דימום בשלב 2.9 או בכל שלב אחר של הליך התוצאה וצבור דםיון מתחת לחלון מפחית באופן משמעותי את שדה הראייה. לאחר הזרקת הווירוס הוא חיוני לחכות לפחות 10 דקות לפני הסרת המחט, על מנת הווירוס להחדיר לתוך הרקמה באזור הזריקה בלבד. זה מגביל את האפשרות של זיהום הרצוי של הקליפה בווירוס במהלך הסרת מחט. האזור של transfection ויראלי יש לבחון עם ניתוח היסטולוגית פוסט הוק של רקמת המוח. כל ביטוי mCherry בתאים לאורך עקבות מחט יש להימנע. זמן ההחלמה הסטנדרטי הוא 3 שבועות. תקופה זו היא מספקת את הווירוס להגיע ביטוי יציב בתחזיות הסינפטי עבור החלון גולגולתי לרפא ולייצב מלאים. החיות צריכות להיות שוכנו יחיד על מנת למנוע הסרת שתל חלון גולגולתי ידי חבריהם לכלוב. השימוש בכלוב מוגדל עשוי להיחשב על מנת למנוע נזק תאונתי של החלון גולגולתי ידי להכות את מוטות מתכת. קיבוע יציב של mouse מתחת למיקרוסקופ חיוני. כל תנועת הראש, כוללים תנועות נשימה, עלולה לגרום לירידה משמעותית באיכות של תמונות המתקבלות. כמו כן כדאי למקם את החלון גולגולתי אופקי אל המטרה, להגביל בעיות אפשריות עם רכישת מוקד שוות המטוס כולו של החלון. קריטריונים ברורים קוצי boutons לפתרון צריכים להיות מיושמים. באופן כללי, boutons מוגדרים נפיחויות אקסונלית בעל קוטר לפחות 3 פעמים גדול יותר סיבים שקדמו 7. שדרות מוגדרות בליטות להבחין באופן ברור בין פיר דנדריט המכיל ראש בולבוסים. חלוקה נוספת לתוך אוכלוסיות של דקה ועבה, פטריות קוצים מסועפים אפשרית 3. בשל ההחלטה צירית עניים יחסית של שני פוטונים במיקרוסקופ, ניתוח של עמוד השדרה המקרינים לאורך הציר האופטי יש להימנע 3. על מנת להבחין בבהירות boutons קוצים פונקציונלי, פוסט הוק immunolabelingניתן לבצע על מנת לזהות 7 סמנים טרום postsynaptic.
אף על פי הפרוטוקול שהוצג התברר הטוב ביותר בעיצובי הניסוי שלנו, אפשר לשנות את זה על מנת להתאים מטרות ניסוי שונות. לפעמים זה יותר מתאים לשימוש הרדמה בזריקות (כגון קטמין-xylasine) במקום isoflurane, אך חשוב להתאים את המינון כראוי, תוך בדלי מוח ברגישות סמים בין העכברים של זנים, גיל ומין שונים. אפשר להשתמש לִקְדוֹחַ ספחת במקום אחד כדורי עבור הקידוח, אבל זה יכול להגביר את הסיכון של פגיעה ההדורה. מלח סטרילית עשוי להיות מוחלף בהצלחה עם מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF), אבל חשוב לשמור על סטריליות בכל עת במהלך הכנת ותפעול. ACSF יציב במשך 3-4 שבועות לאחר ההכנה, ואם כל זיהום מתרחשת לפני הפעם זה אמור להיות מושלך מיד. fixati הראש השונהבהתקנים ניתן להחיל, בהתאם לעיצוב ניסיוני, לרבות האפשרות של התבוננות העכבר הער תחת מיקרוסקופ שני פוטונים.
כמו כל טכניקה אחרת, זה גם יש מגבלות. המיקרוסקופ שני הפוטונים מאפשר הדמיה של רקמת המוח עד 500 מיקרומטר עמוק מפני השטח ההדור. לצורך בחינה של מבנים המוחיים העמוקים יותר שינויים נוספים חייבים להיות מיושמים. הפרוטוקול שלנו מאפשר גישה למרבית RSC, אבל החלק מהמבנה המוסתר תחת סינוס sagittal המעולה הוא עדיין אינו נגיש. הרזולוציה של מיקרוסקופ שני פוטונים אינה מספיק כדי להביא לזיהוי סינפסה ספציפית כמו גם ניתוח מורפולוגי מפורט של קוצים הדנדריטים. טכניקות נוספות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית מצטרף חייבות להיות מיושמות על מנת לאשר את קיומו של מבנה חשד. כמו כן, חשוב לציין כי זוהי טכניקה כירורגית יחסית קשה וזה לא recommended עבור מפעיל שנמנה.
הטכניקה הציגה עשויה להיות מיושמת במגוון רחב של ניסויים. זה עלול להיות שונה לחקירה של אזורי המוח השונים נגישים עם מיקרוסקופ שני פוטונים. היא מאפשרת ניטור סימולטני של אקסונלית ושינויים הדנדריטים במהלך במגוון מדינות פיזיולוגיים ופתולוגיים כולל תהליכים קוגניטיביים והזדקנות או התקדמות של נוירולוגיות מצבים פסיכיאטריים. זה מאפשר שימוש של מקדמי תא ספציפי לדמיין תחזיות שמקורם ב תת נוירונים הגדיר במדויק. היא עשויה גם להיות מותאמת כדי להתאים את הפרוטוקולים של ניסויים בבעלי חיים ערים מתנהגים. יתר על כן, חלבונים רגישים סידן או pH- יכול לבוא לידי ביטוי במוח על מנת להמחיש לא רק את המורפולוגיה העצבית אלא גם שינויים בפעילות תא ותפקודו. עוד שינוי אפשרי של הגישה הוא השימוש של סרוטיפ rAAV שונה לביטוי mCherry. ה- PR 2/1 סרוטיפ כימריovides ביטוי חזק באזור הזריקה עם פתיחה מהירה מספיק (2-3 שבועות). רמות mCherry שומרות על יציבות כבר לפחות 12 שבועות לאחר הופעה ראשונית ואין תיוג מדרדר זוהה בניסויים שלנו. על מנת לקבל תיוג מדרדר, סרוטיפ שונה עשוי לשמש, כגון rAAV9. מפגשי ההדמיה ניתן לבצע בתדירות כלשהי, אולם במרווח של 24 שעות לפחות מומלץ על מנת לאפשר התאוששות נאותה של החיה לאחר הרדמה. אם מיושם כהלכה, טכניקה זו מאפשרת ביצוע פגישות הדמיה מרובות של אותו האזור במשך מספר חודשים. בניסויים ארוכי טווח (יותר מ -6 חודשים), מערכת Cre / LoxP ניתן להשתמש עם recombinase נמסר עם וקטור AAV לקו העכבר GFP floxed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים (KL, MR, KR) יש זכויות פטנט (PL410001) עבור מסגרת מחזיק בסעיף זה.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות מ Steczkowski להקלטות קול, מ Borczyk עבור ציורים, א Trąbczyńska לייצור וירוס, מ Ziókowska עבור genotyping וא Mirgos לסיוע בעבודת המצלמה. KR מכיר מתנה סוג של וירוס adeno הקשורים רקומביננטי (rAAV) המבטאים חלבון פלואורסצנטי mCherry בשליטת היזם CaMK מ ק דייזרות. פרויקט זה בוצע במתקני הגרעין של מעבדה של מודלים בבעלי חיים המעבדה של מבנה רקמות ותפקוד, מרכז לנוירוביולוגיה, Nencki המכון לביולוגיה ניסויית, עם השימוש בתשתית CEPT במימון האיחוד האירופי - קרן האירופית לפיתוח אזורי בתוך התכנית התפעולית "כלכלה חדשנית" עבור 2007-2013. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הלאומית למדע מרכז: סונטה Bis 2012/05 / E / NZ4 / 02,996, Harmonia 2013/08 / M / NZ3 / 00,861, Symfonia 2013/08 / W / NZ24 / 00,691 ל KR וסונטה Bis 2014 / 14 / E / NZ4 / 00172 RC
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drug | |||
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 5-2% pre-operative |
| Isoflurane | Baxter | AErrane 8DG9623 | 1.5-2% during surgery |
| Dexametasone | Scan Vet | Dexasone 2mg/ml | 0.2 mg/kg intramuscular |
| Baytril | Bayer | 2.50% | 5 mg/kg subcutaneously |
| Tolfedine | Vetoquinol | 4% | 4 mg/kg subcutaneously |
| Butomidor | Richter Pharma | 10 mg/ml | 2 mg/kg subcutaneously |
| Carprofen | KRKA-Polska | Rycarfa 50mg/ml | 10 mg/kg subcutaneously |
| Lidocaine | Jelfa | Lignocainum | topically |
| Lidocaine | Jelfa | 20 mg/g | topically |
| Surgery | |||
| Gelfoam | Ethicon | Spongostan dental; REF MS0005 | |
| Eye ointment | Dedra | Lubrithal | topically |
| CA glue | Pelikan Daniel | 20G Huste | |
| Dental acrylic | SpofaDental | Duracryl Plus | |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51500D | |
| Tool | |||
| Coverglass | Harvard Apparatus | HSE-64-0720 | 3 mm diameter |
| Dental drill | Sigmed | Keystone KVet | |
| Fixation bar | Custom made | N/A | M2 or M3 screw nuts could be used |
| Forceps | Renex | PN-7B-SA | |
| Micro scissors | Falcon | BM.183.180 | |
| Dissection microscope | KOZO | XTL6445T | |
| Imaging | |||
| Holder frame | Custom made | N/A | |
| Two-photon microscope | Zeiss | Upright Axio Examiner Z1 | Laser unit: Coherent Chameleon 690-1040nm with Optical Parametric Oscillator 1050-1300nm. Objectives: EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 and LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0. Detection: Zeiss bandpass filters BP 500-550 (GFP) and BP 570-610 (mCherry) separated by beam splitter at 560nm and coupled to two GaAsP photodetectors. |
| Reagent | |||
| Virus | gift from K. Deisseroth | Recombinant adeno-associated virus (rAAV) expressing fluorescent protein mCherry under the control of CaMK promoter |
References
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
- Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
- Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
- Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
- Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
- Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).
