Una nuova strategia che unisce Array-CGH, sequenziamento dell'intero-esoma e nell'Utero elettroporazione in roditori per identificare geni causativi per le malformazioni del cervello
Summary
Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è la forma più comune di malformazione dello sviluppo corticale (MCD) nell’età adulta, ma la base genetica rimane sconosciuta nei casi più sporadici. Recentemente abbiamo sviluppato una strategia per identificare nuovi geni candidati per MCDs e confermare direttamente loro ruolo causativo in vivo.
Abstract
Difetti di nascita che coinvolgono la corteccia cerebrale — conosciuto anche come malformazioni dello sviluppo corticale (MCD) — sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% dell’epilessia resistente alla droga nell’infanzia. Formazione immagine del cervello ad alta risoluzione ha facilitato l’identificazione in vivo di un grande gruppo di fenotipi MCD. Nonostante gli avanzamenti nella formazione immagine del cervello, analisi genomica e generazione di modelli animali, un semplice flusso di lavoro sistematicamente la priorità geni candidati e per testare gli effetti funzionali delle mutazioni putative è manca. Per ovviare a questo problema, una strategia sperimentale che consentano l’identificazione di nuovi geni causativi per MCD è stata sviluppata e validata. Questa strategia si basa sulla identificazione candidato regioni genomiche o geni mediante array-CGH o intero-dell’esoma sequenziamento e caratterizzare gli effetti della loro inattivazione o della sovraespressione di mutazioni specifiche nel roditore cervelli via in utero di sviluppo elettroporazione. Questo approccio ha portato all’identificazione del gene C6orf70 , che codifica per una proteina vescicolare, alla patogenesi di eterotopia nodulare periventricolare, un MCD causati da difetti di migrazione neuronali.
Introduction
La corteccia cerebrale svolge un ruolo chiave nei processi cognitivi e intellettuali ed è coinvolta nella memoria come apprendimento e controllo emotivo. Pertanto, non è sorprendente che molte malattie neurologiche e psichiatriche derivano da malformazioni dello sviluppo corticale (MCD). L’eziologia di MCD è complesso poiché entrambi acquisito e fattori genetici sono coinvolti. La prevalenza cumulativa di geneticamente determinata proporzione di MCD è circa il 2% e sono nella maggior parte dei casi sporadici. Per esempio, l’incidenza di disgenesia cerebrale congenita è stata stimata per essere superiore all’1% nella popolazione umana, e alcune forme di MCD sono osservate in più del 14% di tutti i pazienti con epilessia e nel 40% di epilessia intrattabile o grave1, 2.
Eterotopia nodulare periventricolare (PNH) è uno della più comuni MCDs ed è causata da anomalie della migrazione dei neuroni dalla zona ventricolare (VZ) alla corteccia cerebrale in via di sviluppo. Il fallimento dei neuroni per migrare i risultati in gruppi di neuroni heterotopic lungo le pareti dei ventricoli laterali che di solito possono essere visualizzati usando la formazione immagine a risonanza magnetica (MRI). Le caratteristiche cliniche, anatomiche e imaging dell’EPN sono eterogenee. I noduli possono variare da piccole e unilaterale bilaterale e simmetrica. Conseguenze cliniche comuni includono l’epilessia e intellettuale disabilità3. Le mutazioni nel gene Della filamina A (o FLNA), che associa in Xq28, sono state trovate nel 100% delle famiglie con EPN bilaterale X-collegato e nel 26% dei pazienti sporadici3,4. Una rara forma recessiva di PNH causata da mutazioni nel gene ARFGEF2 , che associa in 20q13, è stata segnalata in due famiglie consanguinee5. Recentemente, sono state identificate mutazioni bialleliche nei geni che codificano la coppia di cadherin recettore-ligando DCHS1 e FAT4 in nove pazienti affetti da un disordine multisystemic che include PNH6. PNH inoltre è stato associato con X fragile sindrome7, sindrome di Williams8, di sindrome da microdelezione 22q119, duplicazioni 5p1510, eliminazioni in 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6p2513 e 6q omissione terminale sindrome14,15,16,17,18,19, suggerendo che altri geni causativi sono sparsi in tutto il genoma. Tuttavia, per circa il 74% dei pazienti sporadici di PNH la base genetica rimane per essere delucidato17.
Mappatura genica classica si avvicina come matrice l’ibridazione Genomic comparativa (array-CGH) hanno dimostrato di essere un potenti strumenti per la rilevazione di anomalie cromosomiche submicroscopica, tuttavia, le regioni genomiche identificate utilizzando questo approccio sono spesso grandi e contengono numerosi geni.
L’avvento delle tecniche di sequenziamento massivo parallelo (cioè intero-esoma sequenziamento (WES) e Whole-Genome sequencing (WGS)) ha sostanzialmente ridotto sia il costo e il tempo necessario per un’intera dell’esoma umano o del genoma di sequenza. Tuttavia, l’interpretazione dei dati di WES e WGS rimane impegnativo nella maggioranza dei casi, poiché per varianti di ogni paziente decine di centinaia (o migliaia, a seconda del tipo di analisi) emergono dal filtraggio dei dati.
Per accelerare il processo di identificare nuovi geni causativi di MCD, una strategia sistematica romanzo combinando array-CGH, WES e nell’utero elettroporazione (IUE) screening di geni candidati è stato progettato. IUE permette di inattivare selettivamente (o dei overexpress) specifici geni o mutazioni nei cervelli del roditore, consentendo la rapida valutazione del loro coinvolgimento in corticogenesis18,19. RNAi mediata-atterramento o sovraespressione di uno o più geni candidati dovrebbe causare, quando il gene è associato con lo sviluppo della malattia, difetti localizzati nella migrazione neuronale e/o maturazione. Al momento l’identificazione di un gene di cui inattivazione (o sovraespressione) riproduce il fenotipo osservato nei pazienti in roditori, diventa un candidato eccezionale per lo screening in pazienti sporadici con MCD. Utilizzando questo approccio, abbiamo recentemente rivelato il contributo cruciale del gene C6orf70 (noto anche come ERMARD) nella patogenesi dell’EPN in pazienti che harbouring 6q27 delezioni cromosomiche16.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCDs sono importanti cause di disabilità intellettiva e account per 20-40% di epilessia resistente alla droga infanzia1,2. Interesse in MCDs sono aumentato drammaticamente durante la decade passata a causa di due fattori principali. Il primo è il miglioramento nel cervello (in particolare RMN), che consente a medici e scienziati di visualizzare molte malformazioni cerebrali che precedentemente non sono state riconosciute. L’altro è l’evoluzione di strumenti ge…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Si ringraziano il Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, cioè Pr. Scheffer, Pr. S.P. Roberston e Pr. S.F. Berkovic per fornire ai pazienti MCD. Si ringraziano il Dr. F. Michel e D. Mei per aiuto ed i consigli tecnici. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti del programma quadro sette dell’UE, progetto di desiderio, numero di contratto: salute-F2-602531-2013, (per V.C., R.G., A.R., A.F. e C.C.), INSERM (di A.R. e C.C.), la Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA Agostini, E.P.P e c. c) e Région Provence Alpes Côte d’Azur (APO2014 – DEMOTICO per C.C. e A.A.D). D.A.K è un EMBO Young Investigator ed è supportato da FWF concede (I914 e P24367).
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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