脳奇形の原因となる遺伝子を識別するアレイ CGH、全エキソーム配列と齧歯動物の子宮にエレクトロポレーションを組み合わせた新たな戦略
Summary
脳室周囲結節性異 (PNH) は、成人期の皮質発達 (MCD) の奇形の最も一般的な形式が、その遺伝的基盤はほとんど散発的ケースで不明のまま。我々 は最近 MCDs の新しい候補者の遺伝子を識別するために、直接の原因となる役割の生体を確認するための戦略を開発しました。
Abstract
大脳皮質を含む先天性欠損症-脳開発 (MCD) の奇形として知られている-小児期に知的障害と薬剤抵抗性てんかんの 20-40% を占める重要な原因が考えられます。高解像度脳は体内MCD 表現型の大規模なグループの同定を促進しています。脳イメージング、ゲノム解析と動物モデルの世代の進歩にもかかわらず、候補者の遺伝子を体系的に優先して推定される突然変異の機能効果をテストするための簡単なワークフローがありません。この問題を克服するために MCD の新規原因遺伝子の同定を可能に実験的戦略の開発し、検証します。この戦略を識別候補ゲノム領域またはアレイ CGH または全エキソーム配列し、その不活性化または過剰発現で子宮経由で齧歯動物の頭脳の開発の特定の突然変異の効果を特徴付けるを介して遺伝子に基づくエレクトロポレーション。このアプローチは、脳室周囲結節性異所、故障ニューロンの移動によって引き起こされる MCD の病態の推定の小胞タンパク質のC6orf70遺伝子の同定につながった。
Introduction
大脳皮質は、認知・知的過程で重要な役割を果たしているし、感情のコントロールと同様、学習と記憶に関与しています。それ、多くの神経疾患、精神疾患が皮質の開発 (MCD) の奇形に起因驚くべきことではないです。両方取得以来 MCD の病因は複雑で、遺伝的要因が関与しています。MCD の割合が遺伝的に決定の累積的な有病率は約 2%、彼らはほとんどの場合散発的。例えば、先天性脳形成不全の発生率は、人口の 1% 以上推定された、すべててんかん患者の 14% を超えると重症または難治性てんかんの1,の 40%、MCD のいくつかの形態が観察されます。2。
脳室周囲結節性異所 (PNH) の 1 つ最も一般的な MCDs 大脳皮質へ (VZ) の心室の地帯からニューロンの異常な移動によって引き起こされます。通常磁気共鳴イメージ投射 (MRI) を使用して可視化したことが側脳室の壁に沿って異所性ニューロンのクラスターの結果を移行するニューロンの障害。PNH の臨床的、解剖学的および画像の機能は、異機種混在。結節は、両側性、対称性に小さく、片側から及ぶかもしれない。一般的な臨床的後遺症、てんかん、知的障害3があります。二国間 PNH の X-リンクされて連れの 100%、散発的な患者3,4の 26%、Xq28 のマップ、フィラミン A (またはFLNA) の遺伝子の変異が発見されました。Pnh 20q13 にマップ、 ARFGEF2遺伝子の変異によって引き起こされるまれな、劣性フォームは、2 つの近親家族5で報告されています。最近、遺伝子DCHS1とFAT4受容体リガンド カドヘリン ペアでシュミレーション変異は PNH6を含む全身性疾患によって影響を受ける 9 人の患者で同定されています。PNH に関連付けられてされている脆弱 X 症候群7、ウィリアムズ症候群8、22q11 重複症候群9、5 p 1510重複、1 p 3611、5q14.3 q1512、6 p 2513 での削除と 6q ターミナル削除症候群14,15,16,17,18,19, 追加の原因遺伝子が散在していることを示唆しています。全体ゲノム。ただし、散発的な PNH 患者の約 74% の遺伝の基礎は明らか17に残ります。
古典的な遺伝子マッピングに近づくような配列比較 Genomic の交配 (アレイ CGH) サブ顕微鏡による染色体異常、ただし、このアプローチを使用して特定ゲノム領域の検出のための強力なツールであると証明頻繁に大きいし、多数の遺伝子が含まれています。
大量並列シーケンス技術 (すなわち全エキソーム配列 (ウェス) で全ゲノム シーケンス (WGS)) の出現はコストと全体の人間エキソームまたはゲノムをシーケンス処理に必要な時間の両方大幅に削減しています。それにもかかわらず、ウェス WGS データの解釈はデータのフィルタ リングから各患者数十数百 (または解析のタイプに応じて、数千も) に亜種が出てくるため以来ほとんどの場合、挑戦的なままです。
アレイ CGH を組み合わせて新たな体系的な戦略、MCD の新規原因遺伝子を特定するプロセスをスピードアップするには、候補者の遺伝子のウェスと子宮内のエレクトロポレーション (IUE) スクリーニングに設計されました。井植は特定の遺伝子または齧歯動物の頭脳の変異を選択的に不活性化 (またはノザン) 内因18,19の関与の迅速な評価を有効にすることができます。RNAi によるノックダウンまたは 1 つまたは複数の候補遺伝子の過剰発現は、遺伝子が病気の開発、神経細胞移動や成熟のローカライズされた欠陥に関連付けられているときに発生する予定です。不活化 (または過剰発現) が再現齧歯動物の患者にみられる表現型遺伝子の同定、時に MCD 散発的な患者のスクリーニングのための優秀な人材になります。このアプローチを使用すると、最近明らかにC6orf70遺伝子 ( ERMARDとして知られている) の重要な貢献きょくひ 6q27 染色体欠失16患者の PNH の発症。
Protocol
Representative Results
Discussion
MCDs は、知的障害と薬剤抵抗性小児てんかん1,2の 20-40% を占める重要な原因です。MCDs に関心は、2 つの主要な要因の結果として過去 10 年間大幅に増加しています。最初は改善脳画像 (特に MRI)、医者および科学者以前に認められなかった多くの脳奇形を視覚化するをできます。他の多くの小説 MCD 原因遺伝子の同定を許可している遺伝的ツールの進?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は感謝博士 G. マクギリブレー広報・ j ・ クレイトン-スミス、広報 w. b. ドビンズ、広報 P. Striano 広報すなわちシェファー、広報 s. p. ロバーストン広報 s. f. Berkovic MCD 患者を提供するため。技術アドバイスやヘルプ、博士・ f ・ ミシェルと + メイに感謝します。この作品は、EU の 7 つのフレームワーク ・ プログラムからの資金によって支えられた欲望プロジェクト、契約番号: 健康-f2 キー-602531-2013 (仮想、r. g. にアリフール、空軍、シー ・ シー ・)、(アリフールと c. c.) に向かわせる、財団ジェローム ・ ルジューン (A.F、E.P.P、c.c-製品 R13083AA) と地方プロヴァンス アルプ ・ コート ・ ダジュール (APO2014 – c. c. と A.A.D に DEMOTIC)。D.A.K は、エンボ若い調査官に支えられて FWF 付与 (I914 および P24367)。
Materials
| Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
| BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
| Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
| FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
| eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
| Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
| for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
| for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
| Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
| Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
| for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
| for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
| for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
| for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
| Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
| Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
| Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
| 1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
| Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
| Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
| UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
| P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
| Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
| SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
| Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
| For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
| For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
| Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
| Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
| Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
| Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
| SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
| HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
| AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
| 100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
| SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
| SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
| 96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
| SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
| Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
| Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
| Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
| 2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
| Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
| Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
| Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
| GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |
References
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