Summary

Uma nova estratégia combinando Array-CGH, todo-exome sequenciamento e eletroporação no Utero em roedores para identificar Genes causadores de malformações do cérebro

Published: December 01, 2017
doi:

Summary

Periventricular nodular heterotopia (PNH) é a forma mais comum de malformação do desenvolvimento cortical (MCD) na idade adulta, mas sua base genética permanece desconhecida em casos mais esporádicos. Recentemente desenvolvemos uma estratégia para identificar genes candidatos romance para MCDs e confirmar diretamente seu papel causal em vivo.

Abstract

Defeitos de nascença que envolvem o córtex cerebral — também conhecido como malformações do desenvolvimento cortical (MCD) — são causas importantes de incapacidade intelectual e conta para 20-40% de epilepsia resistentes na infância. Imagens do cérebro de alta resolução tem facilitado a identificação no vivo de um grande grupo de fenótipos MCD. Apesar dos avanços em imagens do cérebro, análise genômica e geração de modelos animais, um fluxo de trabalho simples para priorizar sistematicamente genes candidatos e para testar os efeitos funcionais de mutações putativos está faltando. Para superar este problema, uma estratégia experimental, permitindo a identificação de novos genes causadores de MCD foi desenvolvida e validada. Esta estratégia baseia-se identificando as regiões genômicas candidato ou genes via matriz-CGH ou todo-exome sequenciamento e caracterizar os efeitos de sua inativação ou de superexpressão de mutações específicas no desenvolvimento de cérebros de roedores através de in utero eletroporação. Essa abordagem levou à identificação do gene C6orf70 , codificação para uma proteína vesicular putativa, a patogênese da heterotopia nodular periventricular, um MCD causada pela migração neuronal defeituosa.

Introduction

O córtex cerebral desempenha um papel fundamental nos processos cognitivos e intelectuais e está envolvido no controle emocional, bem como a aprendizagem e a memória. Portanto não é surpreendente que muitas doenças neurológicas e psiquiátricas resultam malformações do desenvolvimento cortical (MCD). A etiologia da MCD é complexa desde ambos adquiridos e fatores genéticos estão envolvidos. A prevalência cumulativa da geneticamente determinada proporção de MCD é cerca de 2% e eles são esporádicos, na maioria dos casos. Por exemplo, a incidência de disgenesia cerebral congênita foi estimada para ser superior a 1% na população humana, e algumas formas de MCD são observadas em mais de 14% de todos os pacientes com epilepsia e em 40% de epilepsia grave ou intratável1, 2.

Heterotopia Nodular periventricular (PNH) é um da MCDs mais comum e é causada pela migração anormal dos neurônios da zona ventricular (VZ) para o córtex cerebral em desenvolvimento. O fracasso dos neurônios para migrar resultados em agrupamentos de neurônios heterotópico ao longo das paredes dos ventrículos laterais que geralmente podem ser visualizadas usando ressonância magnética (MRI). As características clínicas, anatômicas e da imagem latente da PNH são heterogêneas. Nódulos podem variar de pequenas e unilateral bilateral e simétrica. Sequelas clínicas comuns incluem deficiência de epilepsia e intelectual3. Mutações no gene Fblim1 A (ou FLNA), que mapeia em Xq28, foram encontradas em 100% das famílias com X-lig bilateral hemoglobinúria paroxística noturna e em 26% dos pacientes esporádicos3,4. Uma forma recessiva rara de hemoglobinúria paroxística noturna, causada por mutações no gene ARFGEF2 , que mapeia no 20q13, tem sido relatada em duas famílias consanguíneos5. Recentemente, foram identificadas em nove pacientes afetados por uma doença multissistêmica que inclui PNH6biallelic mutações em genes que codificam o par de caderina ligante-receptor, DCHS1 e FAT4 . Hemoglobinúria paroxística noturna também tem sido associada com frágil X síndrome7, síndrome de Williams8, 22q11 microdeletion síndrome9, duplicações no 5 p 1510, as exclusões na 1 p 36-115q14.3-q1512, 6 p. 2513 e 6q terminal exclusão síndrome14,15,16,17,18,19, sugerindo que os genes causadores adicionais estão espalhados ao longo do genoma. No entanto, para cerca de 74% dos pacientes de HPN esporádicos a base genética continua a ser elucidado17.

Mapeamento do gene clássica se aproxima como matriz Comparative Genomic Hybridization (CGH-matriz) provaram para ser ferramentas poderosas para a detecção de sub microscópicas anormalidades cromossômicas, no entanto, as regiões genômicas identificadas usando essa abordagem são muitas vezes grandes e contêm inúmeros genes.

O advento das técnicas de sequenciamento paralelo maciço (ou seja, todo-Exome sequenciamento (WES) e do inteiro-genoma sequenciamento (WGS)) reduziu substancialmente tanto o custo e o tempo necessário para sequenciar um inteiro exome humano ou genoma. No entanto, interpretação dos dados de WES e WGS permanece desafiador na maioria dos casos, desde para variantes cada paciente dezenas a centenas (ou mesmo milhares, dependendo do tipo de análise) emergem de filtragem de dados.

Para acelerar o processo de identificação de novos genes causadores de MCD, uma estratégia sistemática romance combinando matriz-CGH, destinava-se a triagem de eletroporação (IUE) WES e no utero de genes candidatos. IUE permite desativar seletivamente (ou overexpress) os genes específicos ou mutações no cérebro de roedor, permitindo uma avaliação rápida do seu envolvimento em corticogenesis18,19. RNAi mediada-nocaute ou superexpressão de genes de um ou mais candidatos deverá causar, quando o gene é associado com o desenvolvimento da doença, defeitos localizados na migração neuronal e/ou maturação. Após a identificação de um gene cuja inativação (ou superexpressão) reproduz o fenótipo observado em pacientes em roedores, torna-se um excelente candidato para o rastreio em pacientes esporádicos com MCD. Usando essa abordagem, recentemente revelou a contribuição fundamental do gene C6orf70 (também conhecido como ERMARD) na patogênese de hemoglobinúria paroxística noturna em pacientes abrigar 6q27 deleções cromossômicas16.

Protocol

Declaração de ética: Ratos Wistar foram acasalados, mantidos e utilizados nas instalações de animais INMED, de acordo com a legislação da União Europeia e o francês. 1. DNA extração e quantificação de Array-CGH e WES Extrai DNA genômico (gDNA) de leucócitos do sangue humano de pacientes usando um robô automatizado de isolamento de DNA ou comercialmente disponíveis kits manuais de extração de DNA de acordo com o protocolo do fabricante. Quantificar todas as amostras…

Representative Results

A estratégia experimental projetada para identificar novos genes causadores de MCD é recapitulada em Figura 1. Através da realização de matriz-CGH em uma coorte de 155 pacientes com anormalidades no desenvolvimento cerebral variàvel combinando hemoglobinúria paroxística noturna (Figura 2A), disgenesia do corpo caloso, colpocefalia, hipoplasia cerebelar e polymicrogyria associados com epi…

Discussion

MCDs são importantes causas de deficiência intelectual e conta para 20-40% de infância resistentes epilepsia1,2. Interesse em MCDs aumentou dramaticamente durante a última década como resultado de dois fatores principais. A primeira é a melhoria no cérebro de imagem (particularmente MRI), que permite que médicos e cientistas Visualizar muitas malformações do cérebro que não foram reconhecidas anteriormente. O outro é a evolução de ferramentas gené…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos o Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, PR. ou seja, Scheffer, Pr. S.P. Roberston e PR. S.F. Berkovic para fornecer pacientes MCD. Agradecemos o Dr. F. Michel e D. Mei por ajuda e conselhos técnicos. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do programa-quadro da UE, sete desejo projeto, contrato número: saúde-F2-602531-2013, (para V.C., R.G., A.R., A.F. e C.C.), INSERM (para A.R. e C.C.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA A.F, E.P.P e Cabral) e Région Provence Alpes Côte d’Azur (APO2014 – DEMÓTICO para C.C. e A.A.D). D.A.K é um EMBO Young Investigator e é suportado pelo FWF concede (I914 e P24367).

Materials

Picospritzer III Parker Hannifin Corp P/N 051-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0002 The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V Microm 10076838 Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300 Olympus The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software Glance Vision Technologies eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K Agilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K Agilent Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless Agilent Agilent p/n G2534A Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays Agilent Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven Agilent Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers Agilent Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid Agilent Agilent p/n G8800A or equivalent Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube Ambion p/n AM12400 or equivalent Microcentrifuge
Magnetic stir bar Corning p/n 401435 or equivalent Instrument for stirring
Qubit Fluorometer Life Technologies p/n Q32857 Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer Invitrogen p/n Q32850 Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes Pipetman or equivalent DNA dispensation
Vacuum Concentrator Thermo Scientific p/n DNA120-115 or
equivalent
Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit Agilent p/n 5190-4240 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units) Agilent p/n 5190-3391 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates GE Healthcare p/n 25-9005-98 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich p/n NA1020 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA p/n G1521 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays: Promega (female) or p/n G1471 (male) Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays: Coriell p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or Agilent p/n 5188-5226 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and Agilent p/n 5188-5221 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 Agilent p/n 5188-5222 Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution Agilent p/n 5185-5979 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA Agilent p/n 5190-3393 Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner Agilent Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples Agilent p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples Agilent p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples Agilent p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples Agilent p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples Agilent p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples Agilent p/n G9622C
DNA 1000 Kit Agilent p/n 5067-1504 Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit Agilent p/n 5067-4626 Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit Kit for automated PCR purification.
5 mL Agencourt p/n A63880
60 mL Agencourt p/n A63881
450 mL Agencourt p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL Life Technologies Cat #65601
10 mL Life Technologies Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32853
Qubit assay tubes Life Technologies p/n Q32856 DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries Agilent depending on the experiment Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8800A DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8810A DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates Agilent p/n 410088 DNA amplification
Optical strip caps Agilent p/n 401425 DNA amplification
Tube cap strips, domed Agilent p/n 410096 DNA amplification
Compression mats Agilent p/n 410187 DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle Agilent p/n G2943CA DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set Agilent p/n G2947CA DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series Covaris DNA shearing
Covaris sample holders p/n 520078 DNA shearing
Nutator plate mixer BD Diagnostics p/n 421105 or equivalent Plate Mixer
GaIIx Illumina next generation sequencing machine

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Cite This Article
Conti, V., Carabalona, A., Pallesi-Pocachard, E., Leventer, R. J., Schaller, F., Parrini, E., Deparis, A. A., Watrin, F., Buhler, E., Novara, F., Lise, S., Pagnamenta, A. T., Kini, U., Taylor, J. C., Zuffardi, O., Represa, A., Keays, D. A., Guerrini, R., Falace, A., Cardoso, C. A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations. J. Vis. Exp. (130), e53570, doi:10.3791/53570 (2017).

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