Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En ny strategi kombinera Array-CGH, hela-exome sekvensering och In Utero elektroporation hos gnagare att identifiera orsakande gener för hjärnan missbildningar

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/53570
Automatic Translation
*1, *2,3,15, 2,3,4, 5,6,7, 2,3,8, 1, 2,3, 2,3, 2,3,8, 9, 10, 10, 11, 10, 9,12, 2,3, 13, 1,14, 2,3, 2,3
1University of Florence, 2INSERM INMED, 3Aix-Marseille University, 4Plateforme Biologie Moléculaire et Cellulaire INMED, 5Royal Children's Hospital, 6Murdoch Children's Research Institute, 7University of Melbourne, 8Plateforme postgenomique INMED, 9University of Pavia, 10Wellcome Trust Centre for Human Genetics, 11Oxford Radcliffe NHS Trust, 12IRCCS Casimiro Mondino Foundation, 13Research Institute of Molecular Pathology, 14IRCCS Stella Maris, 15Columbia University
* These authors contributed equally

Summary

Periventrikulär nodulär heterotopia (PNH) är den vanligaste formen av missbildning av kortikala utveckling (MCD) i vuxen ålder men dess genetiska grunden förblir okänd i mest sporadiska fall. Vi har nyligen utvecklat en strategi att identifiera nya kandidatgener för MCDs och direkt bekräfta deras orsakande roll i vivo.

Abstract

Fosterskador som involverar hjärnbarken – kallas även missbildningar av kortikala utveckling (MCD) — är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av läkemedelsresistent epilepsi i barndomen. Högupplösta hjärnavbildning har underlättat i vivo identifiering av en stor grupp av MCD fenotyper. Trots framsteg inom hjärnavbildning, genomanalys och generering av djurmodeller saknas ett enkelt arbetsflöde att systematiskt prioriterar kandidatgener och testa funktionella effekter av förmodad mutationer. För att lösa detta problem, var en experimentell strategi som möjliggör identifiering av romanen orsakande gener för MCD utvecklats och validerats. Denna strategi är baserad på identifierande kandidat genomisk regioner eller gener via array-CGH eller hela-exome sekvensering och karaktärisera effekterna av deras inaktivering eller överuttryck av specifika mutationer utveckla gnagare hjärnan via i utero elektroporation. Denna metod ledde till identifiering av genen C6orf70 , som kodar för en förmodad vesikulär protein, till patogenesen av periventrikulär nodulär heterotopia, en MCD som orsakas av defekta neuronala migration.

Introduction

Hjärnbarken spelar en nyckelroll i kognitiva och intellektuella processer och är involverad i emotionell kontroll samt inlärning och minne. Det är därför inte förvånande att många neurologiska och psykiatriska sjukdomar resultera från missbildningar av kortikala utveckling (MCD). Etiologin till MCD är komplex eftersom både förvärvade och genetiska faktorer är inblandade. Den kumulativa förekomsten av genetiskt bestämd andel MCD är ca 2% och de är sporadiska i de flesta fall. Till exempel incidensen av medfödda hjärna missbildning uppskattades vara högre än 1% i den mänskliga befolkningen, och vissa former av MCD observeras i mer än 14% av alla patienter med epilepsi och hos 40% av svår eller svårbehandlad epilepsi1, 2.

Periventrikulär nodulär Heterotopia (PNH) är en av de vanligaste MCDs och orsakas av onormal migration av nervceller från ventrikulära zonen (VZ) att utveckla hjärnbarken. Fel i nervceller att migrera resultat i kluster av heterotop nervceller längs väggarna i de laterala ventriklarna som vanligtvis kan visualiseras med hjälp av magnetisk resonanstomografi (MRT). Kliniska, anatomiska och imaging funktioner i PNH är heterogena. Noduli varierar från små och ensidiga bilateral och symmetrisk. Vanliga kliniska följdtillstånd inkluderar epilepsi och intellektuella funktionshinder3. Mutationer i genen Filamin A (eller FLNAEN), som kartor i Xq28, hittades i 100% av familjer med X-länkade bilaterala PNH och hos 26% av sporadiska patienter3,4. En sällsynt, recessiv form av PNH orsakas av mutationer i genen ARFGEF2 , som kartor i 20q13, har rapporterats i två consanguineous familjer5. Biallelic mutationer i gener som kodar för receptorn-ligand cadherin para DCHS1 och FAT4 har nyligen upptäckts i nio patienter som drabbas av en multisystemisk sjukdom som inkluderar PNH6. PNH har också associerats med skör X syndrom7, Williams syndrom8, 22q11 microdeletion syndrom9, dubletter på 5 p 1510, borttagningar på 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 och 6q terminal radering syndrom14,15,16,17,18,19, vilket tyder på att ytterligare orsakande gener är utspridda hela genomet. För cirka 74% av sporadiska PNH-patienter återstår emellertid den genetiska grunden vara klarlagd17.

Klassiskt gene mappning metoder såsom array jämförande genomisk hybridisering (array-CGH) har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för detektion av sub mikroskopiska kromosomavvikelser, men Regionkommittén genomisk identifieras med hjälp av denna metod är ofta stora och innehåller många gener.

Tillkomsten av massiva parallella sekvensering tekniker (dvs. hela-Exome sekvensering (WES) och Whole-Genome sekvensering (WGS)) har avsevärt minskat både kostnaden och tidsåtgången att sekvensera en hela mänskliga exome eller genomet. Tolkning av WES och WGS data är dock fortfarande utmanande i flesta fall, sedan för varje patient tiotals till hundratals (eller ens tusentals, beroende från vilken typ av analys) varianter ur datafiltrering.

För att påskynda processen att identifiera roman MCD orsakande gener, en roman systematisk strategi som kombinerar array-CGH, var WES och Utero elektroporation (IUE) screening av kandidatgener utformad. IUE gör det möjligt att selektivt inaktivera (eller överuttrycka) specifika gener eller mutationer i gnagare hjärnor, möjliggör snabb utvärdering av deras deltagande i corticogenesis18,19. RNAi medierad-knockdown eller överuttryck av en eller flera kandidatgener förväntas orsaka, när genen associeras med sjukdomsutvecklingen, lokaliserade defekter i neuronala migration och/eller mognad. Efter identifiering av en gen vars inaktivering (eller överuttryck) återger den fenotyp som observerats hos patienter i gnagare, blir det en enastående kandidat för screening i sporadiska patienter med MCD. Använder denna metod, avslöjat vi nyligen den C6orf70 genen (även känd som ERMARD) avgörande bidrag i PNH patogenesen hos hysande 6q27 kromosomala borttagningar16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Etik uttalande: Wistar råttor var parad, underhålls och används i INMED djur anläggningar, i samförstånd med Europeiska unionen och franska lagstiftningen.

1. DNA-extraktion och kvantifiering för Array-CGH och WES

  1. Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från humanblod leukocyter från patienter med hjälp av en automatiserad DNA isolering robot eller kommersiellt tillgängliga manuell DNA extraktion kit enligt tillverkarens protokollet. Kvantifiera alla prover med en spektrofotometer.

2. array-CGH protokoll

  1. Begränsning rötning av gDNA
    1. Dubbel digest 500 ng av renat gDNA från en patient- och ett kommersiellt tillgängliga mänskliga DNA med RsaI och AluI för 2 h vid 37 ° C. Använd 0,5 μl 10 U/μL enzym för varje reaktion. Inkubera i 20 min vid 65 ° C att inaktivera enzymer och flytta provet rören till is.
  2. Provets märkning
    1. Tillsätt lämplig mängd slumpmässiga Primers behövs för microarray format används till varje reaktionsröret (t.ex. 5 µl för 1-pack, 2-pack och 4-pack microarrays). Blanda väl genom pipettering försiktigt upp och ner.
    2. Överföra provrör till en termocykel. Inkubera vid 95 ° C i 3 min och sedan vid 4 ° C i 5 min.
    3. Förbereda en cyanin 3 och en cyanin 5 märkning Master Mix på is genom att blanda följande volymer: 10,0 µl 5 X reaktion buffert, 5.0 µl 10 x dNTPs, 3.0 µl cyanin 3-dUTP eller cyanin 5-dUTP och 1,0 µl Exo (-) Klenow enzym, 2.0 µl Nuclease-gratis vatten. Välj volymen av varje reagens enligt microarray formatet används.
    4. Lägga till märkningen Master Mix varje reaktionsröret innehållande gDNA. Blanda väl genom pipettering försiktigt upp och ner.
    5. Överföra provrör till en termocykel och inkubera vid 37 ° C i 2 h, 65 ° C i 10 min och sedan underhålla proverna vid 4 ° C.
  3. Rening av märkta gDNA
    1. Tillsätt 430 µl 1 x TE (pH 8,0) i varje reaktionsröret.
    2. Placera en rening kolumn i 2 mL samling rör och märk kolumnerna på lämpligt sätt. Fyll varje märkta gDNA på en rening-kolumnen.
    3. Centrifugera i 10 min vid 14 000 x g i en mikrocentrifug vid rumstemperatur. Kassera genomströmmande och placera kolumnen tillbaka i 2 ml samling röret.
    4. Tillsätt 480 µL 1 x TE (pH 8,0) i varje kolumn. Centrifugera i 10 min vid 14 000 x g i en mikrocentrifug vid rumstemperatur. Kassera genomflöde.
    5. Invertera kolumnen till en färsk 2 mL samling rör och Centrifugera i 1 minut vid 1000 x g i en mikrocentrifug vid rumstemperatur att samla renat provet.
    6. Ta provvolymen till som efterfrågades för microarray format används med en koncentrator eller lägger till 1 x TE (pH 8,0). Till exempel, för 1-pack microarray föra volymen till 80,5 µL. Inkubera provet på is för 5 min och sedan Pipettera lösningen upp och ner 10 gånger.
  4. Beredning av märkta gDNA för hybridisering
    1. Kombinera test- och referensartiklar prover med lämpliga cyanin 5-märkt provet och cyanin 3-märkt provet i en fräsch 1,5 mL RNase-gratis tub. För 1-pack microarray säkerställa att den slutliga volymen är exempelvis 158 µL. Välj volymen av varje prov enligt microarray formatet används.
    2. Använd en spektrofotometer för att mäta avkastning, grad av märkning eller specifika aktivitet genom att mäta absorbansen vid A260 nm (DNA), A550 nm (cyanin 3) och A650 nm (cyanin 5).
      1. Beräkna avkastning med följande formel: [DNA concentration(ng/µl) x provets volym (µl)] / 1000 (ng/µg). Beräkna specifik aktivitet med hjälp av formeln: pmol per µl av färgämne/µg per µl av gDNA.
        Obs: till exempel för 0,5 µg av tillförda DNA, avkastningen vara 8 till 11 µg och specifik aktivitet (pmol/µg) bör vara 25 till 40 för den cyanin-3 märkt provet och 20 till 35 för cyanin-5 märkta provet.
    3. För att förbereda mängden hybridisering Master Mix behövs för microarray format används, blanda följande reagenser: 50 µL Cot-1 DNA (1,0 mg/ml), 52 µL 10 x aCGH blockering Agent och 260 µl 2 x HI-RPM hybridisering buffert.
    4. Tillsätt lämplig volym av hybridisering Master Mix till 1,5 ml RNase-fri röret som innehåller den märkta gDNA för att erhålla den totala volym som erfordras för microarray format används. Exempelvis för 1 pack microarray, säkerställa att den slutliga volymen för varje reaktion är 362 µl.
    5. Blanda provet genom pipettering upp och ner, och sedan snabbt Centrifugera 14 000 x g och Inkubera under 3 min vid 95 ° C och vid 37 ° C i 30 min.
  5. Chambers montering och hybridisering
    1. Fyll en ren packning bild i kammaren basen med packning etiketten vänd uppåt och i linje med den rektangulära delen av kammaren basen. Se till att packningen bilden är i jämnhöjd med kammare bas och inte är på glänt.
    2. Dosera hybridisering prov blandningen på packning brunnen, att se till att provet fördelas jämnt.
    3. Sätta en microarray glida på den packning bild bedömer att sandwich-paret är korrekt justerad. Montera sedan, reaktionskammaren att sätta locket på inklämt bilderna och hand-dra åt klämman.
    4. Säkerställa diabilder vätning av roterande monterade kammaren vertikalt. Kontrollera att bubblor inte är närvarande i kammaren. Om nödvändigt, tryck på montering på en hård yta för att flytta stationär bubblor.
    5. Sätta den monterade bild kamrarna i en rotator rack ställa in att rotera vid 20 rpm. Sätta i hybridisering kammaren i ugn och utföra hybridisering vid 65 ° C för 24 eller 40 h enligt microarray formatet används.
  6. Microarray tvätt och skanning
    1. Ta hybridisering kammare ur ugnen och dränka det i tvättbuffert 1. Fortsätt till dess demontering.
    2. Ta bort microarray bilden och snabbt sätta den i en objektglashållaren i tvättbuffert 1 vid rumstemperatur.
    3. Tvätta den array bilden för 5 min med omrörning (Använd en loppa och en magnetisk omrörare). Justera omrörare hastigheten till en inställning av 4 (medelhastighet), för att få bra men inte alltför kraftfull blandning.
    4. Tvätta i array-bilden i tvättbuffert 2 för 90 s omrörning. Försiktigt återställa bilden från bufferten (det bör dyka upp torr) och läsa in den i en hållare med hjälp av en bild beskyddare.
    5. Läsa in bilden i matrisen skannern och utföra avsökningen enligt matrisen tillverkarens anvisningar.
    6. Analysera resultaten med extraktion programvara som medföljde skannern används enligt tillverkarens anvisningar (V.9.1.3.1).

3. WES protokoll

  1. Målet anrikning
    1. Använda dsDNA BR Assay för att bestämma koncentrationen av gDNA provet enligt protokollet instrument.
    2. Späd 5 µg av hög kvalitet dubbel strand DNA med 1 x låg TE buffert i en 1,5 mL låg bind tub i en total volym på 50 µL.
    3. Ställa in en någon sonikator och sätta ett mikrorör i lastning och lossning station enligt tillverkarens anvisning. Förvara locket på tuben.
    4. Långsamt överföra 50 µl DNA provet genom ursprungliga septa utan att införa bubblor.
    5. Skeva DNA enligt de inställningar som föreslås från den någon sonikators tillverkare och bedöma kvalitet med hjälp av en Bioanalyzer enligt tillverkarens anvisning. Målet för DNA fragment storlek är 150 till 200 bp.
  2. Reparation av DNA slutar
    1. Förbered den slutet reparation reaktionsblandning genom att blanda 40 µL av slutet reparation enzym Mix med 10 µL slutet reparation Oligo Mix. Blanda väl på en vortex mixer.
    2. Inkubera proverna vid 20 ° C i 30 min i en termocykel och håll dem sedan vid 4 ° C. Använd inte uppvärmd lock.
    3. Tillsätt 50 µL av den slutet reparation reaktionsblandning bereddes i steg 3.2.1 till varje 50 µL klippt DNA-prov väl. Blanda väl genom pipettering upp och ner eller mild vortexa.
    4. Rena prov med en pärlor baserat rening kit enligt tillverkaren protokoll.
  3. Polyadenylation av 3' slutar.
    1. Tillsätt 20 µl av dA-Tailing Master Mix i varje slutet-repareras, renade DNA-prov (ca 20 µL).
    2. Blanda väl genom pipettering upp och ner eller mild vortexa.
    3. Inkubera proverna vid 37 ° C i en termocykel och håll den sedan vid 4 ° C. Använd inte uppvärmd lock.
  4. Ligering av före fånga indexering adaptern.
    1. Tillsätt 5 µL av ligering Master Mix till varje A-tailed DNA-provet.
    2. Tillsätt 5 µL av lämplig före Index insamlingslösningen till varje prov.
    3. Täta brunnarna och blanda omsorgsfullt genom vortexa för 5 s. kort Centrifugera proverna.
    4. Inkubera proverna vid 20 ° C i 15 min i en termocykel och håll sedan vid 4 ° C. Använd inte uppvärmd lock.
    5. Rena av prov med en pärlor baserat rening kit enligt tillverkaren protokoll.
  5. Förstärkning av indexerade bibliotek.
    1. Förbereda lämplig volym av före fånga PCR-reaktionsblandning genom att blanda 1 µL Primer Mix och 25 µL av PCR-Master Mix. Blanda väl på en vortex mixer.
    2. Kombinera 26 µL förstärkning blandningen i separata brunnar i en PCR-plattan och 24 µL av varje prov med indexerade gDNA i biblioteket.
    3. Köra ett PCR-program med följande steg: 98 ° C under 2 minuter, 5 cykler vid 98 ° C i 30 s, 60 ° C under 30 s och 72 ° C i 1 min och en sista förlängning vid 72 ° C i 10 min. Håll proverna vid 4 ° C.
    4. Rena prov med en pärlor baserat rening kit enligt tillverkaren protokoll.
    5. Bedöma kvalitet med en Bioanalyzer enligt tillverkaren protokoll.
  6. Sammanslagning av indexerade DNA-prover för hybridisering
    1. För varje fånga reaktion pool, kombinera lämplig volym av varje indexerade gDNA bibliotek prov i en brunn i en PCR-plattan. Till exempel för mänskliga eller mus All-Exon fånga bibliotek, kombinera 8 bibliotek per pool med 187,5 ng av varje indexerade bibliotek. Se till att varje sista fånga reaktion pool innehåller 1500 ng av indexerade gDNA.
    2. Minska volymen i varje väl till < 7 µL med en vakuum koncentrator. Undvik helt torkning provet.
    3. Tillsätt tillräckligt nuclease-gratis vatten varje koncentrerad gDNA pool att föra den slutliga väl volymen till 7 µL och sedan vortex plattan som innehåller gDNA kraftigt i 30 s. centrifug i en centrifug eller mini plattan spinner att samla vätska på botten av brunnarna.
  7. Hybridisering av gDNA bibliotek pooler till fånga biblioteket
    1. Till varje 7 µL indexerade gDNA poolen, tillsätt 9 µl blockerande Mix. Pipettera upp och ner för att blanda.
    2. Mössa brunnarna, överföra förseglade plattan som innehåller gDNA till termocykel och inkubera vid 95 ° C i 5 min, då håller den vid 65 ° C. Kontrollera att plattan hålls vid 65 ° C under minst 5 minuter.
    3. Bered den tillämpliga utspädningen av RNase Block, på grundval av storleken på capture biblioteket (10% utspädning för biblioteken < 3,0 Mb och 25% utspädning för bibliotek > 3,0 Mb).
    4. Enligt fånga bibliotek storlek, kombinera rätt mängd fånga bibliotek och späd RNase Block lösningen i en PCR-plattan hålls på is. Blanda väl genom pipettering. För fånga bibliotek < 3,0 Mb, Använd 2 µl bibliotek och 5 µL RNase Block vid 10% utspädning. För fånga bibliotek > 3,0 Mb, användning 5 µl av bibliotek och 2 µl av RNase Block vid 25% utspädning.
    5. Tillsätt 37 µL av hybridisering buffert till varje brunn innehållande 7 µL av fånga bibliotek/RNase Block mix. Blanda väl genom pipettering och centrifugera kort plattan som innehåller mixen.
    6. Upprätthålla gDNA pool plattan vid 65 ° C medan du använder en flerkanalig pipett för att överföra den hela 44 µL av fånga bibliotek blandning från steg 3.7.5 till varje prov väl Skyltens gDNA pool. Blanda väl genom pipettering långsamt upp och ner 8 till 10 gånger.
    7. Täta brunnarna med välvd strip caps. Kontrollera att alla brunnar är helt förseglade. Placera en komprimering matta över PCR-plattan i termocykel.
    8. Inkubera hybridisering blandningen för 24 h vid 65 ° C. Obs: Prover kan vara hybridiseras för upp till 72 h, men måste kontrollera att den utökade hybridisering inte orsakar omfattande avdunstning i provet brunnarna.
  8. Beredning av streptividin-belagda magnetiska pärlor
    1. Prewarm tvättbuffert 2 vid 65 ° C i ett vatten bad eller värme block.
    2. Kraftfullt resuspendera streptividin magnetiska pärlor på en vortex mixer. De magnetiska pärlorna kvitta under lagring.
    3. För varje prov som hybridisering, tillsätt 50 µL av de återsuspenderade pärlorna till brunnar i en PCR-plattan.
    4. Tvätta pärlorna och återsuspendera dem i 200 µL av bindande buffert.
  9. Fånga av hybridiserade DNA med hjälp av streptividin pärlor.
    1. Beräkna och registrera volymen av hybridisering lösning som återstår efter 24 h ruvning.
    2. Underhålla hybridisering plattan vid 65 ° C och använda en flerkanalspipett för att överföra hela volymen (cirka 60 µL) av varje hybridisering blandning till plattan brunnarna som innehåller 200 µL tvättade streptividin pärlor. Blanda väl genom pipettering långsamt upp och ner 3 till 5 gånger.
    3. Cap brunnarna och inkubera fånga plattan på en Nutator mixer eller motsvarande för 30 min i rumstemperatur. Kontrollera att proverna blandar ordentligt i brunnarna.
    4. Kort Centrifugera fånga plattan i en centrifug eller mini plattan spinner.
    5. Sätt fånga plattan i en magnetisk separator att samla pärlor från upphävandet. Avlägsna och Kassera supernatanten.
    6. Återsuspendera pärlorna i 200 µL tvättlösning 1. Blanda genom pipettering upp och ner tills pärlorna är fullt resuspended.
    7. Centrifugera kort i en centrifug eller mini plattan spinner.
    8. Sätt plattan i den magnetiska avskiljaren.
    9. Vänta tills lösningen klar, sedan ta bort och Kassera supernatanten.
  10. Efter ta prov bearbetning för multiplexering sekvensering
    1. Förbered lämplig volym av PCR-reaktionsblandningen genom att blanda följande: 9 µL Nuclease-gratis vatten, 25 µL Master Mix och 1 µL Primer blanda enligt antalet kompletteringar. Blanda väl med en vortex mixer och hålla på is.
    2. För varje förstärkning reaktion, placera 35 µL av PCR-reaktionsblandningen från steg 3.10.1 i brunnarna PCR-platta.
    3. Pipettera varje pärla-bundna fångade bibliotek pool prov upp och ner för att säkerställa att pärla suspensionen är homogen.
    4. Tillsätt 15 µL av varje fångade bibliotek pool pärla suspension till lämplig PCR-reaktionsblandningen väl. Blanda omsorgsfullt genom pipettering tills pärla suspensionen är homogen.
    5. Placera plattan beredd i punkt 3.10.2 i en termocykel och kör följande PCR-amplifiering programmet: 98 ° C i 2 min, 8-11 cykler vid 98 ° C för 30 s, 60 ° C för 30 s och 72 ° C i 1 min, följt av en sista förlängning vid 72 ° C i 10 min. Håll proverna vid 4 ° C.
    6. Rena prov med en pärlor baserat rening enligt tillverkaren protokoll.
    7. Bedöma kvalitet med en Bioanalyzer enligt tillverkaren protokoll.
  11. Förbereda prover för multiplex sekvensering
    Obs: De slutliga berikad proverna innehåller pooler av antingen 8 eller 16 indexerade bibliotek, baserat på fånga bibliotek storlek och resulterande före fånga pooling strategi. Det totala antalet indexerade bibliotek som kan vara multiplexed i ett enda sekvensering lane bestäms av utdata specifikationerna av den plattform som används, tillsammans med mängden sekvensering data krävs för fånga biblioteket.
    1. Beräkna antalet index som kan kombineras per körfält, enligt kapaciteten för plattformen. Det totala antalet indexerade bibliotek som kan vara multiplexed i ett enda sekvensering lane bestäms av utdata specifikationerna av den plattform som används, tillsammans med mängden sekvensering data krävs för fånga biblioteket. Till exempel för människors alla Exon v5 biblioteket, rekommenderas sekvensering Data per indexerade bibliotek är 4 Gb och rekommenderat sekvensering Data per före capture Pool är 32 Gb (8-index pooler).
  12. Sekvensera biblioteken.
    1. Ladda biblioteken på nästa generations sekvensering plattformen av val och utföra den sekvensering köra enligt specifikationerna som instrument.
  13. Analysera exome sekvensering data.
    1. Kör rörledningen och programvaran val för bas samtal. Exempelvis använda Stampy karta läser20, ta bort dubbletter med Picard (http://broadinstitute.github.io/picard/) och identifiera enda nukleotid polymorfismer och infogning eller borttagning av baser (indels) med näbbdjuret21. Filtrera synonymt varianter och de som observerats på en allel frekvens < 5% och jämförelsedata med de från föräldrarnas exomes att identifiera de novo varianter.

4. plasmid DNA förberedelse för In Utero elektroporation

  1. Utforma flera kort hårnål RNAs (shRNAs) riktar sig till antingen de kodande sekvensen eller den 3' UTR kandidat gener som tidigare beskrivits22.
  2. För att förhindra avviker från målet testa effekter shRNAs specificitet av BLAST Sök mot databaser med standardmetoder. Utesluta shRNAs visar mer än 50% av komplementaritet med andra råtta gener.
  3. Klon glödgas oligonukleotider i en mU6-pro vektor som beskrivs tidigare23.
  4. Rena plasmid DNA med en Maxi-prep enligt tillverkarens anvisningar och gör en slutlig koncentration på 3 µg/µL.
  5. Alikvotens 20 µl av DNA (0,5 mg/ml pCAGGS-GFP antingen ensam eller med 1,5 mg/ml shRNA konstruera) och tillsätt 2 µL av snabb grön dye (2 mg/mL) att tillåta visuell övervakning av injektionen.

5. in Utero elektroporation

  1. Kirurgiskt ingrepp
    1. Söva E15.5 dräktiga honråttor (E0 definierades som dagen för bekräftelse av spermier-positiv vaginal plug), använda en kombination med en blandning av ketamin/xylazin (0,1 och 0,01 mg per kropp vikt, respektive), som ges via en intraperitoneal injektion för narkos induktion.
    2. Kontrollera att djuret är fullt anesthetized genom att observera försvinnandet av tå nypa reflex.
    3. Raka djurets nedre delen av magen med en clipper ta bort pälsen. Desinficera huden med hjälp av scrubs av povidonjod och 70% alkohol. Applicera veterinär salva på ögon att förhindra torrhet under anestesi.
    4. Placera djuret på en värmekälla och sätta en steril draperi (med ett öppet fönster på 4-5 cm i mitten) över snittet webbplatsen. Bära cyklop, labbrock, caps och sterila operationshandskar. Upprätthålla sterilitet fram till slutet av operationen.
    5. Med vass sax göra ett vertikalt snitt (2-2,5 cm) i huden längs mittlinjen i kaudala delen av magen och sedan göra ett snitt av muskel väggen under huden – också på 2,5 cm – längs mittlinjen.
    6. Noggrant exponera en livmoderns horn från bukhålan. Släppa 37 ° C före värmde normal koksaltlösning för att återfukta embryon. Hålla livmodern fuktig hela tiden.
  2. Injektion av DNA och elektroporation
    1. Håll en av livmoderns horn försiktigt med ringmärkta pincett och tryck försiktigt in ett embryo till livmoderväggen. Håll embryot i ena handen och med den andra handen in noggrant glas kapillärer 1 mm från mittlinjen i den vänstra laterala ventrikeln (2-3 mm djup) och injicera ca 1 µL av DNA med snabbt grönt att tillåta visuell övervakning av injektion med en microinjector.
    2. Droppe normal koksaltlösning på 3 x 7 mm2 elektroder yta. Placera sterila realitetelektroden på injicerade sida (vänster laterala ventrikeln) och den negativa sterila elektroden på höger kammare. Leverera 5 elektriska pulser 950 ms intervaller med en fot-kontrollerade pedal (4000 mF kondensatorn debiteras 40 V med en electroporator).
  3. Bokför elektroporation förfaranden
    1. Sätta tillbaka livmoderns horn till bukhålan, tillsätt droppar normal koksaltlösning till hålrummet att embryon placerad mer naturligt och att redovisa för intraoperativ vätskeförlust.
    2. Stäng magmuskelstation väggen med resorberbara kirurgiska suturer, sedan huden med hjälp av en enkel-avbruten söm.
    3. Sätta på råtta tillbaka till buren och övervaka djuret tills det framgår av anestesin.
    4. För smärtlindring administrera buprenorfin (0,03 mg/kg) till djuret som en subkutan injektion varje 8-12 h, för upp till 48 h.

6. hjärnan provberedning

  1. Fixering metod
    1. Offra dräktig råtta 5 dagar efter det kirurgiska ingreppet som använder gas anestesi (isofluran) följt av en snabb cervikal dislokation.
    2. Göra ett vertikalt snitt att åter öppna bukhålan.
    3. Avslöja livmoderns horn, ta bort embryon från livmodern och halshugga dem med vass sax.
    4. Ta bort hjärnan med minimal skada vävnaden: använda vass sax, göra ett litet snitt längs bakre (lillhjärnan) / främre (olfaktiva glödlampor) axeln i huvudet att tränga igenom huden och skalle, och sedan använda ett par pincett skala bort skallen att exponera den hjärna och ta bort den med en liten spatel.
    5. Fördjupa hjärnor övernattning på 4 ° C i en 4% PARAFORMALDEHYD 1 x fosfat fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
  2. Hjärnan snittning
    1. Tvätta hjärnor i 1 x PBS i 10 min.
    2. Bädda in hjärnor i 4% agar i plast inbäddning formar.
      1. Förbereda 50 mL 4% agar i 1 x PBS för inbäddning 5 embryonala hjärnor. Säkerställa att upplöst agaros är på mer än 50 ° C.
    3. Hålla hjärnor i agaros att polymerisera för minst 1 h vid 4° C. Ta bort överflödigt agaros runt hjärnan.
    4. Limma hjärnan att vibratome bottenplattan, orienterade så hjärnan anteriort/posteriort axel är vinkelrät mot bladet. Vänta några minuter tills limmet torka och placera plattan med limmade hjärnan i vibratome kammare.
    5. Fyll i vibratome med 1 x PBS. Skiva 100 µm tjocka sektioner.
    6. Överföra hjärnan skivor på bilderna, ta bort överflödig vätska, tillsätt några droppar av monteringsmedium och placera ett täckglas ovanpå hjärnor

7. confocal Imaging och kvantitativ analys

  1. Låt montering medium torrt över natten innan imaging. Bilden avsnitt 10 X på laserskanning confocal Mikroskop.
  2. Använda programvara för kvantitativ bildanalys, konvertera bilden i 8-bitars, Välj en representativ GFP positiva fluorescerande cell och manuellt definiera dess form. För att göra detta, klicka på ”uppskattning” och dra gränsen till cellen med freehand markeringsverktyget. I detta behålls sätt diameter och intensitet tröskel av cellen automatiskt av programvaran.
  3. Klicka på ”hitta celler” att tillåta programmet att lokalisera transfekterade celler i hela cortex. Sedan, om det behövs, manuellt ta bort falska positiva.
  4. Dela hela tjockleken på hjärnbarken i 8 områden av intresse normaliserade i enskilda avsnitt. För att uppnå detta, klicka på ”Region verktyg”, Välj 8 ”regionen Stripes” där först (1) och sist (8) ränder motsvarar VZ och toppen av CP respektive. Klicka på ”Apply” för att tillåta programmet att räkna den relativa positionen för god Jordbrukarsed transfekterade celler i hela cortex. Slutligen klicka på ”Spara kvantifiering” exportera data i en Excel-fil för analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den experimentella strategi som syftar till att identifiera nya MCD orsakande gener är återgetts i figur 1.

Genom att utföra array-CGH i en kohort av 155 patienter med utvecklande hjärnan avvikelser steglöst kombinerar PNH (figur 2A), corpus callosum missbildning, colpocephaly, cerebellär hypoplasi och polymicrogyria som är associerad med epilepsi, ataxi och kognitiv svikt, identifierade vi 1,2 Mb minimal kritiska borttagning i 6q27 delas av 12 patienter (figur 2B)21. Genomisk regionen innehåller fyra kända gener (THBS2, PHF10, TCTE3 och DLL1) och två förutspådde gener (WDR27 och C6orf70) (figur 2B).

Parallellt med array-CGH, WES analys i 14 patienter med isolerad bilaterala PNH och ingen kopia antalet variationer analys genomfördes, identifiera en patient med en de-novo -mutation (c.752T > A: pIle250Asn) i den förutspådda C6orf70 gen ( Genbank anslutningen nummer NM_018341.1) (figur 3).

Att bekräfta att den mutation som identifieras i C6orf70 hade en orsakande roll i PNH och för att undersöka om haploinsufficiency av andra gener mappning i 6q27 kan påverka fenotypen, deras roll i vivo neuronala migration undersöktes använda i livmodern RNAi-medierad knockdown strategi23,24 för att tysta sina uttryck i råtta kortikala neurala stamfäder. Bara gener uttrycks i utvecklingsländer råtta cortex, PHF10, C6orf70 och DLL1, testades (figur 4A). Olika kort hårnål RNAs (shRNAs) genererades inriktning de kodande sekvenserna av dessa tre gener. ShRNAs sedan infördes i neuroprogenitors i råtta hjärnbarken av Utero elektroporation på embryonala dag 15 (E15), när nervceller åtagit sig att övre kortikala skikt genereras. Grönt fluorescerande protein användes som transfection reporter. Relativ fördelning av GFP-positiva celler undersöktes 5 dagar efter elektroporation. Knockdown Dll1 och Phf10 resulterade i en viss fördröjning av radiella neuronala migration (inga data anges), medan Nedslagning av C6orf70 nedsatt neuronala migration och gav upphov till utveckling av heterotop knölar mycket påminner om dem som observerats i FLNAEN knockdown modell (figur 4B)24. Omvänt, transfections med den ineffektiva C6orf70 mismatch shRNA hade ingen uppenbar påverkan på neuronal migration (figur 4B).

Figure 1
Figur 1: Arbetsflöde för identifiering av romanen MCD orsakande gener identifiering. Schematisk bild av de olika strategier som kan användas för att identifiera nya sjukdom som orsakar gener. Rutor färgade i gult representerar de metoder som beskrivs i detta dokument. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: 6q27 borttagningar orsaka onormala hjärnans utveckling med PNH. (A) Patient 2. T2-vägde koronala (till vänster) och T1-vägde axiell (höger panel) sektioner visar PNH kantar väggen i den vänstra tinningloben (vit och svart pilspets) nedanför en ovikt insular cortex. (B) Patient 11. T1-vägd koronalt avsnitt, visar bilaterala heterotopisk noduli längs väggarna i de tidsmässiga hornsna (vit pilspetsar). (C) patienten 12. T2-vägde koronalt avsnitt. Till vänster, PNH är fortfarande synliga (svart pil) och ventriklarna är vidgade. (D) Schematisk bild av borttagningar av regionen 6q27 identifierats hos PNH-patienter med hjälp av array-CGH (övre delen). Den horisontella, streckade linjer representerar borttagningar identifierats hos patienter. Storleken på den minimala kritiska bort regionen är också indicerat och innehåller fyra kända gener: THBS2, PHF10, TCTE3 och DLL1 och två förutspådda gener: WDR27 och C6orf70 (övre delen). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Sekvensering resultat. ( ) T2 - viktad axial avsnitt visar bilaterala PNH i frontal hornen (vit pilspetsar) i patienten bära c.752T > en mutation i C6orf70. (B) Sanger sekvensering visar att uppstod mutationen identifieras av WES de novo. Placeringen av mutationen indikeras av svart pilspetsar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Uttryck analys av gener lokaliserade i 6q27 minimal kritiska regionen och C6orf70-knockdown förändrar radiella migration av kortikala neuroner. (A) kvantitativ RT-PCR som visar uttrycket av gener som finns i regionen 6q27 kritiska i råtta hjärnbarken. Cyclophilin A användes för normalisering. (B) representativa hjärnbarkens koronalt avsnitt av E20 råtta hjärnor 5 dagar efter elektroporation med antingen grönt fluorescerande Protein bygga ensam (kontroll), eller i kombination med shRNA inriktning den C6orf70 kodande sekvens (C6orf70-shCDS) eller med en relativ ineffektiva felmatchning bygga (C6orf70-shCDSmm). FLNAEN -knockdown (FLNAEN-shCDS) användes som kontroll av nedsatt neuronala migration. In utero elektroporation med C6orf70-shCDS- eller FLNAEN-shCDS inducerad gripandet av GFP-positiva celler inom ventrikulära zonen (VZ) (vita pilar), medan de celler som uttrycker GFP ensamt eller i kombination med en felmatchning konstruera förändrade inte neuronala migration. Skala barer = 200 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

MCDs är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av resistenta barndom epilepsi1,2. Intresset för MCDs har ökat dramatiskt det senaste decenniet som en följd av två huvudfaktorer. Först är förbättringen i hjärnavbildning (särskilt MRT), som tillåter läkare och forskare att visualisera många missbildningar i hjärnan som inte tidigare kändes igen. Den andra är utvecklingen av genetiska verktyg som har tillåtit identifiering av många roman MCD orsakande gener. Detta har avsevärt förbättrat vår kunskap om de mekanismer som ligger bakom hjärnans utveckling och funktion, och möjliggjorde mer korrekt genetisk rådgivning.

Tidigare inriktats forskare sina insatser främst på orsakande genen identifiering, lämnar utformningen av funktionella analyser för att klargöra deras roll i hjärnans utveckling till senare stadier. Detta har blivit svårare på grund av progression från studien av sällsynta, återkommande genetiska sjukdomar till vanligare sporadiska störningar för vilken traditionell gen att hitta metoder inte är mottagliga. Nuvarande metoder att identifiera orsakande gener ofta tillåta identifiering av relativt stora regioner i genomet som innehåller många gener (array-CGH) eller flera varianter i ett antal kandidatgener som är svåra att validera (WES eller WGS).

Array-CGH och WES (eller WGS) metoder har breddat mutation spektrumet för många genetiska sjukdomar. Trots kvar vissa kritiska begränsningar fortfarande. Till exempel, array-CGH behöver högkvalitativa DNA och misslyckas identifiera balanserade translokationer eller små borttagningar/dubbelanslutna personer inklusive de som rör en eller par exoner om en enda gen. För att lösa detta problem, kan array-CGH utföras med en högre upplösning än konventionella sond avstånd (t.ex. med 1 M array-CGH kit) eller ersätts med SNP-array-analys. WES ofta täcker inte stora intragenic regioner och misslyckas med att identifiera djupt intronic mutationer. Dessutom kan ibland täckningen vara för låg för att identifiera orsakande mutationer (särskilt vid mutationer med låg andel av mosaicism). En annan avgörande steg för WES är att dataanalys och filtrering fortfarande kräver avsevärda ansträngningar. För att öka täckningen av WES, antalet patienter i en enda experiment kan minskas eller olika capture Kit kan användas samtidigt.

IUE är det lämpligaste sättet att analysera effekterna av gener knockdown neuronala migration. Utredningar på andra steg av kortikala utvecklingsmässiga, såsom neurogenes och nervcellernas mognad, hindras dock av vissa tekniska begränsningar. Faktiskt utförs IUE innan E13 är ofta misslyckade medan utredningar på senare stadier begränsas av den höga andelen postnatal dödlighet associerade till detta förfarande. Gen-knockdown effektivitet kan dessutom skilja sig bland electroporated embryon leder till betydande fenotypiska olikheter.

Sammantaget har detta protokoll fyra stora kritiska steg. Även om det inte är en del av de protokoll som beskrivs i detta dokument, måste vi påpeka att det första grundläggande steget som skall beaktas är urvalet av patienter att vara inskrivna i sådana studier. Processen att identifiera roman MCD gener kräver faktiskt kliniska och bildgivande undersökningar i en kohort av patienter för vilka fenotypen bör vara så enhetlig som möjligt. Samla in patienter med mycket homogen fenotyp ökar chansen för att identifiera orsakande mutationer i en viss gen. Det minsta antalet patienter att vara inskrivna i sådana studier för att nå framgång är dock svårt att förutsäga, eftersom det kraftigt beror på mutation av olika gener. Exempelvis för gener såsom FLNAEN, som är muterad i 100% av familjär fall av X-länkade bilaterala PNH och hos 26% av sporadiska patienter, kan antalet patienter som behövs för att identifiera flera träffar i genen vara relativt låg. Omvänt, för gener med låg mutationshastighet, antalet patienter som skall kontrolleras är högre. Till exempel när det gäller C6orf70, vi kunde identifiera en enda orsakande mutation endast vid screening 64 patienter (14 genom WES och 50 genom konventionella Sanger sekvensering)16, uppskatta en mutationshastighet för denna gen på cirka 1,5%. Den andra kritiska steget är uteslutandet av mutationer i alla kända MCD gener för att identifiera nya orsakande gener. Tack vare tillkomsten av nya nästa generations sekvensering tekniker, kan mutation screening av kända och kandidat gener nu utföras i en enda experiment. Lämpliga varianter filtrering bör dock användas för att undvika förekomsten av ett alltför stort antal falsklarm bekräftas försöksvis och att filtrera bort eventuella orsakande mutationer. Ja, antalet kandidat gener/varianter är särskilt hög i WES experiment. Om medverkan av en viss gen misstänks, bör mutation screening också kompletteras med MLPA analys, att utesluta microdeletions eller microduplications. Den tredje kritiska punkten är det faktum att kromosomala rearrangements påverkas starkt av placeringen av brytpunkten. I detta sammanhang är det värt att utesluta, att i största möjliga utsträckning, störningar eller förskjutningen av cis-reglerande element distalt gener som inte ingår i radering/dubblering. I vivo RNAi experiment antar slutligen att orsakande gener spelar en direkt roll i neuronala migration under embryonala stadier. Men etiologin till MCD, inklusive PNH, är heterogen och metoden i livmodern kunde misslyckas att upptäcka effekterna av gener involverade i utvecklings steg inklusive neuronal spridning eller cell överlevnad. Dessutom kunde låg komplexitet av gnagare hjärnan maskera effekterna av överväldigande eller överuttryck av en given kandidat gen, som kan vara mer uppenbart i den mänskliga hjärnan.

Vi anser att integrationen av genomik och i vivo funktionella studier kommer att bidra till att utveckla nya diagnostiska verktyg för identifiering av nya MCD orsakande gener. Denna strategi kan också ge nya djurmodeller för att testa terapeutiska mål och förstå patofysiologin bakom MCD, som har hittills varit begränsat av bristen på experimentella modeller och begränsad tillgång till hjärnvävnad från drabbade patienter. Dechiffrera de molekylära vägar som är associerade med MCD ger störningar också värdefull ny information om fysiologiska hjärnans utveckling i allmänhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, Pr. dvs Scheffer, Pr. S.P. Roberston och Pr. S.F. Berkovic för att ge MCD patienter. Vi tackar Dr. F. Michel och D. Mei för tekniska råd och hjälp. Detta arbete stöds av finansiering från EU, sju ramprogram önskan projekt, avtalsnummer: hälsa-F2-602531-2013, (till V.C., R.G., A.R., A.F. och C.C.), INSERM (att A.R. och C.C.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA till Aronsson, E.P.P och C.C) och Région Provence Alpes Côte d'Azur (APO2014 - DEMOTISKA C.C. och arminn). D.A.K är en EMBO Young Investigator och stöds av FWF beviljar (I914 och P24367).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Picospritzer III Parker Hannifin Corp P/N 051-0500-900 Intracellular Microinjection Dispense Systems
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 Fast green allow visual monitoring of the injection
BTX ECM 830 electroporator BTX Harvard Apparatus 45-0002 The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications
Microtome HM 650 V Microm 10076838 Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade
FluoView 300 Olympus The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application
eCELLence software Glance Vision Technologies eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration
Agilent Microarray Scanner Bundle Array slides
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K Agilent Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K Agilent Agilent p/n G4900DA or G2565CA
Hybridization Chamber, stainless Agilent Agilent p/n G2534A Chamber for array CGH hybridization
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack Gasket for array CGH hybridization
for 1-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60003
for 2-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60002
for 4-pack microarrays or Agilent Agilent p/n G2534-60011
for 8-pack microarrays Agilent Agilent p/n G2534-60014
Hybridization oven Agilent Agilent p/n G2545A
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers Agilent Agilent p/n G2530-60029
Thermal cycler with heated lid Agilent Agilent p/n G8800A or equivalent Termal cycler for incubations
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube Ambion p/n AM12400 or equivalent Microcentrifuge
Magnetic stir bar Corning p/n 401435 or equivalent Instrument for stirring
Qubit Fluorometer Life Technologies p/n Q32857 Instrument for DNA quantification
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer Invitrogen p/n Q32850 Kit for Qubit fluorometer
UV-VIS spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent Instrument for DNA quantification
P10, P20, P200 and P1000 pipettes Pipetman or equivalent DNA dispensation
Vacuum Concentrator Thermo Scientific p/n DNA120-115 or
equivalent		 Instrument to concentrate DNA
SureTag Complete DNA Labeling Kit Agilent p/n 5190-4240 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Purification Columns (50 units) Agilent p/n 5190-3391 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
AutoScreen A, 96-well plates GE Healthcare p/n 25-9005-98 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
GenElute PCR Clean-Up Kit Sigma-Aldrich p/n NA1020 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
Human Genomic DNA p/n G1521 DNA Labeling Kit (for Human Samples)
For CGH microarrays: Promega (female) or p/n G1471 (male) Array CGH control DNA
For CGH+SNP microarrays: Coriell p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 Array CGH control DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or Agilent p/n 5188-5226 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and Agilent p/n 5188-5221 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 Agilent p/n 5188-5222 Array CGH hybridization and wash
Stabilization and Drying Solution Agilent p/n 5185-5979 Array CGH hybridization and wash
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit Agilent p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) Array CGH hybridization and wash
Human Cot-1 DNA Agilent p/n 5190-3393 Array CGH hybridization and wash
Agilent C scanner Agilent Scanner for array CGH slides
SureSelect XT2 Reagent Kit Kit for target enrichment
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples Agilent p/n G9621A
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples Agilent p/n G9621B
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples Agilent p/n G9621C
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples Agilent p/n G9622A
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples Agilent p/n G9622B
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples Agilent p/n G9622C
DNA 1000 Kit Agilent p/n 5067-1504 Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp.
High Sensitivity DNA Kit Agilent p/n 5067-4626 Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries.
AMPure XP Kit Kit for automated PCR purification.
5 mL Agencourt p/n A63880
60 mL Agencourt p/n A63881
450 mL Agencourt p/n A63882
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 Isolation and handling of biotinylated nucleic acids
2 mL Life Technologies Cat #65601
10 mL Life Technologies Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer DNA quantification
100 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32850
500 assays, 2-1000 ng Life Technologies Cat #Q32853
Qubit assay tubes Life Technologies p/n Q32856 DNA quantification
SureSelec tXT2 Capture Libraries Agilent depending on the experiment Kit for libraries capture
SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8800A DNA amplification
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler Agilent p/n G8810A DNA amplification
SureCycler 8800-compatible 96-well plates Agilent p/n 410088 DNA amplification
Optical strip caps Agilent p/n 401425 DNA amplification
Tube cap strips, domed Agilent p/n 410096 DNA amplification
Compression mats Agilent p/n 410187 DNA amplification
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle Agilent p/n G2943CA DNA amplification
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set Agilent p/n G2947CA DNA amplification
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series Covaris DNA shearing
Covaris sample holders p/n 520078 DNA shearing
Nutator plate mixer BD Diagnostics p/n 421105 or equivalent Plate Mixer
GaIIx Illumina next generation sequencing machine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meencke, H. J., Veith, G. Migration disturbances in epilepsy. Epilepsy Res. 9, 31-39 (1992).
  2. Shorvon, S., Stefan, H. Overview of the safety of newer antiepileptic drugs. Epilepsia. 38 (1), 45-51 (1997).
  3. Parrini, E., et al. Periventricular heterotopia: phenotypic heterogeneity and correlation with Filamin A mutations. Brain. 129 (7), 1892-1906 (2006).
  4. Fox, J. W., et al. Mutations in filamin 1 prevent migration of cerebral cortical neurons in human periventricular heterotopia. Neuron. 21 (6), 1315-1325 (1998).
  5. Sheen, V. L., et al. Mutations in ARFGEF2 implicate vesicle trafficking in neural progenitor proliferation and migration in the human cerebral cortex. Nat Genet. 36 (1), 69-76 (2004).
  6. Cappello, S., et al. Mutations in genes encoding the cadherin receptor-ligand pair DCHS1 and FAT4 disrupt cerebral cortical development. Nat Genet. 45 (11), 1300-1308 (2013).
  7. Moro, F., et al. Periventricular heterotopia in fragile X syndrome. Neurology. 67 (4), 713-715 (2006).
  8. Ferland, R. J., Gaitanis, J. N., Apse, K., Tantravahi, U., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Periventricular nodular heterotopia and Williams syndrome. Am J Med Genet A. 140 (12), 1305-1311 (2006).
  9. van Kogelenberg, M., et al. Periventricular heterotopia in common microdeletion syndromes. Mol Syndromol. 1 (1), 35-41 (2010).
  10. Sheen, V. L., et al. Periventricular heterotopia associated with chromosome 5p anomalies. Neurology. 60 (6), 1033-1036 (2003).
  11. Neal, J., Apse, K., Sahin, M., Walsh, C. A., Sheen, V. L. Deletion of chromosome 1p36 is associated with periventricular nodular heterotopia. Am J Med Genet A. 140 (15), 1692-1695 (2006).
  12. Cardoso, C., et al. Periventricular heterotopia, mental retardation, and epilepsy associated with 5q14.3-q15 deletion. Neurology. 72 (9), 784-792 (2009).
  13. Cellini, E., et al. Periventricular heterotopia with white matter abnormalities associated with 6p25 deletion. Am J Med Genet A. 158 (7), 1793-1797 (2006).
  14. Bertini, V., De Vito, G., Costa, R., Simi, P., Valetto, A. Isolated 6q terminal deletions: an emerging new syndrome. Am J Med Genet A. 140 (1), 74-81 (2006).
  15. Dobyns, W. B., et al. Consistent chromosome abnormalities identify novel polymicrogyria loci in 1p36.3, 2p16.1-p23.1, 4q21.21-q22.1, 6q26-q27, and 21q2. Am J Med Genet A. 146 (13), 1637-1654 (2008).
  16. Conti, V., et al. Periventricular heterotopia in 6q terminal deletion syndrome: role of the C6orf70 gene. Brain. 136 (11), 3378-3394 (2013).
  17. Sheen, V. L., et al. Etiological heterogeneity of familial periventricular heterotopia and hydrocephalus. Brain Dev. 26 (5), 326-334 (2004).
  18. Jaglin, X. H., et al. Mutations in the beta-tubulin gene TUBB2B result in asymmetrical polymicrogyria. Nat. Genet. 41 (6), 746-752 (2009).
  19. Falace, A., et al. TBC1D24 regulates neuronal migration and maturation through modulation of the ARF6-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (6), 2337-2342 (2014).
  20. Lunter, G., Goodson, M. Stampy: a statistical algorithm for sensitive and fast mapping of Illumina sequence reads. Genome Res. 21 (6), 936-939 (2011).
  21. Pagnamenta, A. T., et al. Exome sequencing can detect pathogenic mosaic mutations present at low allele frequencies. J Hum Genet. 57 (1), 70-72 (2012).
  22. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (9), 6047-6052 (2002).
  23. Bai, J., et al. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. 6 (12), 1277-1283 (2003).
  24. Carabalona, A., et al. A glial origin for periventricular nodular heterotopia caused by impaired expression of Filamin-A. Hum Mol Genet. 21 (5), 1004-1017 (2012).

Tags

Neurovetenskap fråga 130 missbildningar av kortikala utveckling array-CGH hela-exome sekvensering i livmodern elektroporation djurmodell RNA-interferens
En ny strategi kombinera Array-CGH, hela-exome sekvensering och <em>In Utero</em> elektroporation hos gnagare att identifiera orsakande gener för hjärnan missbildningar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conti, V., Carabalona, A.,… More

Conti, V., Carabalona, A., Pallesi-Pocachard, E., Leventer, R. J., Schaller, F., Parrini, E., Deparis, A. A., Watrin, F., Buhler, E., Novara, F., Lise, S., Pagnamenta, A. T., Kini, U., Taylor, J. C., Zuffardi, O., Represa, A., Keays, D. A., Guerrini, R., Falace, A., Cardoso, C. A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations. J. Vis. Exp. (130), e53570, doi:10.3791/53570 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter