Periventrikulär nodulär heterotopia (PNH) är den vanligaste formen av missbildning av kortikala utveckling (MCD) i vuxen ålder men dess genetiska grunden förblir okänd i mest sporadiska fall. Vi har nyligen utvecklat en strategi att identifiera nya kandidatgener för MCDs och direkt bekräfta deras orsakande roll i vivo.
Fosterskador som involverar hjärnbarken – kallas även missbildningar av kortikala utveckling (MCD) — är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av läkemedelsresistent epilepsi i barndomen. Högupplösta hjärnavbildning har underlättat i vivo identifiering av en stor grupp av MCD fenotyper. Trots framsteg inom hjärnavbildning, genomanalys och generering av djurmodeller saknas ett enkelt arbetsflöde att systematiskt prioriterar kandidatgener och testa funktionella effekter av förmodad mutationer. För att lösa detta problem, var en experimentell strategi som möjliggör identifiering av romanen orsakande gener för MCD utvecklats och validerats. Denna strategi är baserad på identifierande kandidat genomisk regioner eller gener via array-CGH eller hela-exome sekvensering och karaktärisera effekterna av deras inaktivering eller överuttryck av specifika mutationer utveckla gnagare hjärnan via i utero elektroporation. Denna metod ledde till identifiering av genen C6orf70 , som kodar för en förmodad vesikulär protein, till patogenesen av periventrikulär nodulär heterotopia, en MCD som orsakas av defekta neuronala migration.
Hjärnbarken spelar en nyckelroll i kognitiva och intellektuella processer och är involverad i emotionell kontroll samt inlärning och minne. Det är därför inte förvånande att många neurologiska och psykiatriska sjukdomar resultera från missbildningar av kortikala utveckling (MCD). Etiologin till MCD är komplex eftersom både förvärvade och genetiska faktorer är inblandade. Den kumulativa förekomsten av genetiskt bestämd andel MCD är ca 2% och de är sporadiska i de flesta fall. Till exempel incidensen av medfödda hjärna missbildning uppskattades vara högre än 1% i den mänskliga befolkningen, och vissa former av MCD observeras i mer än 14% av alla patienter med epilepsi och hos 40% av svår eller svårbehandlad epilepsi1, 2.
Periventrikulär nodulär Heterotopia (PNH) är en av de vanligaste MCDs och orsakas av onormal migration av nervceller från ventrikulära zonen (VZ) att utveckla hjärnbarken. Fel i nervceller att migrera resultat i kluster av heterotop nervceller längs väggarna i de laterala ventriklarna som vanligtvis kan visualiseras med hjälp av magnetisk resonanstomografi (MRT). Kliniska, anatomiska och imaging funktioner i PNH är heterogena. Noduli varierar från små och ensidiga bilateral och symmetrisk. Vanliga kliniska följdtillstånd inkluderar epilepsi och intellektuella funktionshinder3. Mutationer i genen Filamin A (eller FLNAEN), som kartor i Xq28, hittades i 100% av familjer med X-länkade bilaterala PNH och hos 26% av sporadiska patienter3,4. En sällsynt, recessiv form av PNH orsakas av mutationer i genen ARFGEF2 , som kartor i 20q13, har rapporterats i två consanguineous familjer5. Biallelic mutationer i gener som kodar för receptorn-ligand cadherin para DCHS1 och FAT4 har nyligen upptäckts i nio patienter som drabbas av en multisystemisk sjukdom som inkluderar PNH6. PNH har också associerats med skör X syndrom7, Williams syndrom8, 22q11 microdeletion syndrom9, dubletter på 5 p 1510, borttagningar på 1 p 3611, 5q14.3-q1512, 6 p 2513 och 6q terminal radering syndrom14,15,16,17,18,19, vilket tyder på att ytterligare orsakande gener är utspridda hela genomet. För cirka 74% av sporadiska PNH-patienter återstår emellertid den genetiska grunden vara klarlagd17.
Klassiskt gene mappning metoder såsom array jämförande genomisk hybridisering (array-CGH) har visat sig vara ett kraftfullt verktyg för detektion av sub mikroskopiska kromosomavvikelser, men Regionkommittén genomisk identifieras med hjälp av denna metod är ofta stora och innehåller många gener.
Tillkomsten av massiva parallella sekvensering tekniker (dvs. hela-Exome sekvensering (WES) och Whole-Genome sekvensering (WGS)) har avsevärt minskat både kostnaden och tidsåtgången att sekvensera en hela mänskliga exome eller genomet. Tolkning av WES och WGS data är dock fortfarande utmanande i flesta fall, sedan för varje patient tiotals till hundratals (eller ens tusentals, beroende från vilken typ av analys) varianter ur datafiltrering.
För att påskynda processen att identifiera roman MCD orsakande gener, en roman systematisk strategi som kombinerar array-CGH, var WES och Utero elektroporation (IUE) screening av kandidatgener utformad. IUE gör det möjligt att selektivt inaktivera (eller överuttrycka) specifika gener eller mutationer i gnagare hjärnor, möjliggör snabb utvärdering av deras deltagande i corticogenesis18,19. RNAi medierad-knockdown eller överuttryck av en eller flera kandidatgener förväntas orsaka, när genen associeras med sjukdomsutvecklingen, lokaliserade defekter i neuronala migration och/eller mognad. Efter identifiering av en gen vars inaktivering (eller överuttryck) återger den fenotyp som observerats hos patienter i gnagare, blir det en enastående kandidat för screening i sporadiska patienter med MCD. Använder denna metod, avslöjat vi nyligen den C6orf70 genen (även känd som ERMARD) avgörande bidrag i PNH patogenesen hos hysande 6q27 kromosomala borttagningar16.
MCDs är viktiga orsaker till utvecklingsstörning och står för 20-40% av resistenta barndom epilepsi1,2. Intresset för MCDs har ökat dramatiskt det senaste decenniet som en följd av två huvudfaktorer. Först är förbättringen i hjärnavbildning (särskilt MRT), som tillåter läkare och forskare att visualisera många missbildningar i hjärnan som inte tidigare kändes igen. Den andra är utvecklingen av genetiska verktyg som har tillåtit identifiering …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. G. McGillivray, Pr. J. Clayton-Smith, Pr. W.B. Dobyns, Pr. P. Striano, Pr. dvs Scheffer, Pr. S.P. Roberston och Pr. S.F. Berkovic för att ge MCD patienter. Vi tackar Dr. F. Michel och D. Mei för tekniska råd och hjälp. Detta arbete stöds av finansiering från EU, sju ramprogram önskan projekt, avtalsnummer: hälsa-F2-602531-2013, (till V.C., R.G., A.R., A.F. och C.C.), INSERM (att A.R. och C.C.), Fondation Jérôme Lejeune (R13083AA till Aronsson, E.P.P och C.C) och Région Provence Alpes Côte d’Azur (APO2014 – DEMOTISKA C.C. och arminn). D.A.K är en EMBO Young Investigator och stöds av FWF beviljar (I914 och P24367).
Picospritzer III | Parker Hannifin Corp | P/N 051-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Fast green allow visual monitoring of the injection |
BTX ECM 830 electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 | The ECM 830 is a Square Wave Pulse generator designed for in vitro and in vivo applications |
Microtome HM 650 V | Microm | 10076838 | Microtome HM 650 V vibratome 240V 50/60Hz with vibrating blade |
FluoView 300 | Olympus | The Olympus FluoViewTM 300 is a point-scanning, point-detection, confocal laser scanning microscope designed for biology research application | |
eCELLence software | Glance Vision Technologies | eCELLence is software designed for the quantitive analysis of cell migration | |
Agilent Microarray Scanner Bundle | Array slides | ||
for 1 x 244K, 2 x 105K, 4 x 44K or 8 x 15K | Agilent | Agilent p/n G4900DA, G2565CA or G2565BA | |
for 1 x 1M, 2 x 400K, 4 x 180K or 8 x 60K | Agilent | Agilent p/n G4900DA or G2565CA | |
Hybridization Chamber, stainless | Agilent | Agilent p/n G2534A | Chamber for array CGH hybridization |
Hybridization Chamber gasket slides, 5-pack | Gasket for array CGH hybridization | ||
for 1-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60003 | |
for 2-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60002 | |
for 4-pack microarrays or | Agilent | Agilent p/n G2534-60011 | |
for 8-pack microarrays | Agilent | Agilent p/n G2534-60014 | |
Hybridization oven | Agilent | Agilent p/n G2545A | |
Hybridization oven rotator for Agilent Microarray Hybridization Chambers | Agilent | Agilent p/n G2530-60029 | |
Thermal cycler with heated lid | Agilent | Agilent p/n G8800A or equivalent | Termal cycler for incubations |
1.5 mL RNase-free Microfuge Tube | Ambion | p/n AM12400 or equivalent | Microcentrifuge |
Magnetic stir bar | Corning | p/n 401435 or equivalent | Instrument for stirring |
Qubit Fluorometer | Life Technologies | p/n Q32857 | Instrument for DNA quantification |
Qubit dsDNA BR Assay Kit, for use with the Qubit fluorometer | Invitrogen | p/n Q32850 | Kit for Qubit fluorometer |
UV-VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 or 2000, or equivalent | Instrument for DNA quantification |
P10, P20, P200 and P1000 pipettes | Pipetman or equivalent | DNA dispensation | |
Vacuum Concentrator | Thermo Scientific | p/n DNA120-115 or equivalent |
Instrument to concentrate DNA |
SureTag Complete DNA Labeling Kit | Agilent | p/n 5190-4240 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
Purification Columns (50 units) | Agilent | p/n 5190-3391 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
AutoScreen A, 96-well plates | GE Healthcare | p/n 25-9005-98 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | p/n NA1020 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) |
Human Genomic DNA | p/n G1521 | DNA Labeling Kit (for Human Samples) | |
For CGH microarrays: | Promega | (female) or p/n G1471 (male) | Array CGH control DNA |
For CGH+SNP microarrays: | Coriell | p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, or NA18579 | Array CGH control DNA |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer Kit or | Agilent | p/n 5188-5226 | Array CGH hybridization and wash |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 1 and | Agilent | p/n 5188-5221 | Array CGH hybridization and wash |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Wash Buffer 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | Array CGH hybridization and wash |
Stabilization and Drying Solution | Agilent | p/n 5185-5979 | Array CGH hybridization and wash |
Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit | Agilent | p/n 5188-5220 (25) or p/n 5188-5380 (100) | Array CGH hybridization and wash |
Human Cot-1 DNA | Agilent | p/n 5190-3393 | Array CGH hybridization and wash |
Agilent C scanner | Agilent | Scanner for array CGH slides | |
SureSelect XT2 Reagent Kit | Kit for target enrichment | ||
HiSeq platform (HSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9621A | |
HiSeq platform (HSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9621B | |
HiSeq platform (HSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9621C | |
MiSeq platform (MSQ), 16 Samples | Agilent | p/n G9622A | |
MiSeq platform (MSQ), 96 Samples | Agilent | p/n G9622B | |
MiSeq platform (MSQ), 480 Samples | Agilent | p/n G9622C | |
DNA 1000 Kit | Agilent | p/n 5067-1504 | Kit for the separation, sizing and quantification of dsDNA fragments from 25 to 1000 bp. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent | p/n 5067-4626 | Kit for analysis of fragmented DNA or DNA libraries. |
AMPure XP Kit | Kit for automated PCR purification. | ||
5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Isolation and handling of biotinylated nucleic acids | ||
2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit, for the Qubit fluorometer | DNA quantification | ||
100 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
500 assays, 2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
Qubit assay tubes | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA quantification |
SureSelec tXT2 Capture Libraries | Agilent | depending on the experiment | Kit for libraries capture |
SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8800A | DNA amplification |
96 well plate module for SureCycler 8800 Thermal Cycler | Agilent | p/n G8810A | DNA amplification |
SureCycler 8800-compatible 96-well plates | Agilent | p/n 410088 | DNA amplification |
Optical strip caps | Agilent | p/n 401425 | DNA amplification |
Tube cap strips, domed | Agilent | p/n 410096 | DNA amplification |
Compression mats | Agilent | p/n 410187 | DNA amplification |
2100 Bioanalyzer Laptop Bundle | Agilent | p/n G2943CA | DNA amplification |
2100 Bioanalyzer Electrophoresis Set | Agilent | p/n G2947CA | DNA amplification |
Covaris Sample Preparation System, E-series or S-series | Covaris | DNA shearing | |
Covaris sample holders | p/n 520078 | DNA shearing | |
Nutator plate mixer | BD Diagnostics | p/n 421105 or equivalent | Plate Mixer |
GaIIx | Illumina | next generation sequencing machine |