To obtain basic information on the sorption and recycling of gold from aqueous systems the interaction of Au(III) and Au(0) nanoparticles on S-layer proteins were investigated. The sorption of protein polymers was investigated by ICP-MS and that of proteinaceous monolayers by QCM-D. Subsequent AFM enables the imaging of the nanostructures.
In this publication the gold sorption behavior of surface layer (S-layer) proteins (Slp1) of Lysinibacillus sphaericus JG-B53 is described. These biomolecules arrange in paracrystalline two-dimensional arrays on surfaces, bind metals, and are thus interesting for several biotechnical applications, such as biosorptive materials for the removal or recovery of different elements from the environment and industrial processes. The deposition of Au(0) nanoparticles on S-layers, either by S-layer directed synthesis 1 or adsorption of nanoparticles, opens new possibilities for diverse sensory applications. Although numerous studies have described the biosorptive properties of S-layers 2-5, a deeper understanding of protein-protein and protein-metal interaction still remains challenging. In the following study, inductively coupled mass spectrometry (ICP-MS) was used for the detection of metal sorption by suspended S-layers. This was correlated to measurements of quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D), which allows the online detection of proteinaceous monolayer formation and metal deposition, and thus, a more detailed understanding on metal binding.
The ICP-MS results indicated that the binding of Au(III) to the suspended S-layer polymers is pH dependent. The maximum binding of Au(III) was obtained at pH 4.0. The QCM-D investigations enabled the detection of Au(III) sorption as well as the deposition of Au(0)-NPs in real-time during the in situ experiments. Further, this method allowed studying the influence of metal binding on the protein lattice stability of Slp1. Structural properties and protein layer stability could be visualized directly after QCM-D experiment using atomic force microscopy (AFM). In conclusion, the combination of these different methods provides a deeper understanding of metal binding by bacterial S-layer proteins in suspension or as monolayers on either bacterial cells or recrystallized surfaces.
В связи с увеличением использования золота в течение нескольких приложений, таких как электроника, катализаторы, биосенсоров, или медицинских инструментов, спрос этого драгоценного металла выросла за время последних нескольких лет 6-9. Золото, а также многие другие драгоценные и тяжелые металлы попадают в окружающую среду с помощью промышленных стоков в разбавленных концентрациях, через горнодобывающей деятельности и утилизации отходов 7,8,10, хотя большинство загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами или драгоценными это непрерывный процесс в основном обусловлено технической деятельности. Это приводит к значительному вмешательству природных экосистем и потенциально может угрожать здоровью человека 9. Зная эти негативные последствия способствует поиск новых методов для удаления металлов из загрязненных экосистем и улучшения в переработке металлов из промышленных сточных вод. Налаженные физико-химические методы, такие как осаждение или ионного обмена, не так эффективны, особенно в высокийLY разбавляют решения 7,8,11. Биосорбция, либо с живых или мертвых биомассы, является привлекательной альтернативой для очистки сточных вод 10,12. Использование таких биологических материалов может уменьшить потребление токсичных химических веществ. Многие микроорганизмы были описаны накапливать или иммобилизации металлов. Например, клетки Lysinibacillus sphaericus (Л. sphaericus) JG-A12 показали высокие обязательные потенциала на драгоценные металлы, например, Pd (II), Pt (II) Au (III) и другие токсичные металлы, такие как Pb (II) или U (VI), 4,13, клетки Bacillus megaterium для Cr (VI) 14, клетки Saccharomyces CEREVISIAE для Pt (II) и Pd (II) 15, и хлореллы вульгарным для Au (III) и U (VI), 16 17. Связывание предыдущих металлов, таких как Au (III), Pd (II) и Pt (II), также сообщалось для Desulfovibrio desulfuricans 18 и для L. sphaericus JG-B53 19,20. Тем не менее, не альл микробы связать большое количество металлов и их применение в качестве материала сорбционной ограничено 12,21. Кроме того, связывающая способность металла зависит от различных параметров, например, состав ячейки, используется био-компонентов, или окружающей среды и экспериментальных условиях (рН, ионной силы, температуры и т.д.). Изучение отдельных фрагментов клеточной стенки 22,23, как мембранных липидов, белков пептидогликана, или других компонентов, помогает понять процессы комплекс, построенный целых клеток 8,21 связывания металла.
Компоненты клеточных сосредоточены на в этом исследовании, S-слой белков. S-слоя белков являются частями внешней клеточной оболочки многих бактерий и архебактерий, и они составляют около 15 – 20% от общей массы белка этих организмов. В качестве первого интерфейса для окружающей среды, эти клеточные соединения сильно влияют на бактериальные сорбционными свойствами 3. S-слоя белков с молекулярными массами в пределах от сорокадо сотен кДа производятся внутри клетки, но собраны пределами, где они способны образовывать слои на липидные мембраны или полимерных компонентов клеточной стенки. После выделения, почти все S-слой белки имеют внутреннее свойство спонтанно самоорганизуются в суспензии, на границах или на поверхностях, образующих плоские или трубчатые структуры, подобные 3. Толщина белка монослоя зависит от бактерий и находится в пределах диапазона от 5 – 25 нм 24. В общем, образованные белковые структуры S-слой может иметь косой (Р1, Р2), квадрат (Р4), или шестиугольной (P3 и P6) симметрии с постоянной решетки от 2,5 до 35 нм 3,24. Формирование решетки, кажется, во многих случаях в зависимости от двухвалентных катионов и в основном на Ca 2+ 25,26, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). Тем не менее, полное реакция каскад мономера складывания, мономер-мономер взаимодействия, формирование решетки, и роли различных металлов, особенно двухвалентных катионов, таких как Са 2+ и Mg 2+, до сих пор полностью не поняты.
Грамм-положительные штамм L. sphaericus JG-B53 (переименован из Bacillus sphaericus после нового филогенетического классификации) 27 был выделен из уранового отвал "Хаберланд" (Johanngeorgenstadt, Саксония, Германия) 4,28,29. Его функциональное S-слоя белков (SLP1) обладает квадратную решетку, молекулярную массу 116 кДа, 30 и толщину ≈ 10 нм на живые клетки бактерий 31. В предыдущих исследованиях, формирование в пробирке закрытом и стабильного слоя белка с толщиной приблизительно 10 нм было достигнуто менее чем за 10 мин 19. Соответствующее штамма L. sphaericus JG-А12, также изолят от "Хаберланд" кучи, обладает высокой металлические обязательные потенциала и его изолированный белок S-слой показал высокую химическую и механическую стабильность и хорошие темпы сорбции на драгоценные металлы, как Au (III) Pt (II) и Pd (II) 4,32,33. Эта привязка драгоценных металлов является более или менее специфичные для некоторых металлов и зависит от наличия функциональных групп на наружной и внутренней поверхности белка полимера и в его поры, ионной силы и рН. Соответствующие функциональные группы для обработки металлов взаимодействия по белков являются COOH-, NH 2 -, ОН, ПО 4 -, SO 4 – и SO-. В принципе, связывание металлов мощности открыть широкий спектр применений, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). например, как biosorptive компоненты для удаления или восстановлениярастворенных токсичных или ценных металлов, шаблоны для синтеза или определенной осаждения регулярно структурированных металлических наночастиц (NPS) для катализа и других био-инженерии материалов, таких как био-сенсорная слоев 3,5,18,33. Регулярно расположенные массивы NP как Au (0) -NPs могут быть использованы для основных приложений, начиная от молекулярной электроники и биосенсоров, сверхвысоких устройств хранения плотность, и катализаторов для окисления СО-34-37. Разработка таких приложений и смарт-дизайн этих материалов требует глубокого понимания основных металлических обязательных механизмов.
Необходимым условием для развития таких био-материалов на основе является надежным реализация интерфейса слой между биомолекулы и технического поверхности 38,39. Например, полиэлектролиты собран с слой за слоем (LBL) 40,41 техники были использованы в качестве интерфейса слоя для перекристаллизации S-слоя белков 39 </SUP>. Такой интерфейс предлагает относительно легкий путь, чтобы выполнить белка покрытие воспроизводимым и количественно. Выполняя различные эксперименты с и без модификации с клеем промоутеров, это можно сделать заявления относительно покрытия кинетики, стабильность слой и взаимодействие металлов с биомолекул 19,42, Рафф, J. и др. S-слой на основе нанокомпозитов для промышленного применения в основе белка Engineered наноструктур. (ред Тияна З. Роща & Aitziber Л. Cortajarena) (Спрингер, 2016 (представлен)). Тем не менее, сложный механизм адсорбции белка и белка поверхности взаимодействия не изучены. Особенно информация о конформации, ориентации потоков, и плотности покрытия по-прежнему отсутствует.
Пьезокварцевые с мониторингом диссипации (QCM-D) техника привлекла внимание в последние годы в качестве инструмента для изучения адсорбции белка, покрытие кинетики и взаимодействия PROпроцессов на нанометровом масштабе 19,43-45. Этот метод позволяет для детального обнаружения массового адсорбции в режиме реального времени, и может быть использовано в качестве индикатора белка самосборки процесса и сочетания функциональных молекул белка на решетках 19,20,42,46-48. Кроме того, QCM-D измерения открыть возможность для изучения процессов взаимодействия металла с белковым слоем в естественных биологических условиях. В недавнем исследовании, взаимодействие белка S-слоя с выбранными металлов, таких как Eu (III), Аи (III), Pd (II) и Pt (II), был изучен с МККМ-D 19,20. Слой адсорбированный белок может служить в качестве упрощенной модели клеточной стенки грамположительных бактерий. Изучение этого одного компонента может способствовать более глубокому пониманию взаимодействия металл. Тем не менее, исключительно QCM-D эксперименты не позволяют заявления о поверхностных структур и влияния металлов в белок. Другие методы, необходимые для получения такой информации. Один посность для визуализации биологических наноструктур и получения информации о структурных свойств атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Целью представленной работы было изучение сорбции золота (Au (III) и Au (0) -NPs) для S-слоя белков, в частности SLP1 Л. sphaericus JG-B53. Эксперименты проводились со взвешенными белков на пакетном масштабе в диапазоне рН от 2,0 – 5,0 с помощью ICP-MS и с иммобилизованными S-слоев с помощью QCM-D. Кроме того, влияние раствора соли металла на устойчивость решетки была исследована с последующими исследованиями АСМ. Сочетание этих методов способствует лучшему пониманию процессов пробирке взаимодействия металл в качестве инструмента для получения дополнительной информации о связывании события на целых бактериальных клеток в отношении конкретных металлических сродства. Это знание не только решающее значение для развития действующих фильтрующих материалов для восстановления металлов для защиты окружающей среды и сохранения реисточники 49, но также для развития массивов высоко упорядоченных металлических наночастиц для различных технических приложений.
В этой работе изучали связывание АС S-слоя белков была исследована с использованием комбинации различных аналитических методов. В частности, связывание Au является очень привлекательным не только для восстановления золота из шахтных вод или технологических решений, но и для строитель?…
The authors have nothing to disclose.
Настоящая работа была частично финансируется IGF-проекта «С-Сито" (490 ZBG / 1), финансируемой BMWi и BMBF-проекта "Aptasens" (BMBF / DLR 01RB0805A). Особая благодарность Тобиас Дж Гюнтер для его ценную помощь во время АСМ исследований и Эрик Джонстон В. за чтение рукописи, как носителем английского языка. Кроме того, автор этой статьи хотелось бы поблагодарить Алине Риттер и Sabrina Gurlit (от Института экологии ресурсов для помощи в измерениях ICP-MS), Маня Фогель, Нэнси Унгер, Карен Е. Viacava и группа биотехнологии Гельмгольца-Института Фрайберг для Технология ресурсов.
equiment and software | |||
Bioreactor, Steam In Place 70L Pilot System | Applikon Biotechnology, Netherlands | Z6X | Including dO2, pH sensors of Applikon Biotechnology and BioXpert software V2 |
Noninvasive Biomass Monitor BugEye 2100 | BugLab, Concord (CA), USA | Z9X | — |
Spectrometer Ultrospec 1000 | Amersham Pharmacia Biotech, Great Britain | 80-2109-10 | Company now GE Healthcare Life Sciences |
MiniStar micro centrifuge | VWR, Germany | 521-2844 | For centrifugation of cultivation samples |
Research system microscope BX-61 | Olympus Germany LLC, Germany | 037006 | Microscope in combination with imaging software |
Cell^P (version 3.1) | Olympus Soft Imaging Solutions LLC, Münster, Germany | — | together with microscope |
Powerfuge Pilot Separation System Serie 9010-S | Carr Centritech, Florida, USA | 9010PLT | For biomasse harvesting |
T18 basic Ultra Turrax | IKA Labortechnik, Germany | 431-2601 | For flagella removal and sample homogenization |
Sorvall Evolution RC Superspeed Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, USA | 728411 | Used within protein isolation |
Mobile high shear fluid processor, M-110EH-30 Pilot | Microfluidics, Massachusetts, USA | M110EH30K | Used for cell rupture |
Alpha 1-4 LSC Freeze dryer | Martin Christ Freeze dryers LLC, Osterode, Germany | 102041 | — |
UV-VIS spectrophotometry (NanoDrop 2000c) | Thermo Fisher Scientific, USA | 91-ND-2000C-L | For determination of protein concentration |
Mini-PROTEAN vertical electrophoresis chamber | Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany | 165-3322 | For SDS-PAGE |
VersaDoc Imaging System 3000 | Bio-Rad Laboratories GmbH, Munich, Germany | 1708030 | Used for imaging of SDS-PAGE gels |
ICP-MS Elan 9000 | PerkinElmer, Waltham (MA), USA | N8120536 | For determination of metal concentration |
Zetasizer Nano ZS | Malvern Instruments, Worcestershire United Kingdom | ZEN3600 | For determination of nanoparticle size |
Q-Sense E4 device | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-E4 | ordered via LOT quantum design (software included with E4 platform) |
Q-Soft 401 (data recording) | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | ||
Q-Tools 3 (data evaluation and modelling) | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | ||
QCM-D flow modules QFM 401 | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-QFM401 | ordered via LOT quantum design |
QSX 303 SiO2 piezoelectric AT-cut quartz sensors | Q-Sense AB, Gothenburg, Sweden | QS-QSX303 | ordered via LOT quantum design |
Ozone cleaning chamber | Bioforce Nanoscience, Ames (IA), USA | QS-ESA006 | ordered via LOT quantum design |
Atomic Force Microscope MFP-3D Bio AFM | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | MFP-3DBio | AFM measurements and imaging software |
Asylum Research AFM Software AR Version 120804+1223 | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | — | imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio |
Igor Version Pro 6.3.2.3 Software | WaveMetrics, Inc., USA | — | imaging software included in Cat. No. MFP-3DBio |
BioHeater | Asylum Research, Santa Barbara (CA), USA | Bioheater | Sample heater for AFM measurements |
Biolever mini cantilever, BL-AC40TS-C2 | Olympus Germany LLC, Germany | BL-AC40TS-C2 | Prefered cantilever for AFM measurements |
WSxM 5.0 Develop 6.5 (2013) | Nanotec Electronica S.L. , Spain | freeware | Software for AFM analysis |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Detergents and other equiment | |||
Calcium chloride Dihydrate (CaCl2 ∙ 2H2O) | Merck KGaA | 1.02382 | — |
acidic acid, 100 %, p.A. | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3738.5 | Danger, flammable and corrosive liquid and vapour. Causes severe skin burns and eye damage. |
Antifoam 204 | Sigma-Aldrich Co. LLC. | A6426 | For foam suppression |
bromophenol blue, sodium salt | Sigma-Aldrich Co. LLC. | B5525 | — |
Coomassie Brilliant Blue R (C45H44N3NaO7S2) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3862.1 | — |
Deoxyribonuclease II from porcine spleen | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D4138 | Typ IV , 2,000-6,000 Kunitz units/mg protein |
Ethanol, 95% | VWR, Germany | 20827.467 | Danger, flammable |
glycerine, p.A. | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3783.1 | — |
Gold(III) chloride trihydrate (HAuCl4 ∙ 3H2O) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 520918 | Danger |
Guanidine hydrochloride (GuHCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 0037.1 | — |
Hellmanex III | Hellma GmbH & Co. KG | 9-307-011-4-507 | — |
Hydrochloric acid (HCl) (37%) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 4625.2 | Danger; Corrosive, used for pH adjustment |
Lysozyme from chicken egg white | Sigma-Aldrich Co. LLC. | L6876 | Lyophilized powder, protein =90 %, =40,000 units/mg protein (Sigma) |
Magnesium chloride Hexahydrate (MgCl2 ∙ 6H2O) | Merck KGaA | 1.05833 | — |
Magnetic stirrer with heating, MR 3000K | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Germany | 504.10100.00 | Standard stirrer within experiment |
NB-Media DM180 | Mast Diagnostica GmbH | 121800 | — |
Nitric acid (HNO3) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | HN50.1 | Danger; Oxidizing, Corrosing |
PageRuler Unstained Protein Ladder | ThermoScientific-Pierce | 26614 | — |
Poly(sodium 4-styrenesulfonat) (PSS) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 243051 | Average Mw ~70,000 |
Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 408727 | Warning; Harmful, Irritant, Dangerous for the environment; average Mw ~25,000 |
Potassium carbonate anhydrous (K2CO3) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 60108 | Warning; Harmful |
Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R5503 | Type I-AS, 50-100 Kunitz units/mg protein |
Sodium azide (NaN3) | Merck KGaA | 106688 | Danger; very toxic and Dangerous for the environment |
Sodium chloride (NaCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3957.2 | — |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | L-5750 | Danger; toxic |
Sodium hydroxide (NaOH) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 6771.1 | Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation and pH adjustment |
Spectra/Por 6, Dialysis membrane, MWCO 50,000 | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 1893.1 | — |
Sulfuric acid (H2SO4) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | HN52.2 | Danger; Corrosive, used for pH regulation within cultivation |
Tannic acid (C76H52O46) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 16201 | — |
TRIS HCl (C4H11NO3HCl) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 9090.2 | — |
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 ∙ 2H2O) | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3580.2 | — |
Triton X-100 | CARL ROTH GmbH+CO.KG | 3051.3 | Warning; Harmful, Dangerous for the environment |
VIVASPIN 500, 50.000 MWCO Ultrafiltration tubes | Sartorius AG | VS0132 | — |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich Co. LLC. | M6250 | Danger, toxic |