Introduction
Il pesce zebra (Danio rerio) è un preminente animale da laboratorio utilizzato in un numero crescente di discipline scientifiche, compreso ma non limitato alla genetica dello sviluppo, la tossicologia, il comportamento, l'acquacoltura, la biologia rigenerativa, e la modellazione di molte malattie umane 1 - 5. Anche se la specie è relativamente facile da mantenere in laboratorio, ci sono una serie di problemi di gestione associati con la loro cultura 6. Il più importante di questi è allevamento larvale, soprattutto quando il pesce prima comincia ad alimentare a seguito di inflazione della vescica gas 7. In normali, condizioni controllate, questo evento si verifica dello sviluppo a ~ 5 giorni dopo la fecondazione (DPF), con i seguenti 3 - 5 giorni di crescita particolarmente critici 7. La difficoltà tecnica centrale durante questa fase è quello di soddisfare adeguatamente le esigenze nutrizionali della prima larve alimentazione - articoli mangimi devono essere di dimensioni appropriate, Digestible, attraente, e disponibile su una base quasi continuo, senza creare eccessivi sprechi in vasche di coltura. Storicamente questo è stato realizzato tipicamente fornendo numerose piccole quantità di mangime per pesci in vasche, insieme con 8,9 scambio dell'acqua routine. Mentre questi metodi sono in una certa misura di successo, sono inefficienti, richiedono ingressi del lavoro elevati, e restituiscono solo variabili e tassi limitati di crescita e la sopravvivenza 10.
In natura, le larve si nutrono di pesce zebra presumibilmente abbondante piccolo zooplancton presente nella colonna d'acqua 11. Per questo motivo, i protocolli larviculture che incorporano i feed live come Paramecium, rotiferi, Artemia e sono in genere più efficiente 7. Nel 2010, le migliori e co-autori hanno dimostrato che era possibile coltivare zebrafish larvale in acqua salmastra statica con rotiferi acqua salata per i primi 5 giorni di alimentazione esogena 12. Questo approccio, che sfruttarees l'elevata produttività naturale delle culture di rotiferi a fornire ampio, preda altamente nutrienti senza inquinare l'acqua, rendimenti molto elevati tassi di crescita delle larve e la sopravvivenza con il contributo di lavoro basso 12,13. Negli ultimi anni, un numero crescente di laboratori di tutto il mondo hanno adottato varianti di questo protocollo, e molti sono ora coltura rotiferi in modo continuo per supportare i sistemi vivaio 14.
Nel corso degli ultimi anni, sia per i metodi di rotiferi / policoltura zebrafish e la produzione rotiferi sono stati raffinati e migliorato per diventare più standardizzati e facilmente scalabile. Questo articolo fornisce istruzioni passo-passo per 1) la produzione rotiferi continuo e robusto e 2) l'istituzione del / sistema di policoltura zebrafish rotifero utilizzato per sostenere una crescita robusta dei pesci per i primi 5 giorni di alimentazione esogena.
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Protocol
1. Rotifer Cultura
- I componenti di base di un sistema di coltura utilizzando un Vessel 100 L Cultura
- Raccogliere tutti i componenti per l'installazione coltura di rotiferi. La configurazione coltura di rotiferi è costituito da un recipiente di coltura (CV) a crescere i rotiferi; una nave simile a mantenere rotiferi feedout (feedout vaso cultura, FCV); un vaso a fondo tondo cova (feed Reservoir, FR) per la conservazione della miscela di alimentazione alghe (AFM); una riserva d'aria (AS) per aerare il CV, FCV e la FR; una pompa peristaltica con un temporizzatore di dosaggio (PMT) per controllare la consegna dei mangimi alghe nel CV e FCV; e un filtro antiparticolato filo (FPF) che si trova all'interno del curriculum.
NOTA: L'elenco completo delle forniture e dei componenti è previsto nella lista dei materiali.
- Raccogliere tutti i componenti per l'installazione coltura di rotiferi. La configurazione coltura di rotiferi è costituito da un recipiente di coltura (CV) a crescere i rotiferi; una nave simile a mantenere rotiferi feedout (feedout vaso cultura, FCV); un vaso a fondo tondo cova (feed Reservoir, FR) per la conservazione della miscela di alimentazione alghe (AFM); una riserva d'aria (AS) per aerare il CV, FCV e la FR; una pompa peristaltica con un temporizzatore di dosaggio (PMT) per controllare la consegna dei mangimi alghe nel CV e FCV; e un filtro antiparticolato filo (FPF) che si trova all'interno del curriculum.
- Configurazione
- Elevare il CV e FCV su un supporto o un tavolo in modo che le culture possono essere facilmente raccolte tramite uno scarico montaggio in un cont collezioneAiner (Figura 1). Utilizzare tubi flessibili di alimentazione dell'aria per collegare i AS ad una lunghezza di tubo rigido in ciascun recipiente di coltura. Assicurarsi che il tubo è abbastanza lungo per fornire aria al fondo del CV o FCV.
- Utilizzare una linea di aria piccola capacità per collegare gli AS ad una lunghezza di tubo rigido che si estende fino al fondo della FR che contiene l'AFM. Installare una valvola in ciascuna linea d'aria per regolare il flusso d'aria. Collegare il FR alla PMT con tubo di erogazione mangime, ed eseguire il tubo dalla PMT in un foro nel lato del CV / FCV, vicino alla parte superiore. Figura 1.
- Avviare
- Riempire il recipiente di coltura al 90% del volume disponibile con osmosi inversa (RO). Se RO non è disponibile, utilizzare acqua pulita e comunale senza cloro; tuttavia, una valutazione del rischio biosicurezza deve essere eseguita per garantire che nessun microrganismi potenzialmente patogeni sono presenti in acqua di fonte. NOTA: Tale analisi può essere effettuatada qualsiasi laboratorio di prova d'acqua qualificato.
- Dosare l'acqua recipiente di coltura con sale acquario per raggiungere una salinità di 15 g / L. Impostare il flusso d'aria nel recipiente in modo che mantenga una "bollire rolling", e quindi aggiungere lentamente la quantità misurata di sale al recipiente di coltura fino a completa dissoluzione della aerazione. Continuare aerare l'acqua per> 1 ora per assicurarsi che sia completamente ossigenato.
- Rendere la miscela di alimentazione alghe. Per 3 L di pulito, dechlorinated fresco (0 ppm) acqua aggiungere 100 g di NaHCO3 e 100 g di ammoniaca neutralizzatore (hydroxymethylsulfonate sodio). Questo ultimo reagente offre l'ulteriore vantaggio di neutralizzare qualsiasi cloro residuo da acqua di rubinetto o candeggina residui di sanificazione delle apparecchiature cultura. E 'fondamentale per garantire che questi composti sono completamente sciolti. Poi aggiungere 1 L di alghe concentrato (biomassa peso secco ~ 15%). Aggiungere la miscela di alimentazione per la FR e conservare a 4 ° C.
- Aggiungere una cultura antipasto di 5-10.000.000
- Accendere il PMT e iniziare a pompare il feed alghe nel vaso coltura di rotiferi. Utilizzando la funzione timer del PMT, impostare la portata di miscela di alimentazione alghe in modo che ~ 1,6 ml di miscela di alimentazione alghe viene consegnato per milione di rotiferi nella cultura, al giorno. Distribuire le alimentazioni in piccole porzioni a intervalli regolari nel corso di un periodo di 24 ore; la più frequente delle alimentazioni, meglio è.
- Calibrare la portata della pompa agendo manualmente sulla PMT per un determinato periodo (ad esempio, 1 min) e raccogliere le alghe che esso pompa durante questo intervallo in un cilindro o cilindro graduato. Ad esempio, se le dosi PMT 5 ml di alghe in 1 min, quindi la dose sarebbe5 ml alghe / min.
- Calcolare il tasso di alimentazione giornaliera richiesta moltiplicando il numero di rotiferi presenti, in milioni, di 1,6 ml. Ad esempio, una cultura rotifero con una dimensione della popolazione di 100 milioni di rotiferi richiederebbe ~ 160 ml di mangime al giorno (100 x 1,6 ml).
- Impostare la PMT per dosare il fabbisogno alimentare giornaliero totale a intervalli regolari durante un periodo di 24 ore. Ad esempio, la consegna di una quantità di trasporto giornaliera totale di 160 ml potrebbe essere consegnato in porzioni volta ogni 3 ore in un periodo di 24 ore utilizzando una serie PMT con un tasso pompa dosatrice di 5 ml / min per 4 min, 8 volte al giorno (5 ml / min x 4 = numero minimo di 20 ml x 8 poppate = 160 ml).
- Lasciare che la cultura a crescere fino a che non genera la popolazione richiesta, di solito per 48-72 ore, prima della raccolta. A 24 ore dopo l'avvio, aggiungere i filtri antiparticolato filo interdentale al recipiente di coltura ed iniziare la normale manutenzione.
- Manutenzione
NOTA: La cultura funziona su base continua e richiede routine manutenzione che idealmente dovrebbe essere eseguita alla stessa ora ogni giorno, nella seguente sequenza.- Riempire la FCV al 90% del volume disponibile con pulito, senza cloro acqua dolce, dosata con 10 g / L di sali acquario. Assicurarsi che l'acqua è ben miscelati, e che tutto il sale è completamente dissolto. Impostare il flusso d'aria nel recipiente in modo che mantenga una "bollore". Misurare la salinità con un rifrattometro e garantire che la salinità è di 10 g / L. E 'fondamentale per raggiungere questo obiettivo e di non superarla.
- Assaggiate i rotiferi del CV: Assicurarsi che la cultura è ben miscelato, quindi raccogliere 3 campioni di 2-3 ml con una pipetta di trasferimento o autopipettor, provenienti da diverse parti della cultura. Combinare questi campioni in un tubo o fiala di dimensione conveniente (ad esempio, 10 ml).
- Transfer 1 - 2 ml del campione combinato su una capsula di Petri in modo che possa essere visualizzato sotto un microscopio da dissezione. Controllare la qualità della cultura (nuoto comportamentorotiferi, presenza di uova staccati, contaminando protozoi).
- Immobilizzare il rotiferi del campione combinato restante aggiungendo 100 ml di 50% soluzione di iodio Lugol al campione. In pochi secondi dopo l'aggiunta dei Lugol, osservare i rotiferi per fermare il nuoto. Ora, facilmente contare i rotiferi.
NOTA: L'etanolo, candeggina diluita, o aceto possono essere utilizzati al posto di Lugol. Aceto (2 gocce / 10 ml) ha il vantaggio di essere non pericolosi, senza perdere forza nella memoria come soluzioni di lavaggio e di iodio può, e non fare il contratto rotiferi, così la corona delle ciglia e il "piede" rimanere estesa e la animali aspetto più naturale. - Assicurarsi che il campione è ben miscelato (rotiferi immobilizzate si depositano rapidamente), poi prendere rapidamente un ml sottocampione ~ 2 in una pipetta di plastica e dispensare 1 ml in una diapositiva che conta Sedgewick-Rafter (20 x 50 1 mm quadrati) (Figura 2 ). Utilizzando un microscopio da dissezione o composto, contare i rotiferi intatti e il tNumero otale di uova attaccate a queste rotiferi (Figura 2). Conte come gran parte della zona diapositiva come necessario contare ~ 100 rotiferi. Calcolare il numero di rotiferi per ml, e registrare questo in un foglio di calcolo o giornale di bordo.
- Harvest ~ 30% del volume dei rotiferi nel CV: Rimuovere l'alimentazione dell'aria e filtro filo, aprire lentamente la valvola sul fondo del CV e permettere all'acqua di fluire in un collettore di plancton con uno schermo di maglia 53 micron. Raccogliere l'acqua che scorre fuori dal fondo del collettore dopo il filtraggio in un secchio o scarico. Utilizzare un dolce a moderato flusso per evitare di danneggiare i rotiferi. Non permettere che i rotiferi asciugare sullo schermo.
- Per motivi di coerenza, è opportuno stabilire il FCV con un numero standard di rotiferi ogni giorno. Pertanto, sulla base del noto volume di CV densità rotifero e il raccolto, regolare il volume totale FCV per ottenere una densità finale coerente (ad es., 1.500 rotiferi / ml). Aggiungere il roti raccoltofers al FCV: trasferire delicatamente i rotiferi dallo schermo raccolta utilizzando una bottiglia di lavaggio riempita con acqua salata pulita (10-15 g / l). Capovolgere lo schermo sopra la FCV e lavare i rotiferi in FCV con una leggera corrente di acqua salata. Avviare la PMT per fornire alimentazione (~ 1,57 ml per milione di rotiferi al giorno) per il FCV.
- Scrub l'intero all'interno del CV con una spazzola di nylon morbido e pulito o pad macchia.
- Preparare una nuova miscela di 15 g di acqua / L aggiungendo la quantità appropriata di sale ad una quantità misurata di acqua pulita RO in un secchio da 5 galloni per sostituire il volume di acqua persa per raccogliere. Aggiungere il sale all'acqua nel secchio e mescolare vigorosamente fino a completa dissoluzione, e quindi aggiungere al CV.
- Usando uno spray ad alta pressione in un lavandino, lavare il filtro filo fino a quando è libero di detriti, e poi tornare al CV.
- Regolare velocità di avanzamento di alghe consegnato al CV cambiando la durata di ogni evento di dosaggio, in base al conteggio giornaliero di rotiferi / ml.Utilizzare i calcoli forniti al punto 1.3.8, al di sopra di determinare la giusta quantità di mangime da consegnare.
- Circa 24 ore dopo, ripetere il processo. Avviare raccogliendo i rotiferi rimanenti nel FCV (che non erano necessari per il giorno precedente) nello stesso modo precedentemente descritto (punti 1.4.2 - 1.4.10). Concentrarli in 2 litri di acqua fresca e pulita senza cloro (5 g / l di sale). Questi possono essere conservati a 4 ° C come alimentazione di riserva, o utilizzati per alimentare le fasi successive di pesce, al di là di quanto descritto in questo protocollo.
NOTA: Questo protocollo permette fino a 2 - 3 giorni di ridotta manutenzione cultura (con alimentazione automatica normale), perché i rotiferi nel curriculum può tollerare l'omissione dei raccolti senza gravi conseguenze.
2. Policoltura
- Impostare
- Raccogliere embrioni di zebrafish da un evento di deposizione delle uova versando embrioni generati attraverso un colino da tè e poi risciacquare delicatamente con fis sterilih di acqua (o di qualsiasi altra fonte non contaminata della soluzione opportunamente condizionata, ad esempio, di media embrione, E3, etc.) da un flacone di lavaggio in capsule di Petri.
- Incubare gli embrioni a 25 - 28 ° C in piastre Petri ad una densità di 40 - 50 embrioni per piastra per 5 giorni.
- Iniziare la fase polyculture il giorno 5 dopo la fecondazione, o quando più del 90% delle larve schiuse attivamente nuotando nella colonna d'acqua.
- Inoculazione
- Aggiungere 500 ml di coltura di rotiferi direttamente dal FCV ad un serbatoio vivaio 3,5 L; inclusione di acqua coltura di rotiferi prevede algale che mantiene il contenuto nutrizionale dei rotiferi durante policoltura.
- Delicatamente versare le larve da una capsula di Petri nel serbatoio vivaio. Assicurarsi che nessun larve rimangono nel piatto.
- Aggiungere 500 ml di acqua pulita e pesci condizionata da un sistema di ricircolo o fonte d'acqua dedicata al serbatoio per raggiungere un volume finale di 1 litro e il s finalealinity di 5 g / L.
NOTA: Questo salinità è fondamentale perché la sopravvivenza delle larve zebrafish sarà influenzato negativamente se la salinità è> 7 g / L e di sopravvivenza rotiferi sarà influenzato negativamente se la salinità <2 g / l.
- Fase policoltura
NOTA: La fase di policoltura dovrebbe durare per un massimo di 4 giorni post-inoculazione (per un totale di 5 giorni, corrispondenti a 5-9 giorni dopo la fecondazione).- Osservare il serbatoio policoltura almeno una volta al giorno durante questo periodo per assicurare che rotiferi e pesce sono presenti e in crescita. Assicurarsi che i rotiferi sono visibili in tutta la colonna d'acqua. Assicurarsi che i le fishs sono visibili anche all'interno della colonna d'acqua, nuotando tra i rotiferi.
- Inizia flusso d'acqua normale attraverso il serbatoio. Posizionare uno schermo o deflettore attraverso la porta di scarico per garantire che le larve non vengono trasferite dal serbatoio.
NOTA: Al termine di questa fase, i pesci saranno abbastanza grande da consumare prede più grandi come Artemiaelementi del feed naupli o trasformati nella gamma di dimensioni di 75-125 micron.
NOTA: Le dinamiche demografiche rotifero all'interno di un serbatoio di polyculture rappresentante sono stati misurati mediante campionamento / conteggio rotiferi dal serbatoio allo stesso modo come descritto ai punti 1.4.2 - 1.4.5. Ciò è stato fatto una volta al giorno a partire dall'inizio della fase polyculture finché fu completata.
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Representative Results
Il sistema di coltura di rotiferi continua qui descritta è dinamico, ed è normale per i numeri di rotiferi a fluttuare in misura limitata nel tempo se ci sono variazioni nei tassi di alimentazione e di raccolta giornaliera. La popolazione dei rotiferi in una delle culture attive nei servizi di acquacoltura Hospital Boston bambini, mantenuto nel modo sopra descritto, è stata monitorata per 30 giorni (Figura 3). La densità di cultura media durante questo periodo è stato 932 rotiferi / ml, con un massimo di 1.330 rotiferi / ml e un minimo di 510 rotiferi / ml. Questo rappresenta le prestazioni tipiche di una cultura rotiferi mantenuto in conformità del presente protocollo.
La dinamica della popolazione rotiferi in un serbatoio polyculture con zebrafish è illustrato nella figura 4. A 3,5 L serbatoio di pesce è stato inoculato con 500 ml di coltura di rotiferi dal FCV, 500 ml di f sterilizzatoacqua ish, e 40 di 5 giorni old wild-type (ceppo Tubinga) larve, per dimostrare come rotiferi e zebrafish si esibiscono in un tipico carro armato policoltura. La popolazione rotifer nel serbatoio polyculture picco il secondo giorno con una densità di 747 rotiferi / ml (Figura 4). La densità dei rotiferi nel serbatoio polyculture calata nel periodo policoltura 5 giorni ad un minimo di 481 rotiferi / ml il giorno 5. Tuttavia, la densità rotifero medio per tutto il periodo era 589.4 rotiferi / ml, e il valore minimo di 481 rotiferi / ml è ~ 10 volte quella della densità di rotiferi alla fine del periodo di policoltura a lavori precedentemente pubblicati 12.
Crescita Zebrafish durante il periodo di cinque giorni è mostrato in Figura 5. Il pesce ha mostrato una crescita costante ogni giorno, da una lunghezza totale medio di 3.904 mm ± 0,063 SEM quando sono stati aggiunti al serbatoio policoltura ad una lunghezza totale medio di 5.423 ± 0,063 SEM in datal'ultimo giorno della fase di policoltura. La sopravvivenza è stata del 95% (38/40).
Parametri di qualità dell'acqua sono stati misurati giornalmente nel serbatoio policoltura rappresentante, e sono mostrati in Tabella 1. I valori di questi parametri sono simili a lavori precedentemente pubblicati 12, e rappresentano condizioni favorevoli per la crescita e la sopravvivenza di entrambi i rotiferi e il pesce durante il periodo di 5 giorni della policoltura.
| Giorno | Giorno | Salinità | TAN | NO 2 | NO 3 | pH | Alcalinità | Durezza | Temperatura |
| (Actual) | (post-fecondazione) | g / L | mg / L | mg / L | mg / L | mg / l (CaCO3) | mg / l (CaCO3) | ° C </ td> | |
| Lunedi | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| martedì | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| mercoledì | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| giovedì | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| Venerdì | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabella 1. Parametri di acqua di qualità ina Rappresentante Zebrafish Polyculture Tank.
Figura 1. Rotifer Cultura Setup Legenda:. Cultura Vessel (CV), Feedout Cultura Vessel (FCV), Air Supply (AS), Floss filtro antiparticolato (FPF), alghe alimentazione miscela (AFM), feed Reservoir (FR), misurazione programmabile Timer (PMT). Le linee continue rappresentano distribuzione con alimentazione alghe. Le linee tratteggiate rappresentano mandata aria. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Riempimento di una diapositiva conteggio Sedgewick-Rafter. Cliccate qui per visualizzare unversione più grande di questa figura.
. Figura 3. rotiferi dinamica di popolazioni in cultura in un periodo di 30 giorni Legenda: Il numero dei rotiferi contati (femmine + uova) per ml è in asse x. Il numero di giorni in cultura è sulla y. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. rotifer dinamica di popolazioni nel corso di una cinque giorni Polyculture Legenda:. Il numero di rotiferi contati (femmine + uova) per ml è in asse x. Il numero di giorni in policoltura è sulla y. Clicca qui a view una versione più grande di questa figura.
. Figura 5. Zebrafish crescita nel corso di una cinque giorni Polyculture Legenda: I valori sono lunghezza totale media in mm; le barre di errore rappresentano l'errore standard della media (SEM). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La corretta attuazione del metodo policoltura rotiferi per l'alimentazione precoce zebrafish larvale richiede protocolli efficaci per due compiti: la creazione e il mantenimento di un sistema di coltura di rotiferi continuo a nutrire i pesci, e la coltura di prima alimentazione larve zebrafish con rotiferi nella stessa vasca.
La messa a punto di un sistema di produzione di acqua salata rotifero continua per i laboratori di zebrafish prima descritti da Lawrence e co-autori di 14 è stato modificato e migliorato in diversi modi per farlo sia più robusta ed universale nell'applicazione. Il nuovo protocollo incorpora miglioramenti sia nelle attrezzature e la metodologia.
Il sistema di stoccaggio per la miscela di alimentazione alghe oggi impiega cova vasi utilizzati nei sistemi di produzione di pesce gatto 15. Stoccaggio dei mangimi in questi vasi rotondi fondo facilita completa miscelazione dei mangimi alghe in modo che non stratificare o aggregano e portare a intasareGing di linee di mandata, un problema che spesso afflitto il protocollo originale. Analogamente, l'uso di una pompa / dosatori all-in-one timer programmabile riduce il numero totale di componenti, e semplifica l'erogazione dosata di alimentazione ai rotiferi. Permette inoltre il dosaggio dei mangimi per i rotiferi su base oraria per il periodo di 24 ore, che è preferibile a un minor numero, poppate più grandi perché l'alimentazione viene assimilato in modo più efficiente.
Un metodo per il conteggio rotiferi che consente la messa a punto di distribuzione con alimentazione alla cultura rotiferi è stato incluso in questo protocollo. Nutrire i rotiferi sulla base di una accurata valutazione in tempo reale della loro dimensione della popolazione assicura costante, la produzione di alto livello. Un secondario Feedout Cultura nave è stata anche aggiunta al protocollo. Un sistema di coltura continuo può produrre un eccesso quotidiana di decine di milioni di rotiferi al di là di ciò che è necessario anche per una grande operazione vivaio, a causa di variazioni nell'attività vivaio. Questo Feedout Culture vaso è utilizzato per contenere rotiferi per l'inoculazione quotidiano di policolture, e le restanti rotiferi può essere alimentato come un integratore alimentare di alta qualità per successivi stadi giovanili larvali e primi di pesce. La salinità ridotta (10 g / l) nel FCV anche pre-acclimates i rotiferi alle condizioni nei serbatoi policoltura, in modo da mantenere l'attività di nuoto vigorosa quando trasferiti.
È importante sottolineare che questi cambiamenti al rotiferi piombo protocollo coltura per dirigere miglioramenti nell'approccio policoltura, soprattutto per quanto riguarda l'apporto di manodopera. Il metodo precedente, pubblicato da Best e co-autori coinvolti non solo un inoculo iniziale di rotiferi a giorno 5, ma anche aggiunte giornaliere di rotiferi fino alla fase di policoltura statica è conclusa il giorno 9 12. Significa densità di rotiferi durante questo periodo ha raggiunto la posizione 333 rotiferi / ml il giorno di inoculazione e si è concluso sotto 50 rotiferi / ml al termine della fase di policoltura il giorno 9 12. Al contrario, L'attuale protocollo mantiene densità molto più alta in tutto, in genere a partire da ~ 665 rotiferi / ml, e termina con ~ 481 rotiferi / ml il giorno 9.
Ci sono due fattori che permettono queste densità rotifere molto più alte. 1) La robustezza complessiva della coltura di rotiferi utilizzato per l'inoculazione è molto maggiore. Inoltre, la fase riveduta inoculando la policoltura con volumi uguali di alghe / rotiferi a 10 g / L di salinità e ~ 0 g / l di acqua pesce salinità, si traduca in un salinità intermedio di 5 g / l che viene mantenuta per tutta policoltura. A partire da un maggior volume totale di acqua (1L) è anche più favorevole alla crescita rotiferi e la sopravvivenza nei serbatoi policoltura. Nel metodo precedentemente pubblicati, minori densità di rotiferi di partenza in un volume più piccolo necessitavano aggiunte quotidiane di rotiferi per reintegrare le perdite di attrito (presumibilmente a causa della scarsa qualità dell'acqua) e il consumo attraverso lo sviluppo di larve di pesci. I risultati di queste modifiche al protocollo Dramatcamente ridurre gli input di lavoro (uno di alimentazione oltre 4 giorni, rispetto a 4 alimentazioni in 4 giorni con il metodo precedente). Crescita delle larve e delle prestazioni sopravvivenza rispetto al periodo iniziale policoltura cinque giorni è paragonabile a quello pubblicato in precedenza 12.
La produttività di colture rotifere è necessariamente limitata dall'ingresso di alimentazione. Rotifer densità di 2.000 - 3.000 / ml possono essere ottenuti con questi metodi semplicemente aumentando la consegna di alimentazione. Quando rotifer resa per unità di alimentazione è noto, velocità di avanzamento può essere regolata per abbinare la produzione dei rotiferi ai bisogni previsti. Durante i fine settimana e nei giorni festivi, l'alimentazione può essere ridotta e raccolti omessi per un giorno o due senza danneggiare i rotiferi, anche se il loro potenziale produttivo sarà ottimale fino a quando la normale alimentazione quotidiana e raccogliere curricula di routine.
Quando vi è un bisogno imprevisto per ulteriori rotiferi del solito, una porzione più ampia della popolazione può essere raccolto senza danneggiare il culture, ma a seconda delle dimensioni del raccolto cultura può richiedere un giorno o più per recuperare la sua usuale densità. Se la domanda rotifer sarà ridotto per più di un giorno o due, la produzione è più ridotta riducendo la fornitura di alimentazione, anziché diminuire il raccolto. Un tasso di raccolta pari ad almeno il 25% / giorno mantiene un profilo di età più giovane rotifero in modo che i rotiferi sono più vigorosi e feconda, migliorare le loro prestazioni nei serbatoi policoltura.
Questo protocollo si adatta facilmente a scale più piccole per gli impianti più piccoli zebrafish. Ad esempio, una cultura 15 L, che può essere comodamente installato in una US 5 galloni (20 L) benna standard con mano alimentazione due volte al giorno, può facilmente ottenere una densità di 1.000 rotiferi / ml. L'uso di una pompa di alimentazione consente densità di 2000-3000 / ml. Un unico secchio raccolto al 30% / giorno può quindi fornire 5-15 milioni di rotiferi / giorno, abbastanza per iniziare a 10 - 30 policolture. Due secchi possono essere utilizzati nello stesso protocollo CV + FCV come descritto unbove. Un'alga + regolatore ammoniaca + pH del buffer di alimentazione pre-mix è disponibile (vedi Tabella di reagenti specifici / Equipment) che è conveniente per le applicazioni su piccola scala. Ha viscosità sufficiente che le cellule delle alghe non si depositano rapidamente e in modo che non richiede miscelazione continua nel serbatoio di alimentazione.
Se diminuisce la produttività coltura di rotiferi, o un insolito accumulo di rotiferi morti si trova nella cultura, tutti i parametri di qualità dell'acqua (temperatura, salinità, pH, NH 3 concentrazione) dovrebbero essere controllati. Plicatilis Brachionus normalmente trasporta le uova fino alla schiusa, e la presenza di molte uova separati (che di solito non si schiudono) nella cultura è un segno di stress, più spesso a causa di ammoniaca accumulato.
Se l'acqua coltura di rotiferi è un verde più intenso del solito, allora o la velocità di avanzamento è troppo alta o rotiferi non si consumano cibo a loro solita tariffa. Di solito questo è cautilizzato sia da un fattore di stress, o la cultura è stata overharvested senza regolare avanzamento in base alla popolazione ridotta. In colture dense è normale per una colorazione marrone accumulo di acqua come pigmenti algali sono metabolizzati dai rotiferi.
L'utilizzo di rotiferi acqua salata durante la prima fase di alimentazione è stata ampiamente adottata in tutta la comunità di ricerca zebrafish da quando il metodo è stato pubblicato nel 2010 12. Le modifiche apportate al metodo di policoltura di allevamento che sono descritte in questo protocollo consentiranno un numero ancora maggiore di laboratori di adottare questo approccio, indipendentemente dalla scala. Questi progressi sono tempestive; sviluppi nella tecnologia genetica eliminazione diretta (ad es., CRISPR, Talens, etc.) per zebrafish richiederà protocolli di allevamento semplificati ed efficienti per crescere migliaia di nuovi ceppi di pesci geneticamente modificati per l'utilizzo in vari campi della scienza.
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Disclosures
CE Henry è impiegato da Reed Maricoltura, Inc., una società che fornisce rotiferi, concentrati di alghe, e altre forniture ai mercati hobbysti di acquacoltura e di pesce.
Acknowledgments
La cura e l'uso di pesce generato per risultati rappresentativi descritti in questo protocollo è stata eseguita in piena conformità con le linee guida stabilite dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso Hospital di Boston dei bambini, protocollo # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
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- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
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- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
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- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
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- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
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