Introduction
Sebrafisk (Danio rerio) er en fremtredende forsøksdyr benyttet i stadig flere vitenskapelige disipliner, inkludert men ikke begrenset til utviklings genetikk, toksikologi, atferd, havbruk, regenerativ biologi, og modellering av mange menneskelige lidelser 1 - 5. Selv om arten er relativt lett å vedlikeholde i laboratoriet, er det en rekke administrative utfordringer knyttet til deres kultur 6. Den mest fremtredende av disse er larve stell, spesielt når fisken først begynner å mate etter at gassblæren inflasjon 7. Under normale, kontrollerte forhold, oppstår denne utviklings hendelsen på ~ 5 dager etter befruktning (DPF), med følgende 3 - 5 dager med vekst å være spesielt kritisk 7. Den sentrale tekniske problemer i denne fasen er å tilstrekkelig møte de ernæringsmessige kravene til den første fôring larver - fôr elementer må være riktig størrelse, Digesbare mellomlegg, attraktivt og tilgjengelig på en nesten kontinuerlig basis, uten å skape for mye avfall i dyrkingstanker. Historisk har dette blitt oppnådd for eksempel ved å levere mange små mengder av tilførsel til fisk i tanker, sammen med rutine vannutskifting 8,9. Selv om disse metodene er til en viss grad lykkes, de er ineffektive, krever innganger høye lønnskostnader, og returnere eneste variabelen og begrensede vekstrater og overlevelse 10.
I naturen sebrafisk larver antagelig lever av tallrike små dyreplankton til stede i vannsøylen 11. Av denne grunn, larviculture protokoller som inneholder liveopptak som paramecium, rotatorier og Artemia er vanligvis mest effektive 7. I 2010, Best og medforfattere viste at det var mulig å dyrke larvesebrafisk i statisk, brakkvann sammen med saltvanns rotatorier de første 5 dagene av eksogene fôring 12. Denne tilnærmingen, som selees naturlig høy produktivitet av rotatorier kulturer å gi god, svært næringsrik byttedyr uten å forurense vannet, utbytter svært høy forekomst av larve vekst og overlevelse med lav arbeidsinnsats 12,13. I de senere årene har et økende antall laboratorier rundt om i verden vedtatt varianter av denne protokollen, og mange er nå dyrkning rotatorier i en kontinuerlig måte å støtte barnehage systemer 14.
I løpet av de siste årene, har metoder for både rotatorier / sebrafisk polyculture og rotatorieproduksjon blitt videreutviklet og forbedret for å bli mer standardisert og lett skalerbar. Denne artikkelen gir trinnvise instruksjoner for en) kontinuerlig og robust rotatorieproduksjon og 2) etablering av rotatorie / sebrafisk polyculture systemet brukes til å støtte robust vekst av fisk for de første 5 dagene av eksogene fôring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rotatorie Culture
- Grunnleggende komponentene for en kultur System ved hjelp av en 100 L Kultur Vessel
- Samle alle komponentene for oppsettet rotatoriekulturen. Oppsettet rotatoriekulturen består av en kultur fartøy (CV) for å dyrke rotatorier; et tilsvarende fartøy for å opprettholde utmatingshodet rotatorier (utmatingshodet kultur fartøy, FCV); en rundbunnet klekking jar (feed Reservoir, FR) for lagring av de alger mateblandingen (AFM); en lufttilførsel (AS) for å lufte CV, FCV og FR; en peristaltisk pumpe med en måle timer (PMT) til å kontrollere levering av alger fôr inn i CV og FCV; og floss partikkelfilter (FPF) som sitter inne i CV.
MERK: En komplett liste over rekvisita og komponenter er gitt i Materials List.
- Samle alle komponentene for oppsettet rotatoriekulturen. Oppsettet rotatoriekulturen består av en kultur fartøy (CV) for å dyrke rotatorier; et tilsvarende fartøy for å opprettholde utmatingshodet rotatorier (utmatingshodet kultur fartøy, FCV); en rundbunnet klekking jar (feed Reservoir, FR) for lagring av de alger mateblandingen (AFM); en lufttilførsel (AS) for å lufte CV, FCV og FR; en peristaltisk pumpe med en måle timer (PMT) til å kontrollere levering av alger fôr inn i CV og FCV; og floss partikkelfilter (FPF) som sitter inne i CV.
- Konfigurasjon
- Heve CV og FCV på et stativ eller bord slik at kulturene kan lett bli høstet via et avløp passer inn i en samling fortsainer (figur 1). Bruk fleksibel lufttilførselsslangen for å koble AS til en lengde av et stivt rør i hver kultur kar. Sørg for at slangen er lang nok til å levere luft til bunnen av CV eller FCV.
- Bruk en liten kapasitet luftledningen for å koble AS til en lengde av et stivt rør som strekker seg til bunnen av FR som inneholder AFM. Installere en ventil i hver luftledningen for å regulere luftstrømmen. Koble FR til PMT med matingsrøret, og kjøre produksjonsrøret fra PMT inn i et boret hull i siden av CV / FCV, nær toppen. Figur 1.
- Oppstart
- Fyll kulturen fartøyet til 90% av det tilgjengelige volum med omvendt osmose (RO). Hvis RO ikke er tilgjengelig, kan du bruke rent, dechlorinated kommunalt vann; imidlertid må en biosikkerhet risikovurdering utføres for å sikre at ingen potensielt patogene organismer som er til stede i kilden vann. MERK: En slik analyse kan utføresetter noen kvalifiserte vann testlaboratorium.
- Dose dyrkningsbeholder med vann akvarium salt for å oppnå en salinitet på 15 g / l. Still luftstrømmen inn i karet, slik at den opprettholder en "rullende koke", og tilsett deretter langsomt den utmålte mengden av salt til kulturen fartøyet inntil den er fullstendig oppløst ved luftning. Fortsett å lufte vannet inne i> en time for å sikre at den er fullstendig oksygeninnhold.
- Gjør alger mateblandingen. Til 3 liter ren, deklorerte frisk (0 ppm) vann tilsettes 100 g NaHCO3 og 100 g ammoniakk nøytralisator (natrium hydroxymethylsulfonate). Denne siste reagent gir den ekstra fordelen av å nøytralisere eventuelle restklor fra vannkranen eller blekemiddel rester fra desinfiserende av kultur utstyr. Det er viktig å sikre at disse forbindelser er fullstendig oppløst. Deretter legger en L algekonsentrat (biomasse tørrvekt ~ 15%). Legg tilførselsblandingen til FR og oppbevares ved 4 ° C.
- Legg en startkultur av 5-10 millioner
- Slå på PMT og begynne å pumpe algene mates inn i rotatorier kulturen fartøyet. Ved hjelp av tidsuret trekk ved PMT, sett leveringshastighet av alger tilførselsblandingen, slik at ~ 1,6 ml av alger tilførselsblandingen levert per million rotatorier i kultur, per dag. Fordel foring i små porsjoner ved regelmessige intervaller i løpet av en 24 timers periode; hyppigere foringene, jo bedre.
- Kalibrer avgivelseshastigheten for pumpen ved manuelt å slå på PMT for en viss periode (f.eks, 1 min), og samle det alger som den pumper i løpet av dette intervallet inn i en målesylinder eller beger. For eksempel, hvis PMT doser på 5 ml av alger i 1 min, deretter dosefrekvensen vil være5 ml alger / min.
- Beregne nødvendig daglig fôring hastighet ved å multiplisere antall rotatorier stede, i millioner kroner, med 1,6 ml. For eksempel vil en rotatoriekulturen med en bestandsstørrelse på 100 millioner rotatorier krever ~ 160 ml fôr per dag (100 x 1,6 ml).
- Still PMT å dosere den totale daglige matekravet ved regelmessige intervaller i løpet av en 24 timers periode. For eksempel, kan levering av en total daglig mating mengde av 160 ml leveres i porsjoner en gang hver 3 time over en 24 timers periode ved anvendelse av en PMT-apparat med en doseringspumpe hastighet på 5 ml / min i 4 min, 8 ganger daglig (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 feedings = 160 ml).
- Tillate kulturen å vokse inntil den frembringer den ønskede befolkningen, vanligvis i 48 - 72 timer før høsting. På 24 timer etter oppstart, legger floss partikkelfiltre til kultur fartøyet og begynner normalt vedlikehold.
- Vedlikehold
MERK: Kulturen opererer på en kontinuerlig basis og krever routine vedlikehold som ideelt sett bør utføres på samme tid hver dag, i følgende rekkefølge.- Fyll FCV til 90% av tilgjengelig volum med rent, dechlorinated ferskvann, dosert med 10 g / l akvarium salter. Påse at vannet er godt blandet, og at alt av saltet er fullstendig oppløst. Still luftstrømmen inn i karet, slik at den opprettholder en "rullende koke". Mål saltholdighet med et refraktometer og sørge for at saltinnholdet er 10 g / l. Det er viktig å nå dette målet, og for ikke å overskride den.
- Smake på rotatorier i CV: Kontroller at kultur er godt blandet, og samle det 3 prøver av en 2 - 3 ml hver bruker en overføring pipette eller autopipettor, fra ulike deler av kulturen. Kombiner disse prøvene i et rør eller hetteglass av passende størrelse (f.eks 10 ml).
- Overføring 1 - 2 ml av den kombinerte prøven på en petriskål slik at den kan bli visualisert under et disseksjonsmikroskop. Sjekk kvaliteten av kulturen (svømming atferden tilrotatorier, tilstedeværelse av frittliggende egg, forurensende protozoer).
- Immobilisere de rotatorier i den gjenværende kombinerte prøven ved tilsetning av 100 ul 50% Lugols jodoppløsning til prøven. I løpet av sekunder etter tilsetting av Lugols, observere rotatorier å stoppe svømming. Nå får telle rotatorier.
MERK: Etanol, fortynnet blekemiddel eller eddik kan brukes i stedet for Lugols. Eddik (2 dråper / 10 ml) har fordelene av å være ufarlig, ikke miste styrke i lagring som blekemiddel og jod løsninger kan, og ikke gjør det hjuldyr kontrakten, så koronaen av flimmerhårene og "fot" forblir utvidet og Dyrene ser mer naturlig. - Sørg for at prøven er godt blandet (immobilisert rotatorier vil bosette seg raskt), deretter raskt ta en ~ 2 ml subsample i en plast-pipette og dispensere 1 ml inn i en Sedgewick-Rafter telle sklie (20 x 50 1 mm firkanter) (figur 2 ). Ved hjelp av en dissekere eller sammensatt mikroskop, telle intakte rotatorier og total antall egg knyttet til disse rotatorier (figur 2). Telle så mye av rasområdet som nødvendig å telle ~ 100 rotatorier. Beregne antall rotatorier per ml, og registrere dette i et regneark eller loggbok.
- Avling ~ 30% av volumet av rotatorier i CV: Fjern lufttilførselen og floss filter, langsomt åpne ventilen ved bunnen av CV og tillate vann å strømme inn i en plankton samler med en 53 um mesh sikt. Samle opp vann som strømmer ut av bunnen av oppsamleren etter filtrering i en bøtte eller avløp. Bruk en mild til moderat strømmen for å unngå å skade rotatorier. Ikke la rotatorier til tørk på skjermen.
- Konsekvenshensyn, er det tilrådelig å etablere FCV med et standard antall rotatorier hver dag. Derfor, basert på den kjente CV rotatorier tetthet og slaktevolum, juster FCV totale volum for å oppnå en ensartet endelig tetthet (f.eks., 1500 rotatorier / ml). Tilsett høstet rotifers til FCV: forsiktig overføre rotatorier fra samlingen skjermen ved hjelp av en vaskeflaske fylt med rent saltvann (10 - 15 g / l). Snu skjermen over FCV og vaske rotatorier inn i FCV med en svak strøm av saltvann. Start PMT å levere fôr (~ 1,57 ml per million rotatorier per dag) til FCV.
- Skrubb hele innsiden av CV med en ren, myk nylon børste eller skrubb pad.
- Foreta en ny blanding av 15 g / l vann ved tilsetning av den passende mengde av salt til en målt mengde av rent RO vann i en 5 liters bøtte for å erstatte volumet av tapt vann for å høste. Tilsett salt i vannet i bøtte og rør kraftig til det er helt oppløst, og deretter legge til CV.
- Ved hjelp av en høytrykksspyler i en vask, skyll floss filter før den er fri for rusk, og deretter returnere den til CV.
- Juster matehastigheter av alger levert til CV ved å endre varigheten av hver doserings hendelse, i henhold til den daglige telling av rotatorier / ml.Bruk beregningene er gitt i trinn 1.3.8, over å finne riktig mengde fôr som skal leveres.
- Omtrent 24 timer senere, gjenta prosessen. Start ved høsting av rotatorier igjen i FCV (som ikke var nødvendig for den foregående dag) på samme måte som beskrevet ovenfor (trinn 1.4.2 - 1.4.10). Konsentrer dem i 2 liter frisk, ren dechlorinated vann (5 g / l salt). Disse kan lagres ved 4 ° C som en backup tilførsel, eller brukes til å mate senere stadier av fisk, utover det som er beskrevet i denne protokollen.
MERK: Denne protokollen tillater opp til 2 - 3 dager med redusert vedlikehold kultur (med normal automatisk mating), fordi rotatorier i CV kan tolerere utelatelse av avlinger uten alvorlige konsekvenser.
2. polyculture
- Setup
- Samle sebrafisk embryo fra en gyte hendelsen ved å helle gytt embryo gjennom en te-sil og deretter forsiktig skylling med sterile fish vann (eller et annet ikke-forurenset kilde for hensiktsmessig kondisjone oppløsning, for eksempel, embryo medium, E3, etc.) fra en vaskeflaske inn i petriskåler.
- Inkuber embryoer ved 25 - 28 ° C i petriskåler ved en tetthet på 40 - 50 embryoer pr fatet i 5 dager.
- Begynn polyculture fase på dag 5 etter befruktning, eller når mer enn 90% av den skraverte larvene er aktivt svømmer opp på vannsøylen.
- Inoculation
- Legg 500 ml rotatoriekulturen direkte fra FCV til en 3,5 L barnehage tanken; inkludering av rotatoriekulturen vann gir alge fôr som ivaretar næringsinnholdet i de rotatorier under polyculture.
- Forsiktig helle larvene fra en petriskål inn i barnehagen tanken. Sikre at ingen larver forbli i fatet.
- Legg 500 ml rent, kondisjonert fisk vann fra et resirkuleringsanlegg eller dedikert vannkilde til tanken for å nå et endelig volum på 1 liter og en endelig salinity av 5 g / l.
MERK: Dette saltholdighet er kritisk fordi sebrafisk larver overlevelse vil bli negativt påvirket hvis saltholdighet er> 7 g / l og rotatorier overlevelse vil bli negativt påvirket hvis saltholdighet <2 g / L.
- Polyculture fase
MERK: polyculture fasen bør vare i opptil 4 dager etter vaksinasjon (totalt 5 dager, tilsvarende dager 5-9 etter befruktning).- Observer polyculture tank minst en gang per dag i denne perioden for å sikre at rotatorier og fisk er til stede og voksende. Pass på at rotatorier er synlig i hele vannsøylen. Pass på at de fishs er også synlig i vannsøylen, svømming blant rotatorier.
- Starte normal vannføring gjennom tanken. Plasser en skjerm eller ledeplate over dreneringsåpningen for å sikre at larvene blir tømt ut av tanken.
MERK: Ved slutten av denne fasen, vil fisken være store nok til å forbruke større byttedyr for eksempel Artemianauplii eller bearbeidet fôr elementer i størrelsesområdet 75-125 mikrometer.
MERK: rotatorier populasjonsdynamikk innenfor en representant polyculture tank ble målt ved prøvetaking / telle rotatorier fra tanken på samme måte som beskrevet i trinn 1.4.2 - 1.4.5. Dette ble gjort en gang per dag fra begynnelsen av polyculture fase før det var ferdig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den kontinuerlige rotatoriekulturen system som beskrives her er dynamisk, og det er vanlig for rotatorier tall å svinge i liten grad over tid hvis det er variasjoner i daglige fôring og slaktepriser. Befolkningen i de rotatorier i en av de aktive kulturer i oppdrettsanleggene ved Boston Children Hospital, vedlikeholdes som beskrevet ovenfor, ble overvåket i 30 dager (figur 3). Den midlere tetthet kulturen i løpet av denne perioden var 932 rotatorier / ml, med et maksimum på 1,330 hjuldyr / ml og et minimum av 510 rotatorier / ml. Dette representerer den typiske ytelsen til en rotatoriekulturen vedlikeholdes i samsvar med denne protokollen.
Dynamikken i rotatorier befolkningen i et polyculture tank med sebrafisk er vist i figur 4. En 3,5 L fisken tank ble inokulert med 500 ml av kulturen fra rotatorier FCV, 500 ml sterilisert fish vann, og 40 fem dager gamle villtype (Tübingen stamme) larver, for å demonstrere hvordan rotatorier og sebrafisk utføre i et typisk polyculture tank. Rotatorie befolkningen i polyculture tank toppet seg på den andre dagen med en tetthet på 747 rotatorier / ml (figur 4). Tettheten av rotatorier i polyculture tank redusert over 5 dagers polyculture periode til minimum 481 rotatorier / ml på dag 5. Men den gjennomsnittlige rotatorietetthet i hele perioden var 589.4 rotatorier / ml, og minimumsverdien på 481 rotatorier / ml er ~ 10 ganger større enn den rotatorietetthet på slutten av polyculture periode i tidligere publiserte arbeidet 12.
Sebrafisk vekst i løpet av fem dagers periode er vist i figur 5. Fisken viste jevn vekst hver dag, fra en gjennomsnittlig total lengde på 3,904 mm ± 0,063 SEM når de ble tilsatt til polyculture tank til en gjennomsnittlig total lengde på 5,423 ± 0,063 SEM påden siste dagen av polyculture fasen. Overlevelse var 95% (38/40).
Vann kvalitetsparametere ble målt daglig i den representative polyculture tanken, og er vist i tabell 1. Verdiene av disse parametrene er lik tidligere publiserte arbeidet 12, og representerer forhold som bidrar til vekst og overlevelse av både rotatorier og fisken i løpet av fem dagers periode av polykultur.
| Dag | Dag | Saltholdighet | TAN | NO 2 | NO 3 | pH | Alkalitet | Hardhet | Temperatur |
| (Faktisk) | (post-fertilisering) | g / l | mg / l | mg / l | mg / l | mg / L (CaCO 3) | mg / L (CaCO 3) | ° Celsius </ td> | |
| mandag | 5 | 5 | 2 | 0 | 0 | 8.4 | 120 | 425 | 23.2 |
| tirsdag | 6 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 180 | 425 | 23.3 |
| onsdag | 7 | 5 | 3 | 0 | 0 | 8.3 | 240 | 425 | 22.3 |
| torsdag | 8 | 6 | 3 | 0 | 0 | 8.4 | 240 | 425 | 22.8 |
| fredag | 9 | 7 | 3 | 0 | 0 | 7.9 | 240 | 425 | 22.2 |
Tabell 1. vannkvalitetsparametre ina Representant Sebrafisk polyculture Tank.
Figur 1. Rotatorie Kultur Setup Legend. Culture Vessel (CV), utmatingshodet Kultur Vessel (FCV), Air Supply (AS), Floss Partikkelfilter (FPF), Alger feed Blanding (AFM), Feed Reservoir (FR), Programmerbar Metering Timer (PMT). Heltrukne linjer representerer alger matings. Stiplede linjer representerer luft levering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Fylling av en Sedgewick-Rafter Counting Slide. Klikk her for å vise enstørre versjon av dette tallet.
. Figur 3. rotatorier populasjonsdynamikken i kultur over en 30 dagers periode Legend: Antallet telles rotatorier (kvinner + egg) per ml er på x-aksen. Antall dager i kultur er på y-aksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. rotatorier populasjonsdynamikk under en 5-dagers polyculture Legend. Antall telte rotatorier (kvinner + egg) per ml er på x-aksen. Antall dager i polyculture er på y-aksen. Vennligst klikk her til view en større versjon av dette tallet.
. Figur 5. Sebrafisk Vekst i løpet av en 5-dagers polyculture Legend: Verdier er gjennomsnitt total lengde i mm; feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vellykket gjennomføring av rotatorie polyculture metode for fôring tidlig larvesebrafisk krever effektive protokoller for to oppgaver: etablering og vedlikehold av en kontinuerlig rotatoriekulturen system for å mate fiskene, og dyrking av første-fôring sebrafisk larver sammen med rotatorier i samme tank.
Oppsettet for en kontinuerlig saltvanns rotatorier produksjonssystem for sebrafisk laboratorier først beskrevet av Lawrence og medforfattere 14 har blitt endret og forbedret på en rekke måter for å gjøre det både mer robust og universell i søknaden. Den nye protokollen inneholder forbedringer både i utstyr og metodikk.
Lagringssystemet for algene mateblandingen nå syssels klekking krukker som brukes i steinbit produksjonssystemer 15. Lagring av strømmen i disse rundbunnete krukker muliggjør grundig blanding av algene strømmen slik at den ikke stratifisere eller klumper seg og føre til tetteging av leverings linjer, et problem som ofte plaget den opprinnelige protokollen. Likeledes, ved bruk av en alt-i-ett programmerbar timer / doseringspumpe reduserer det totale antall komponenter, og forenkler avmålt tilførsel av strømmen til de rotatorier. Den gjør også dosering av fôr til rotatorier på timebasis over 24-timers periode, noe som er å foretrekke fremfor færre og større feedings fordi fôret er assimilert mer effektivt.
En metode for telling rotatorier som tillater finjustering av fôr levering til rotatoriekulturen har vært inkludert i denne protokollen. Fôring av rotatorier basert på en nøyaktig, sanntid vurdering av deres bestandsstørrelse sikrer jevn, høy-nivå produksjon. Et sekundært utmatingshodet Kultur Vessel har også blitt lagt til protokollen. En kontinuerlig kultursystem kan gi en daglig overkant av millioner av rotatorier utover det som er nødvendig for enda en stor barnehage drift, på grunn av variasjoner i barnehagen aktivitet. Dette utmatingshodet CuLTURE Vessel brukes til å holde rotatorier for daglig inokulering av polycultures, og de resterende rotatorier kan mates som et høykvalitets kosttilskudd til senere larver og tidlig juvenile stadier av fisk. Lavere saltinnhold (10 g / l) i FCV også pre-acclimates de rotatorier til forholdene i polykultursystemer tanker, slik at de opprettholder kraftig svømmeaktivitet ved overføringen.
Viktigere, til disse endringene i rotatoriedyrking protokollen ledelsen direkte forbedringer i polyculture tilnærming, særlig med hensyn til arbeidsinnsats. Den forrige metoden utgitt av Best og medforfattere involverte ikke bare en innledende inokulering av rotatorier på dag 5, men også daglige tilbygging av rotatorier til statisk polyculture fasen endte på dag 9 12. Mean rotatorier tettheter i denne perioden nådde 333 rotatorier / ml på dagen for vaksinasjon og endte under 50 rotatorier / ml ved avslutningen av polyculture fasen på dag 9 12. I kontrastOpprettholder dagens protokoll mye høyere tettheter hele, vanligvis starter på ~ 665 rotatorier / ml, og slutter med ~ 481 rotatorier / ml på dag 9.
Det er to faktorer som gjør at disse mye høyere rotatorier tettheter. 1) Den samlede robusthet rotatorier kulturen anvendes for inokulering er langt større. Videre er den reviderte trinnet med å inokulere polyculture med like volumer av alger / rotatorier ved 10 g / l saltinnhold og ~ 0 g / l saltholdighet fisk vann, resulterer i et mellomliggende saltholdighet på 5 g / l som opprettholdes gjennom polykultur. Starter med en større samlet volum av vann (1L) også er bedre til rette for rotatorie vekst og overlevelse i polykultursystemer tanker. I tidligere utgitt metoden, lavere start rotatorier tettheter i et mindre volum nødvendig daglige tilskudd av rotatorier å fylle tap ved avgang (formodentlig på grunn av dårlig vannkvalitet) og forbruk ved å utvikle fiskelarver. Resultatene av disse justeringer av protokollen dramatmatisk redusere arbeidsinnsats (en fôring over 4 dager sammenlignet med 4 feedings i 4 dager med den forrige metoden). Larvevekst og overlevelse ytelse over den innledende 5 dagers periode polyculture er sammenlignbar med den tidligere 12 publisert.
Produktiviteten av rotatorier kulturer nødvendigvis er begrenset av mateinngang. Rotatorier tettheter på 2000 - 3000 / ml kan oppnås med disse metoder bare ved å øke matings. Når rotatorier avkastning per enhet fôr er kjent, kan matehastigheten justeres for å matche rotatorieproduksjon til anslåtte behov. I helger og ferier, kan fôring reduseres og avlinger utelatt for en dag eller to uten å skade rotatorier, selv om deres produktive potensialet vil være suboptimal til normale daglige fôring og høste rutinegjenopptas.
Når det er en uforutsett behov for flere rotatorier enn vanlig, kan en større del av befolkningen høstes uten å skade Culratur, men avhengig av størrelsen på innhøstingen kulturen kan kreve en dag eller mer for å gjenvinne sin normale tetthet. Hvis rotatorie etterspørselen vil bli redusert for mer enn en dag eller to, er produksjonen beste reduseres ved å redusere matings, snarere enn å redusere avlingen. En høst hastighet på minst 25% / dag opprettholder en yngre rotatorier aldersprofil slik at rotatorier er mer frodig og fruktbar, forbedre sine prestasjoner i polykultursystemer tanker.
Denne protokollen er lett tilpasses mindre skala for mindre anlegg sebrafisk. For eksempel kan en 15 L kultur, som enkelt kan settes opp i en standard 5 US gallon (20 liter) bøtte med håndforing to ganger per dag, kan lett å oppnå en densitet på 1000 rotatorier / ml. Anvendelse av en matepumpe muliggjør tettheter på 2000-3000 / ml. En enkelt bøtte høstet på 30% / dag kan derfor gi 5-15 millioner rotatorier / dag, nok til å starte 10 - 30 polycultures. To bøtter kan brukes på samme CV + FCV-protokollen som beskrevet enBove. En alge + ammoniakk kontrolleren + pH buffer pre-mix feed er tilgjengelig (se tabell over spesifikke reagenser / utstyr) som er praktisk for småskala applikasjoner. Den har tilstrekkelig viskositet at algecellene ikke felles ut raskt, og slik at det ikke krever kontinuerlig blanding i tilførselsreservoaret.
Hvis rotatoriekulturen produktivitet synker, eller en uvanlig opphopning av døde rotatorier er funnet i kultur, alle vannkvalitetsparametre (temperatur, saltholdighet, pH, NH3 konsentrasjon) bør sjekkes. Brachionus plicatilis bærer vanligvis sine egg før de klekkes, og tilstedeværelsen av mange ufestede egg (som vanligvis ikke klekkes) i kulturen er et tegn på stress, som oftest på grunn av akkumulert ammoniakk.
Hvis vannet rotatoriekulturen er en mer intens grønn enn vanlig, så enten matehastigheten er for høy eller rotatorier ikke spise mat på deres vanlige hastighet. Vanligvis er dette cabenyttes av enten en stressfaktor eller kulturen er blitt overharvested uten å justere matehastigheten i samsvar med den reduserte befolkningen. I tette kulturer er det normalt for en brun farge for å hope seg opp i vannet som alge pigmenter metaboliseres av rotatorier.
Bruk av saltvann rotatorier i startfôringsfasen har vært i omfattende bruk over sebrafisk forskningsmiljøet siden metoden først ble utgitt i 2010 12. De modifikasjoner på polyculture oppdragelse metoden som er skissert i denne protokollen vil tillate et enda større antall laboratorier for å vedta denne tilnærmingen, uavhengig av skalaen. Disse fremskritt er betimelig; utviklingen i genet knockout teknologi (f.eks., CRISPR, Talens, etc.) for sebrafisk vil kreve strømlinjeformet og effektiv oppdretts protokoller for å vokse tusenvis av nye stammer av genmodifisert fisk for bruk i ulike felt av vitenskap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
EC Henry er ansatt av Reed Mariculture, Inc., et selskap som leverer rotatorier, alger konsentrater og andre forsyninger til akvakultur og fiske hobby markeder.
Acknowledgments
Omsorg og behandling av fisk generert for representative resultater er beskrevet i denne protokollen ble utført i full overensstemmelse med retningslinjene fastsatt av Institutional Animal Care og bruk komité ved Boston Children Hospital, protokoll # 14-05-2673R.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rotifer Culture Infrastructure | |||
| 100 L Culture Vessel | Aquaneering | Custom | Polycarbonate culture vessel, conical bottomed, with drain valve |
| 5 Gallon Culture Bucket Kit | Reed Mariculture | CCS Starter Kit | Small volume culture vessel for small facilities |
| Rigid Clear Tubing 1/2" O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery |
| Mesh tube | Pentair Aquatic Ecosystems | RT444X | Mesh tube support for floss filter |
| Rotifer Floss | Reed Mariculture | Rotifer floss 12” x 42” | Particulate waste trap |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 5 GPD | Grainger | 38M003 | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Peristaltic Metering Timer Pump, 1-100 mL/hr (for smaller-scale culture) | Coral Vue | SKU: IC-LQD-DSR | Metering pump with timer for dosing feed to rotifers |
| Silicone Tubing | Cole Parmer | Tubing for algae delivery to rotifer vessel | |
| Rigid Clear Tubing " O.D.,36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for air delivery to algae paste |
| Rigid Clear Tubing O.D., 36” | Pentair Aquatic Ecosystems | 16025 | Rigid clear tubing for algae delivery |
| Rotifers | |||
| Live Rotifers Brachionus plicatilis Type L | Reed Mariculture | Type L 5 million | Rotifer stock culture for system startup |
| Rotifer Feed | |||
| Sodium hydroxymethylsulfonate | Reed Mariculture | ClorAm-X® 1lb tub | Ammonia reducer for algae feed mix |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S25533B | pH buffer for algae feed mix |
| Microalgae concentrate | Reed Mariculture | Rotigrow Plus® 1 liter bag | Nutritionally optimized rotifer feed |
| RG Complete | Reed Mariculture | RG Complete 6 oz bottle | All in one microalgae based feed for small scale cultures |
| Water Preparation | |||
| Reef Crystals Reef Salt | That Fish Place | 198210 | Salt for making culture water (NOTE: this item is an example only; any contaminant free salt formulations may be used). |
| Refractometer | Pentair Aquatic Ecosystems | SR6 | measuring salinity |
| Rotifer Culture Equipment | |||
| Plankton Collectors 12" Dia, 53 microns | Pentair Aquatic Ecosystems | BBPC20 | Mesh screen for collecting rotifers |
| Scrub Pads | Pentair Aquatic Ecosystems | SCR-58 | Scrub pad for cleaning inside of culturing vessels |
| Scrub Brush | |||
| Bucket | Grainger Supply | 43Y530 | Graduated bucket for mixing culture water |
| Hatching Jar | Pentair Aquatic Ecosystems | J30 | Storage of algae feed mix |
| Lugol’s Solution, Dilute | Fisher Scientific | S99481 | Agent used to immobilize live rotifers for counting |
| Sedgewick-Rafter plankton counting slide with grid | Pentair Aquatic Eco-Systems | M415 | Counting rotifers |
| Miscelleneous | |||
| Tea Strainer | Kitchenworks | 971972 | Used for collecting zebrafish embryos after spawning |
References
- Ribas, L., Piferrer, F. The zebrafish (Danio rerio) as a model organism, with emphasis on applications for finfish aquaculture research. Reviews in Aquaculture. 6, 209-240 (2014).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nature reviews. Genetics. 11, 710-722 (2010).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in genetics TIG. 29, 611-620 (2013).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! modeling human disease in zebrafish. Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Selderslaghs, I. W. T., Blust, R., Witters, H. E. Feasibility study of the zebrafish assay as an alternative method to screen for developmental toxicity and embryotoxicity using a training set of 27 compounds. Reproductive Toxicology. 33 (2), 142-154 (2012).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): A review. Aquaculture. 269, 1-20 (2007).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish (Laboratory Animal Pocket Reference). , CRC Press. (2010).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish, A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish. , University of Oregon Press. (2007).
- Carvalho, P., Arau, L. Rearing zebrafish (Danio rerio) larvae without live food: evaluation of a commercial, a practical and a purified starter diet on larval performance. Aquaculture Research. 37, 1107-1111 (2006).
- Spence, R., Gerlach, G., Lawrence, C., Smith, C. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio. Biol Rev Camb Philos Soc. 83 (1), 13-34 (2008).
- Best, J., Adatto, I., Cockington, J., James, A., Lawrence, C. A novel method for rearing first-feeding larval zebrafish: polyculture with Type L saltwater rotifers (Brachionus plicatilis). Zebrafish. 7 (3), 289-295 (2010).
- Lawrence, C. Advances in zebrafish husbandry and management. Methods in Cell Biology. 104, 429-451 (2011).
- Lawrence, C., Sanders, E., Henry, E. Methods for culturing saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) for rearing larval zebrafish. Zebrafish. 9, 140-146 (2012).
- Biology and Culture of Channel Catfish. Tucker, C. S., Hargreaves, J. A. 34, 634-657 (2004).
